Summary
Vi presenterar ett protokoll för snabb karakterisering av Biomolekylär vikning och bindande interaktioner med termolabila ligander med differential scanning calorimetry.
Abstract
Differential scanning calorimetry (DSC) är en kraftfull teknik för att kvantifiera termodynamiska parametrar som styr Biomolekylär vikning och bindande interaktioner. Denna information är avgörande för utformningen av nya läkemedelssubstanser. Men är många farmaceutiskt relevanta ligander kemiskt instabila vid de höga temperaturer som används i DSC analyser. Mäta bindande interaktion är således en utmaning eftersom koncentrationerna av ligander och termiskt-konverterade produkter förändras ständigt inom cellen kalorimetern. Här presenterar vi ett protokoll som använder termolabila ligander och DSC för att snabbt få termodynamiska och kinetiska information på vikning, bindande och ligand omvandlingsprocesser. Vi har tillämpat vår metod att den DNA-aptamer MN4 som binder till termolabila ligand kokain. Fullständig uppsättning fällbara och bindande parametrar erhålls från ett par av DSC experiment och med hjälp av en ny global montering analys som står för termolabila ligand konvertering. Vi visar dessutom att konstanten för termolabila ligand konvertering kan erhållas med bara en kompletterande DSC datamängd. Riktlinjer för att identifiera och analysera data från flera mer komplicerade scenarier presenteras, inklusive irreversibel aggregering av biomolecule, långsam vikning, långsam bindande, och snabb utarmning av termolabila liganden.
Introduction
Differential scanning calorimetry (DSC) är en kraftfull metod för quantitating Biomolekylär bindande och fällbara interaktioner1,2,3. Styrkan hos DSC inkluderar dess förmåga att belysa bindande och fällbara mekanismer, och att ge den motsvarande termodynamiska parametrar2,3. Dessutom DSC kan utföras i lösning nära-fysiologiska villkor och kräver inte märkning av biomolecule eller ligand, t.ex., med fluorophores, spin-etiketter eller nukleära isotoper4. Instrumentet skannar i temperatur, mäta mängden värme som krävs för att denaturera biomolecule i närvaro och frånvaro av liganden. De resulterande thermograms används för att extrahera de termodynamiska parametrar som styr liganden bindande och fällbara processer. Uppgifter från DSC eller andra termodynamiska tekniker är avgörande för att vägleda utformningen av droger inriktning biomolekyler1,5,6,7,8. Men upprepad skanning för höga temperaturer (~ 60-100 ° C) kan vara problematiskt. Exempelvis många farmaceutiskt viktiga föreningar genomgå ombildning eller sönderfall vid fortsatt exponering för höga temperaturer9,10,11, dvs, de är termolabila. Undersökningen av bindande interaktioner av DSC normalt kräver flera framåt och bakåt genomsökningar för att kontrollera TERMOGRAM för termodynamiska analyser12reproducerbarhet. Termiska konvertering av en inledande ligand till en sekundär form med förändrad bindande egenskaper leder till uttalad skillnader i form och placering av successiva thermograms, eftersom koncentrationen av inledande liganden minskar med varje skanning medan den samlas termisk konvertering produkter. Dessa datamängder är inte mottaglig för traditionella analyser.
Vi har nyligen utvecklat en global passande metod för termolabila ligand DSC datamängder som ger en fullständig uppsättning termodynamiska parametrar styr Biomolekylär vikningen och bindande interaktioner från ett enda ligand-bundna experiment refereras till den erforderliga TERMOGRAM för gratis biomolecule4. Analysen minskar experimentell tid och provet krävs av ~ 10-faldigt jämfört med DSC standardmetoder. Vi har stått för ligand termisk konvertering av förutsatt att detta sker under hög temperatur-delen av varje skanning där TERMOGRAM inte beror på ligand koncentration. Ligand koncentrationen är därför en konstant inom del av den TERMOGRAM som används för att extrahera termodynamiska parametrar. Vi har dessutom visat hur konstanten för ligand termisk konvertering kan erhållas genom att utföra en kompletterande experiment med hög temperatur Jämviktstiden längre. För system där ligand termisk konvertering är mindre temperatur-anhörigen (dvsförekommer märkbart vid alla temperaturer), analysen kan modifieras för att inkludera variabel ligand koncentrationer. Här visar vi proceduren för de DNA aptamer MN4 i närvaro av termolabila ligand kokain, som snabbt konverterar till benzoylecgonine vid höga temperaturer (> 60 ° C). Kinin används som en negativ kontroll för ligand thermolability eftersom det inte genomgår omvandling vid dessa experimentella temperaturer och binder också till MN4. Vi beskriver förvärvet av termolabila ligand DSC datamängder och deras analys ger termodynamiska och kinetiska parametrar av vikning, bindande och ligand omvandlingsprocesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. provberedning
- Rena de önska biomolecule13.
Obs: Detta protokoll använder köpt kokain-bindande DNA aptamer MN4 efter utbyte av mot 2 M NaCl tre gånger följt av tre rundor av avjoniserat vatten med en centrifugal filter med 3 kDa molekylvikt cut-off membran. - Syntetisera och rena, eller köpa den önska termolabila ligand13.
Obs: MN4 binder termolabila ligand kokain. MN4 binder också kinin, som används som en negativ kontroll för ligand thermolability vid dessa experimentella temperaturer. - Förbereda buffertar för dialys av den renade biomolecule och upplösning av ligander (20 mM natriumfosfat och 140 mM NaCl buffert, pH 7,4, för MN4 och de ligander som används här).
- Dialyze biomolecule mot minst 2 L av buffert med dialys slangar med 0,5 - 1,0 kDa cut-off.
- Filtrera det slutliga buffert (kallad arbetande buffert) genom ett 0,2 µm filter som har varit grundligt jämviktas med buffert.
- Väg in önskad massorna av liganderna och lös upp dem i filtrerade arbetande buffert. Om önskad ligand koncentrationerna kräver massorna som är för små att noggrant väga, göra en koncentrerad ligand stamlösning (10 x till exempel).
Obs: Det är avgörande att alla DSC experiment utnyttja samma arbeta bufferten för provet och ligand, dvsaldrig utföra ett experiment där liganden är upplöst i en annan sats av arbetande buffert än biomolecule eftersom detta kommer att orsaka buffert mismatch artefakter i data. - Filtrera biomolecule stamlösning genom ett 0,2 µm filter som har varit grundligt jämviktas med arbetande buffert.
- Fastställa biomolecule koncentrationen av absorbansen mätningar (260 nm för nucleic syror som MN4 och 280 nm för proteiner).
- Lagra beredda biomolecule och liganden i kylskåp 4 ° C (lämplig för MN4 och de ligander som används här), eller vid -20 eller -80 ° C om den biomolecule och ligander tål frysning och långsiktig lagring krävs. Degas buffert, biomolecule och ligand lösningarna i en bordsskiva degasser (se Tabell för material) före lastning i DSC.
Obs: Avgasning hjälper till att förhindra bubbla bildandet i DSC vid högre temperaturer. Bubblor orsaka signal artefakter som skymmer DSC peak former och baslinjer.
2. DSC förberedelse
- Skruva loss trycket handtaget från DSC (se Tabell för material).
- Kör silicon slangar från arbetande bufferten och bifoga det till referens kapillären främre fläns (metall öppning).
- Skapa en bro mellan referens och prov kapillärerna genom att ansluta bakre referens flänsen till främre prov flänsen.
- Fäst en bit av silicon slangar till bakre prov flänsen som körs till en avfall kolv med en vakuum linje fäst.
- Slå på vakuum linjen för att spola DSC med 200 mL arbetande buffert.
- Ladda referens kapillären av DSC med arbetande buffert. Fäst ungefär 3-5 cm sektioner av silicon slangar referens kapillär flänsarna.
- Sätt en 1 mL pipettspetsen i bakre flänsens silicon slangar. Rita 0,8 mL arbetande buffert med en pipett och infoga pipettspetsen med buffert i främre referens flänsens silicon slangar.
- Tryck försiktigt pipett kolven ned till passera arbetande bufferten genom främre kisel slangen till referens kapillären och upp till de bakre flänsen bifogade pipettspetsen. Tryck ned pipetten kolven tills bufferten arbetsnivå når precis ovanför främre silicon slangar och sedan släpp pipett kolven tills bufferten arbetsnivå når precis ovanför den bakre silicon slangen.
- Upprepa passerar arbetande bufferten och tillbaka för att rensa volymen i referens kapillären bubblor.
Obs: Vanligtvis är 10 passerar av lösningen och tillbaka är tillräckligt för att rensa bort alla bubblor.
- Upprepa passerar arbetande bufferten och tillbaka för att rensa volymen i referens kapillären bubblor.
- Cap bakre pipettspetsen med tummen och dra försiktigt på bakre pipettspetsen och främre pipetten att ta bort dem från referens flänsarna med silicon slangar anslutna.
- Ladda urval kapillären med arbetande buffert som i steg 2,6-2,9. Placera ett svart plastlock på bakre hänvisningen och prova flänsar, lämnar främre flänsarna avtäckt.
- Sätt tryck handtaget.
- Öppna programvaran DSC (se Tabell av material) och trycksätta instrumentet genom att klicka på röda uppåtpilen överst i gränssnittet när power läsningen har stabiliserad; DSC kraften anges i en låda på toppen rätt av gränssnittet tillsammans med instrumentet temperatur och oljetryck läsning.
Obs: Monitor kraften läsning som DSC trycksätter. Förändringar i kraft mer än ~ 10 µW ange bubbla bildandet i kapillärerna, vilket kan orsaka artefakter i data. Lösningar tas fram och avgasas ytterligare innan du fortsätter. - Temperera DSC med arbetande buffert genom att utföra en vanlig och omvänd sökning. I fliken ”experimentell metod” på vänster sida av skärmen, se till att den ”skanning” alternativet att köra DSC i temperatur sökningsläge.
Obs: Experimentella parametrar är temperaturen skanning utbud, samplingshastighet, låg och hög temperatur Jämviktstiden tid och antal skanningar.- Klicka på knappen för ”uppvärmning” i den ”temperatur parametrar” infällt under fliken ”experimentell metod”. Ange 1 till 100 ° C för nedre och övre experimentella temperaturer, 1 ° C/min för sökhastighet och 60 s för perioden Jämviktstiden.
- Klicka på knappen ”Lägg till serien” under inmatningsfältet för perioden Jämviktstiden. Anger 2 i fältet ”steg för att lägga till” i popup-fönstret (för en värme och en kylande scan) och markera rutan ”alternativa värme/kyla”. Klicka på ”OK”; de extra genomsökningar visas i den nedre delen av gränssnittet. Kontrollera att parametrarna för varje skanning är som önskat.
- Starta experimentet genom att klicka på den gröna ”play”-knappen överst i gränssnittet. Navigera till önskad mapp och ange ett filnamn för att spara experimentet i popup-fönstret. Visa experiment förloppet genom att klicka på fliken ”Data” till höger om fliken ”experimentera metod”.
3. samla termolabila Ligand DSC datamängder
Obs: Det minimala förfarandet består av fem experiment: buffert referens experiment med och utan ligand (används för baslinjen subtraktion, se diskussion), prova experiment med den gratis biomolecule, den ligand-bundna biomolecule, och den ligand-bundna biomolecule med hög temperatur Jämviktstiden längre.
- Köra referens experiment för baslinjen subtraktion av exempeldata. Ladda DSC med arbetande buffert i båda kapillärer och samla flera vanliga och omvända sökningar över ett lämpligt temperaturområde på 1 ° C min-1 med en övre (hög temperatur) Jämviktstiden tid 120 s.
- Ta bort föregående buffert Jämviktstiden skanningar från den nedre delen av gränssnittet genom att belysa varje individuellt och klicka på det röda krysset till mitten höger i gränssnittet. Lägga till den nya skanning genom att klicka på knappen ”Lägg till serien”, ange 20 i fältet för ”steg att lägga till” och markera rutan ”alternativa värme/kyla”. Klicka på OK och köra experimentet genom att klicka på gröna uppspelningsknappen som ovan.
- Upprepa steg 3,1 - 3.1.1 med arbetande buffert innehållande önskad koncentration av liganden i båda kapillärerna att erhålla hänvisningen experiment för liganden (samla in två separata experiment med 120 s och 600 s hög temperatur Jämviktstiden gånger respektive att användas för att förvärva konstanten för termolabila ligand konvertering).
Obs: Sökhastighet används här garanterar att biomolecule i efterföljande experiment vid termisk jämvikt i vanliga och omvända skanningar (se diskussion). Skanna priser < 0,1-0,2 ° C min-1 leda till bullriga thermograms och är inte tillämpliga i DSC experiment. Temperaturen bör sträcka sig från långt under smälttemperatur av den gratis biomolecule till väl över smälttemperaturen av ligand-mättade biomolecule (~ 20-80 ° C för MN4). Verifiera reproducerbarhet av skanningar (för exempel, 10 framåt och 10 omvänd skanningar för 20 totala är tillräcklig). - Om du använder flera ligander (såsom kokain och kinin), spola DSC med 200 mL arbetande buffert (upprepa från steg 2.5) mellan körningar för att ta bort ligand från kapillärerna och förhindra korskontaminering.
Obs: Det är bra att utföra en replikera experimentet på den gratis biomolecule efter en ligand-bundna körning för att kontrollera om tidigare liganden adsorberas starkt till kapillärväggarna och tas inte tillräckligt med buffert spolning. Om thermograms för den gratis biomolecule verkar flyttas till en större omfattning och högre denaturering temperatur efter den ligand-bunden experimentera, är det troligt att tidigare liganden är fortfarande närvarande i kalorimetern efter spolning. Ta bort den adsorberade liganden genom ruvning kapillärerna med 20% Contrad-70 för 1 h vid 60 ° C med plast lock och tryck handtaget av. I DSC-programvaran ändra experimentella läget till ”isotermiska” under fliken experimentell metod välja 3 600 s för varaktighet och 60 ° C för isotermiska temperaturen, med noll anges för Jämviktstiden gången. Klicka på ”Lägg till experimentell metod”. Isotermiska experimentet visas i den nedre delen av skärmen. Efter avslutad, spola instrumentet med 2 L avjoniserat vatten och upprepa från steg 2.5.
- Kör exempelexperiment med samma DSC lastning förfarande och experimentella parametrar som hänvisningen File. För gratis biomolecule datauppsättningen, säkerställa att referens kapillären innehåller fungerande bufferten medan prov kapillären innehåller den gratis biomolecule på önskad koncentration i arbetande buffert.
- För ligand-bundna experiment, säkerställa att liganden är i fungerande bufferten i referens kapillären, och den biomolecule plus ligand är arbetande buffert i provet kapillären. Spola systemet mellan tillägg av olika ligander som i steg 2.5.
- Utföra en ytterligare experiment med biomolecule bunden till termolabila liganden där hög temperatur Jämviktstiden perioden ökas till 600 s och alla andra experimentella parametrar är samma som steg 3.2.1.
Obs: Varaktigheten av hög temperatur Jämviktstiden perioden för andra ligand-bundna experimentet är helt enkelt valt att säkerställa att liganden är snabbare utarmat än kort Jämviktstiden tid experimentet. Om ligand-bundna toppar från första experimentera decay långsamt som en funktion av scan nummer (t.ex.skillnader i successiva peak maxima är ≤ 0,5 ° C), uppskatta 10 - 20 gånger ökar i hög temperatur Jämviktstiden perioden för att adekvat bryter liganden under andra experimentet. Exakt beräkning av konstanten för ligand konvertering kräver att det andra experimentet har snabbare utarmning av liganden i förhållande till först. Ligand halterna utvinns ur global analys av de två experiment kommer att vara liknande och därför oanvändbart om ligand utarmning inte är tillräckligt snabbare i andra försöket.
4. databearbetning
- Öppna DSC experimentera filer i DSC data analys programvara (se Tabell av material) och exportera råstyrka data som kalkylblad.
- Importera de kalkylblad som innehåller raw power data in programvaran för data montering.
- Originalplan subtrahera exempeldata genom att subtrahera den buffert power data från den fria och ligand-bundna biomolecule experiment.
Obs: För termolabila ligand experimentet minskar koncentrationen av inledande ligand med varje skanning. Därför är det perfekt att subtrahera den buffert scan 1 från provet scan 1 och så vidare. Vi har funnit att buffert skanningar med kokain inte förändras nämnvärt som ligand omvandlingen fortsätter och därför en enda termolabila ligand buffert scan kan användas för att subtrahera alla termolabila ligand-bundna data. - Konvertera baseline-subtraheras exempeldata makt till värmekapacitet.
Konverteringen kräver den biomolecule partiell specifika volym, vilket kan vara uppskattningsvis14,15,16. Ekvationen för konvertering makt till värmekapacitet har tidigare beskrivits17.
5. dataanalys
- Globalt passa kort Jämviktstiden tid termolabila ligand-bundna värmekapacitet datamängden med en enda uppsättning baslinjen, ligand koncentration, vikbar och ligand bindande parametrar som beskrivs tidigare4.
- Upprepa den globala passar för långa Jämviktstiden tid datamängden för att beräkna konstanten för termolabila ligand konvertering som beskrivs tidigare4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa uppgifter för termolabila ligand DSC visas i figur 1. Position och termolabila ligand-bundna toppens höjd skiftar successivt mot det av de obundna biomolecule när termolabila liganden är utarmat med varje scan (figur 1a). Gratis denaturering profilen används som referens för slutpunkten av termolabila ligand konvertering (figur 1b). Data för MN4 bunden till kinin visas som en negativ kontroll för termolabila ligand konvertering (figur 1b). Slutliga termolabila ligand skanningar har något högre övergång mittpunkter och peak höjder i förhållande till de obundna MN4, som visar produktens omvandlingen termolabila ligand (benzoylecgonine) har en svag affinitet för MN4. De termodynamiska parametrar som följd av global analys av datamängderna i figur 1 anges i tabell 1. Fällbara parametrarna för MN4 i närvaro av kokain eller kinin är identiska inom fel, som förväntat eftersom utspädd små molekyler inte förväntas stör fällbara termodynamik vid den gratis biomolecule. Bindningsparametrarna är bra överens med de från isotermiska titrering calorimetry (ITC)18 och avslöjar att MN4's preferens för kinin över kokain drivs av en mer gynnsam bindande entalpi. I figur 2ger öka hög temperatur Jämviktstiden perioden mer uttalad minskningar av termolabila ligand koncentrationen med varje skanning i förhållande till kort Jämviktstiden perioden datamängden. Med optimerad globala fit koncentration parametrarna från de två datamängderna, beräknas konstanten för ligand konvertering vid hög Jämviktstiden temperatur från lutningen på linjen i den figur 2 infällt.
Figur 1. Termolabila ligand DSC. (en) Thermograms av MN4 (83 µM) bunden till kokain (startkoncentration 778 µM). Första och sista skanningar av MN4 i närvaro av liganden visas som mörka röda och blå cirklar medan motsvarande passar visas som färgade linjer. (b), Thermograms av gratis MN4 (83 µM, svarta cirklar) och på varandra följande skanningar bunden till kinin (880 µM, färgade cirklar). Passar till den gratis och kinin-bundna datamängder visas som svarta och färgade linjerna, respektive. Reproducerad från referens4 med tillstånd från den Royal Society of Chemistry. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Mäta konstanten för termolabila Ligand konvertering. (en) uppsättningar av thermograms för MN4 bunden till kokain med kort (120 s, mörkröd) och lång (600 s, mörkblå) Jämviktstiden gånger vid 80 ° C, respektive. (b) koncentrationer av kokain utvinns ur global analys av datamängderna i (en) som en funktion av scan nummer. Experimentell punkter och exponentiell passar visas som färgade cirklar och linjer respektive. Infällt visar en linjär passform till tidigare beskrivna kompletterande Eq. 19 från Harkness et al. med optimerad globala fit kokain koncentrationerna för två datamängder4. Konstanten för ligand termisk konvertering vid 80 ° C beräknas som lutningen på linjen. Felet för konstanten för termolabila ligand konvertering ges som ± två standardavvikelser. Reproducerad från referens4 med tillstånd från den Royal Society of Chemistry. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Fit parametrar | Kokain har lagt till det | Kinin som lagt till |
| ∆HUF | 271.3±1.8 | 272.5±4.0 |
| ∆SUF | 824.4±5.1 | 827.9±10.9 |
| en∆GUF | 21.6±0.2 | 21.6±0.9 |
| en∆HB1F | -75.2±1.6 | -101.0±4.0 |
| en∆SB1F | -154.2±5.0 | -213.7±12.0 |
| ∆CpB1F | -1.5±0.1 | -1.2±0.1 |
| en∆GB1F | -28.5±0.2 | -36.2±0.7 |
| en∆HB2F | -33.7±1.8 | - |
| en∆SB2F | -49.9±5.2 | - |
| ∆CpB2F | -2.2±0.1 | - |
| en∆GB2F | -18.6±0.3 | - |
Tabell 1. Termodynamiska parametrar ur Global analys av MN4 DSC datamängder använder kokain och kinin ligander. Parametrar beräknades vid 30 ° C. B1F hänvisar till kokain - eller kinin-bound vikta stater och B2F hänvisar till benzoylecgonine-bundna vikta staten. ΔH och ΔG uttrycks i kJ/mol, ΔS uttrycks i J/mol/K och ΔCp uttrycks i kJ/mol/K. fel beräknades enligt varians/co-variance metoden19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modifieringar och felsökning
Detaljerna i den globala passande analysen används i figur 1 och figur 2 har tidigare beskrivits4. Här, beskriver vi praktiska aspekter att utföra och analysera DSC bindande experiment med termolabila ligander. Observera att en DSC baslinje erhålls för termolabila liganden ensam subtraheras från liganden + biomolecule datamängd, effektivt avbryta ut värmen släppt eller absorberas av termiska omvandlingen processen själv. Standard termolabila ligand globala passande analysen (figur 1 och figur 2) förutsätter att systemet är vid termodynamisk jämvikt i hela temperatur genomsökningen och att termolabila ligand koncentrationen är konstant under varje TERMOGRAM, minskar uteslutande under hög temperatur Jämviktstiden. Vi har tidigare visat att detta antagande gäller kokain-bundna MN4 och förväntas hålla för termolabila ligand/biomolecule system med kinetik liknar dessa.
Det finns dock vissa situationer där systemet inte kan antas vara vid termodynamisk jämvikt eller koncentrationen av liganden inte anses vara konstant under en enda skanning. Dessa inkluderar (i) när liganden konverterar termiskt snabbt i förhållande till temperatur samplingshastighet, ii) när biomolecule genomgår irreversibel aggregering vid hög temperatur, (iii) när de fällbara/utspelas priserna är långsam jämfört med samplingshastighet, och iv). När ligand association/dissociation är långsam jämfört med sökhastighet. I dessa fall systemet är under kinetic i stället för termodynamisk kontroll och den analys som anges i referens 4 kan inte strikt tillämpas. Data kan simuleras kvantitativt efter figur 3, som beskrivs i den kompletterande fil 1. I princip kunde dessa kinetik-baserade beräkningar användas för att passa icke-jämvikt DSC data, potentiellt ger både kinetiska och termodynamiska data, men denna analys är utanför ramen för denna uppsats. Istället presenterar vi några representativa simulerade DSC-uppgifter för att hjälpa läsaren att identifiera icke-jämvikt situationer.
Ett perfekt exempel på termodynamisk kontroll visas i figur 4ab. DSC thermograms av den gratis biomolecule är överlagringsbara (figur 4a) och skanningar med termolabila liganden visar inte hysteres, sådan att smälttemperaturen observerats på upp-scan matchar den tidigare down-scan (fällbara temperatur Figur 4b). När termolabila liganden omvandlar snabbt jämfört med samplingshastighet, stora snedvridningar visas i TERMOGRAM och termodynamiska ekvationerna ska inte redogöra för topp form, som visas i figur 4 c, d. Detta kan lindras något genom att öka sökhastighet. När biomolecule aggregaten på ett sätt som temperatur-anhörigen, DSC spår för gratis biomolecule visar successiva minskar i storlek (figur 4e), medan tillägg av producerar termolabila liganden ett mönster av minskande termiska upshifts liknar det ideala fallet, men skalade av minskande biomolecule koncentrationen (figur 4f). När vikning/utspelas kinetik är långsam jämfört med samplingshastighet, hysteres framgår i DSC spår av de gratis biomolecule sådan att uppenbara denaturering temperaturen på up-Skanna är högre än den skenbara utvinningsarbete temperaturen på den ned-scan ( Figur 4 g). Tillägg av en termolabila ligand leder till det välbekanta mönstret fallande termisk upshifts, särskilt för upp-skanningar (figur 4 h). Slutligen, system med snabba vikning och långsam bindande producera hysteresis-fri DSC thermograms för den gratis biomolecule (figur 4i), men data med termolabila liganden Visa hysteres var uppenbart smälttemperatur för den upp-scan högre än den skenbara fällbara temperaturen för den tidigare down-scan (figur 4j). Det typiska mönstret av minskande termiska upshifts är dock tydligt i både upp-skanningar och down-skanningar. Icke-jämvikt beteende vid långsam vikning eller bindande kinetik kan vara lindras något genom att minska samplingshastighet, även om detta riskerar att icke försumbar ligand termisk konvertering inträffar under hela sökningen. I praktiken kan scan rate och övre Jämviktstiden temperaturen justeras manuellt för att hämta data som liknar figur 4a, b.
Begränsningar av tekniken
Vår termodynamiska analys för DSC bindande experiment med termolabila ligander kräver att vika och bindande processer är relativt snabb och att termolabila ligand omvandlingen är långsam före hög temperatur portion av varje skanning. När tillståndet vikta eller bundna livstid är större än ca 30 s (koff, ku < 0,03 s-1), hysteresis blir märkbara i genomsökningar utförs vid 1 ° C min-1. Dessutom, när konstanten ligand konvertering hastighet är över ungefärligt kc = 10-4 s-1 före denaturering övergången, kan det finnas betydande utarmning av liganden under loppet av en enda skanning. Tillämpningen av vår analys är också olämpligt när oåterkallelig aggregering uppstår. I dessa fall kan mer avancerad modellering tillämpas på data. Ingen affinitet information finns tillgänglig om ligand konvertering är så snabb att den når avslutad före den första denaturering övergången.
Betydelse med avseende på befintliga metoder
Vår metod för första gången tillåter DSC används för att mäta bindande termodynamik vid hög affinitet, termolabila ligander. Genom att utföra en global samtidig analys av alla skanningar, extraheras termodynamiska parametrar med hög noggrannhet20. En ytterligare fördel är att hela datamängden kan hämtas i så lite som ett experiment om produktens termiska konvertering har ingen affinitet till de gratis biomolecule. Däremot producerar en typisk experimentella DSC-serie för en icke-termolabila ligand kräver ~ 7-10 totala experiment.
Framtida tillämpningar
Detta tillvägagångssätt har direkta ansökningar att karaktärisera snäva, termolabila hämmare i drug discovery kampanjer. Flera terapeutiska föreningar såsom antibiotika och bensodiazepiner är kända för att vara termolabila, som genomgår snabb hydrolys vid eller nära Fysiologiskt pH och temperaturer på ~ 60-70 ° C11. DSC metoden är väl positionerat för att identifiera och karakterisera många fler. Samt, har modifiering av passande protokollet till konto för system under kinetic i stället för termodynamisk kontroll, som diskuterats ovan, potential att öppna dörren till många fler system biologiska relevans.
Kritiska steg i protokollet
En av de viktigaste experimentella rutiner att överväga är dialys eller utbyte av biomolecule och liganden i identiska arbetande buffertlösningar (protokollstegen 1,3-1,6). Buffert obalans mellan de ligand och biomolecule lösningarna kan leda till stora artefakter i baslinjen och prov skanningar som helt skymmer relevanta fällbara data. Dessutom är det viktigt att den makt behandlingen stabiliserar innan DSC är trycksatt så att det kan kontrolleras under trycksättning (protokoll steg 2.3). Om avläsningen av power ändras av mer än ~ 10 µW under trycksättning, bubblor har sannolikt bildats i kapillärerna och kan orsaka stora artefakter i data. I det här fallet måste lösningarna avgasas mer noggrant.
Figur 3. Biomolekylär vikning, bindande termolabila Ligand och oåterkalleliga aggregering. Termolabila liganden (L) konverterar till produkt (X) med en hastighet konstant kc. X har ingen affinitet till biomolecule. Bundna delstaten (B) biomolecule utbytet med den fria vikta stat (F) med ränta konstanter koff och kpå. F utbyten med ovikt skick (U) med ränta konstanter ku och kf. U konverterar irreversibelt till aggregerade staten (A) med hastigheten konstant kagg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Datorsimulering av jämvikt och kinetiskt kontrollerad DSC experiment i frånvaro och närvaro av en termolabila Ligand. (en) jämvikt Biomolekylär vikning. (b), jämvikt vikning, termolabila ligand bindande och långsam termolabila ligand konvertering. (c), jämvikt Biomolekylär vikning. (d), jämvikt vikning, termolabila ligand bindande och snabbt termolabila ligand konvertering. (e), jämvikt Biomolekylär vikning och långsam irreversibel aggregering. (f), jämvikt vikning, bindande, långsam termolabila ligand konvertering och långsam irreversibel aggregering. (g), Slow Biomolekylär vikning. (h), Slow vikning, jämvikt bindande och långsam termolabila ligand konvertering. (jag) jämvikt Biomolekylär vikning. (j), jämvikt vikning, långsam termolabila ligand bindande och långsam termolabila ligand konvertering. I alla paneler är första och sista simulerade skanningar mörkt röd och mörk blå, respektive. Paneler som visar endast ljusa och mörka blå thermograms indikerar att alla simulerade skanningar overlay, och bara de sista två är synliga i handlingen. DSC experiment var simuleras med 20 skanningar (10 smältning och 10 glödgning) med 1 ° C min-1 scan hastighet, med en temperatur mellan 0-80 ° C. Vissa skärmar smalare temperaturområden för att tillåta bättre visualisering av utvecklingstendenser som simulering. Biomolecule och ligand koncentrationerna i simuleringarna var 200 µM 10 mM, respektive. Varje experiment simulerades med en 600 s Jämviktstiden tid vid 0 ° C innan skanning och 60 s Jämviktstiden tid mellan varje efterföljande genomsökningar. Arrhenius parametrar för jämvikt bindande och fällbara var enpå = 5 x 10-1 M-1 s-1, enoff = 1 x 1019 s-1, Eenpå =-20 kJ mol-1, Een off = 120 kJ mol-1, envik = 1 x 10-14 s-1, enveckla = 5 x 1018, Eenvik =-80 kJ mol-1, och Eenveckla = 120 kJ mol-1 . Arrhenius parametrar för kinetiskt kontrollerad bindande och fällbara var enpå = 5 x 10-3 M-1 s-1, enoff = 1 x 1016 s-1, Eenpå =-20 kJ mol-1E en off = 120 kJ mol-1, envik = 1 x 10-16 s-1, enveckla = 5 x 1016, Eenvik =-80 kJ mol-1, och Eenveckla = 120 kJ mol-1 . Arrhenius parametrar för långsamma och snabba termolabila ligand konvertering var enlångsam = 7.509 x 1010 s-1, Eenlångsam = 94.65 kJ mol-1och ensnabb = 1 s-1, Een snabb = 10 kJ mol-1. Arrhenius parametrar för långsam irreversibel aggregering var ettagg. = 5 x 107 s-1 och Eettagg. = 80 kJ mol-1. Överflödig värme kapacitet beräknades ΔHUF (utspelar sig), ΔHBF (bindande) och ΔHAF (aggregerar) = 200, -140 och 50 kJ mol-1, respektive. Den teoretiska beskrivningen av kinetiskt kontrollerad DSC experimenterar med termolabila ligander och skript för att utföra dessa simuleringar (och nödvändiga parametrar) finns i kompletterande fil 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
R. W. H. V stöddes av McGill naturvetenskaplig och teknisk forskning rådet av Kanada (NSERC) utbildningsprogram i Bionanomachines. A. K. M. och P. E. J. stöddes av NSERC bidrag 327028-09 (A. K. M) och 238562 (P. E. J.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
References
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I. Microcalorimetry of biological macromolecules. Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).
- Brandts, J. F., Lin, L. N. Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry. Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).
- Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC. Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).
- Garbett, N. C., Chaires, J. B. Thermodynamic studies for drug design and screening. Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).
- Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. Measurements of binding thermodynamics in drug discovery. Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).
- Plotnikov, V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
- Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions. Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).
- Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure. Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).
- Murray, J. B., Alshora, H. I. Stability of Cocaine in Aqueous-Solution. J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).
- Waterman, K. C., et al. Hydrolysis in pharmaceutical formulations. Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).
- Mergny, J. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
- Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes. Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).
- Hinz, H. -J. Chapter 3. Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , Springer. Berlin Heidelberg. 45-128 (1986).
- Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs. Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).
- Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).
- Reinstein, O., et al. Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand. Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).
- Tellinghuisen, J. Statistical error propagation. J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).
- Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes. J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).
