Summary
Biz hızlı katlanır ve etkileşimleri ile thermolabile ligandlar diferansiyel tarama Kalorimetre kullanarak bağlama biyomoleküler karakterizasyonu için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Diferansiyel kalorimetre tarama (DSC) miktarının biyomoleküler katlama ve bağlama etkileşimleri yöneten termodinamik parametreler için bir güçlü bir tekniktir. Bu bilgiler yeni ilaç bileşikler tasarımda önemlidir. Ancak, birçok pharmaceutically ilgili ligandlar DSC analizleri içinde kullanılan yüksek sıcaklıklarda kimyasal olarak kararsız vardır. Ligandlar ve termal olarak dönüştürülür ürünleri konsantrasyonları Kalorimetresi hücre içinde sürekli değişiyor çünkü böylece, bağlama etkileşimleri ölçme meydan okuyor. Burada, thermolabile ligandlar ve DSC dönüştürme işlemleri hızla katlama, bağlama ve ligand termodinamik ve Kinetik bilgi almak için bir iletişim kuralı'nı mevcut. DNA aptamer thermolabile ligand kokain bağlar MN4 için bizim yöntem uygulamış. Thermolabile ligand dönüştürme için hesapları yeni bir küresel uygun analiz kullanarak, tam bir katlama ve bağlama parametreler kümesi elde DSC deneyler bir çifti. Buna ek olarak, gösterdiğimiz oranı sabit thermolabile ligand dönüşüm için yalnızca bir ek DSC veri kümesi ile temin edilebilir. Biomolecule, yavaş katlanır, yavaş bağlama ve thermolabile ligand hızlı tükenmesi geri dönüşü olmayan toplama dahil olmak üzere belirlenmesi ve birkaç daha karmaşık senaryo verileri analiz etmek için yönergeler sunulmaktadır.
Introduction
Diferansiyel kalorimetre tarama (DSC) quantitating biyomoleküler bağlama ve katlama etkileşimleri1,2,3için güçlü bir yöntem olduğunu. DSC gücü onun yetenek bağlama ve mekanizmaları katlama aydınlatmak ve karşılık gelen termodinamik parametreler2,3verim için içerir. Ayrıca, DSC çözüm fizyolojik koşullar altında gerçekleştirilebilir ve etiketleme biomolecule veya ligand, örneğin, fluorophores, spin-etiketleri veya nükleer izotoplar4gerektirmez. Araç biomolecule ligand de denatüre için gereken ısı miktarı ölçüm sıcaklığı, inceden inceye gözden geçirmek. Elde edilen yerlerde ligand bağlayıcı ve süreçleri katlama yöneten termodinamik parametreler ayıklamak için kullanılır. DSC veya diğer termodinamik teknikleri tarafından sağlanan bilgi uyuşturucu biomolecules1,5,6,7,8hedefleme tasarımını rehberlik için önemlidir. Ancak, tekrarlanan yüksek sıcaklıklara tarama (~ 60-100 ° C) sorunlu olabilir. Örneğin, birçok pharmaceutically önemli bileşikler düzenlenmesi veya yüksek sıcaklık9,10,11, Yanisürekli maruz üzerine ayrışma geçmesi, onlar thermolabile. Etkileşimleri DSC tarafından genellikle bağlama muayene thermogram termodinamik analizler12tekrarlanabilirlik doğrulamak için birden fazla ileriye ve geriye doğru inceden inceye gözden geçirmek gerekir. İlk bir ligand termal dönüşümü değişmiş bağlama özellikleri ile ikincil bir forma yol açar şekil ve art arda gelen yerlerde, konumunu telaffuz farklılıkları sırasında her tarama ile ilk ligand konsantrasyonu azalır bu yana Termal dönüşümü ürünleri birikir. Bu veri kümeleri için geleneksel analizleri mükellef değildir.
Biz son zamanlarda biyomoleküler katlama yöneten ve bağlama etkileşimleri için başvurulan tek bir ligand bağlı deneme termodinamik parametreler komple set verir thermolabile ligand DSC veri kümeleri için küresel uygun yöntem geliştirdik 4ücretsiz biomolecule için gerekli thermogram. Analiz örnek gerektirdiği ve deneysel zamanı azaltır ~ 10 kat standart DSC yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında. Biz muhasebesi ligand için bu varsayarak tarafından termal dönüşümü sırasında her tarama nereye thermogram bağlı değildir ligand konsantrasyonu yüksek sıcaklık bölümü olur. Bu nedenle, ligand konsantrasyonu termodinamik parametreler ayıklamak için kullanılan thermogram bölümünü içinde bir sabittir. Nasıl oranı sabit ligand termal dönüşümü için daha uzun bir yüksek sıcaklık denge süre ile bir ek deneme yaparak elde edilebilir Ayrıca gösterdi. Ligand termal dönüşümü daha az sıcaklık bağımlı nerede sistemleri için (Yani, kayda değer bütün sıcaklıklarda meydana gelen), analiz değişken ligand konsantrasyonu içerecek şekilde değiştirilmiş. Burada biz hızla benzoylecgonine yüksek sıcaklıklarda dönüştürür thermolabile ligand kokain huzurunda DNA aptamer MN4 için bu yordamı göstermek (> 60 ° C). Kinin dönüşüm deneysel bu sıcaklıklarda geçmesi değil ve ayrıca MN4 için bağlar ligand thermolability için bir negatif kontrol kullanılır. Biz thermolabile ligand DSC veri kümeleri ve termodinamik ve Kinetik parametreleri katlama, bağlama ve ligand dönüştürme işlemleri verimli onların analiz edinimi tanımlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. numune hazırlama
- İstenen biomolecule13arındırmak.
Not: 2 M NaCl üç kez deiyonize su 3 kDa molekül ağırlığı kesme membran ile santrifüj filtre kullanarak üç tur ardından karşı değiş tokuş sonra bu protokolü kullanır satın kokain bağlama DNA aptamer MN4. - Sentez ve arındırmak veya istenen thermolabile ligand13satın alın.
Not: MN4 thermolabile ligand kokain bağlar. MN4 da bir negatif kontrol ligand thermolability deneysel bu sıcaklıklarda kullanılır kinin bağlar. - Arabellekleri arıtılmış biomolecule diyaliz ve ligandlar (20 mM sodyum fosfat ve 140 mM NaCl tampon, pH 7.4, MN4 ve burada kullanılan ligandlar) dağılması hazırlayın.
- Biomolecule diyaliz boru kullanarak arabellek en az 2 litre karşı diyaliz ile 0,5 - 1,0 kDa kesme.
- (Çalışma arabellek adlandırılır) son arabellek iyice ile tampon equilibrated 0.2 µm filtre ile filtre.
- Ligandlar istenen kitlelerin tartmak ve onları süzülmüş çalışma arabellekte geçiyoruz. İstenen ligand konsantrasyonu doğru tartmak için çok küçük kitlelerin gerektiriyorsa, bir konsantre ligand hisse senedi çözüm (örneğin 10 x) olun.
Not: Tüm DSC deneyler için örnek aynı çalışma tampon kullanmak ve ligand, Yani, hiç bir deney bu arabellek neden olur nerede ligand çalışma arabelleği biomolecule daha farklı bir toplu iş çözülür gerçekleştirmek önemlidir veri aktarımında uyuşmazlığı. - Biomolecule hisse senedi çözüm iyice çalışma arabellek ile equilibrated 0.2 µm filtre ile filtre.
- Absorbans ölçümleri tarafından biomolecule konsantrasyonu belirlemek (260 nm için nükleik asitler gibi MN4 ve 280 nm proteinler için).
- Hazır biomolecule ve ligand 4 ° C buzdolabı (MN4 ve burada kullanılan ligandlar için uygun), ya da -20 depolamak veya-80 ° biomolecule ve ligandlar donma ve uzun vadeli depolama hoş görürsen C gereklidir. Degas degasser DSC yükleme önce bir masa üstü arabellek, biomolecule ve ligand çözümlerinde ( Tablo malzemelerigörmek).
Not: Gaz Giderme daha yüksek sıcaklıklarda DSC kabarcık oluşumu önlemeye yardımcı olur. Kabarcıklar DSC tepe şekil ve taban çizgisi belirsiz sinyal eserler neden.
2. DSC hazırlık
- DSC'den gelen basınç kolu sökün ( Tablo malzemelerigörmek).
- Silikon tüp çalışma arabelleğinden çalıştırın ve başvuru kılcal ön flanş (metal açılış) ekleyin.
- Arka başvuru flanş açık örnek flanş bağlanarak başvuru ve örnek kılcal damarlar arasında bir köprü oluşturun.
- Silikon tüp bir parça bir atık şişesi vakum çizgi eklenmiş ile çalışan arka örnek flanş iliştirin.
- DSC ile çalışma arabellek 200 mL sifonu çekmeyi vakum hattı açın.
- DSC çalışma arabellek ile başvuru kılcal yükleyin. Yaklaşık 3-5 cm silikon tüp bölümlerini başvuru kapiller flanşlar iliştirin.
- 1 mL pipet ucu arka flanş'ın silikon tüp içine yerleştirin. Çalışma arabelleği bir pipet ile 0.8 mL çizmek ve pipet ucu ile tampon ön başvuru flanş'ın silikon tüp içine yerleştirin.
- Pipet pompası pass açık silikon tüp yoluyla çalışma arabellek içine referans kılcal aşağı hafifçe bastırın ve pipet ucu yukarı arka flanş'ın içine eklenir. Çalışma arabellek düzeyi sadece yukarıda açık silikon tüp ulaşana kadar pipet pistonu tuşuna basın, daha sonra çalışma arabellek düzeyi sadece yukarıda arka silikon tüp ulaşana kadar pipet pompası bırakın.
- İleri geri baloncuklar başvuru kılcal hacmindeki temizlemek için çalışma arabellek geçen yineleyin.
Not: Genellikle, çözüm ileri geri, 10 geçişleri herhangi bir kabarcıklar temizlemek yeterlidir.
- İleri geri baloncuklar başvuru kılcal hacmindeki temizlemek için çalışma arabellek geçen yineleyin.
- Arka pipet ucu başparmak ile kap ve arka pipet ucu ve onlara bağlı silikon tüp ile başvuru flanşlar kaldırmak için açık pipet yavaşça çekin.
- Örnek kılcal çalışma arabellek olduğu gibi adımları 2.6-2,9 ile yükleyin. Siyah bir plastik kap üzerinde arka başvuru ve flanşlar, örnek yer açık flanşlar bırakarak ortaya çıkardı.
- Basınç kolu takın.
- DSC yazılımını açın (bkz. Tablo reçetesi) ve bir kez güç okuma stabilize; yukarı ok arabirimin üstündeki kırmızı tıklatarak araç basınç DSC güç üst kutusunda belirtilen enstrüman sıcaklık ve basınç okuma ile birlikte arabiriminin değil.
Not: Monitör DSC okuma güç su geçirmezlik maddeler. Gücünü değişimler fazla ~ 10 µW eserler verilerde neden olabilir kılcal kabarcık oluşumu gösterir. Çözümler kaldırıldı ve degassed daha fazla devam etmeden önce. - Çalışma arabellek ile DSC ileriye ve geriye doğru tarama yaparak equilibrate. Ekranın sol tarafında "Deneysel yöntemi" sekmesinde, "Tarama" seçeneği DSC sıcaklık tarama modunda çalıştırmak için seçili olduğundan emin olun.
Not: Tarama aralığı, tarama hızı, düşük ve yüksek sıcaklık denge zaman ve taramaları sayısı sıcaklık deneysel parametreleridir.- "Deneysel yöntem" sekmesi altında "Sıcaklık parametreleri" ilave "Isıtma için" düğmesini tıklatın. Alt ve üst deneysel sıcaklıkları, 1 ° C/dk'ya tarama hızı ve 60 için 1 ile 100 ° C girin denge dönemin s.
- Denge süre altında giriş "Serisi Ekle" düğmesini tıklatın. (Bir Isıtma ve soğutma bir inceden inceye gözden geçirmek için) 2 halk pencere "eklemek için adımları" alanına girin ve "alternatif Isıtma/soğutma" kutusunu işaretleyin. Tıkırtı "OK"; eklenen tarama arabirimi alt kısmında görünür. Her tarama olarak parametreleridir onay istenen.
- Deneme arabirimin üstündeki yeşil "Oynat" düğmesini tıklatarak başlatın. İstediğiniz klasöre gidin ve deneme popup penceresinde kaydetmek için bir dosya adı girin. Deney devam eden "Veri" sekmesi "Deney yöntemi" sekmesini sağ tıklatarak görüntüleyin.
3. Thermolabile Ligand DSC veri toplama
Not: En az prosedür beş deney oluşur: arabellek başvuru deneyler ve ligand olmadan (temel çıkarma için kullanılan, konuyabakın), örnek ücretsiz biomolecule ligand bağlı biomolecule ile deneyler ve daha uzun bir yüksek sıcaklık denge süre ile ligand bağlı biomolecule.
- Başvuru deneyler temel çıkarma örnek verileri için çalıştırın. Her iki kılcal çalışma arabelleği ile DSC yeniden ve 1 ° C min-1 bir üst (yüksek sıcaklık) ile uygun sıcaklık aralığında birden fazla ileriye ve geriye doğru inceden inceye gözden geçirmek toplamak denge zaman 120 s.
- Önceki arabellek denge inceden inceye gözden geçirmek arabirimin alt kısmından her ayrı ayrı vurgulama ve arabirimin tam ortasında kırmızı X tıklayarak silin. Yeni taramaları "Serisi Ekle" düğmesini tıklayarak "eklemek için adımları" için alanı 20 girmek ve "alternatif Isıtma/soğutma" kutusu denetimi ekleyin. Tamam'ı tıklatın ve yukarıdaki gibi yeşil play butonuna tıklayarak deneme çalıştırın.
- 3.1 - adımları yineleyin 3.1.1 ligand başvuru elde etmek için her iki kılcal damarlar içinde istenen konsantrasyonu içeren çalışma arabellek ile deneyler için ligand (120 kullanarak iki ayrı deney toplamak s ve 600 s yüksek sıcaklık denge kez sırasıyla, thermolabile ligand dönüşüm oranı sabit edinme kullanılmak üzere).
Not: Burada kullanılan tarama hızı biomolecule sonraki deneylerde, ileriye ve geriye doğru taramaları ( konuyabakın) termal denge sağlanır. Oranları < 0,1 0,2 ° C min-1 için gürültülü yerlerde yol ve DSC deneylerde uygun değildir-inceden inceye gözden geçirmek. Sıcaklıklar ligand doymuş biomolecule erime sıcaklığı iyi ücretsiz biomolecule erime sıcaklığı aşağıda kuyudan genişletmek (~ MN4 için 20-80 ° C). (Örneğin, 10 ileri ve 20 toplam 10 ters taramalar için yeterli) tarama tekrarlanabilirlik doğrulayın. - (Örneğin, kokain ve kinin) birden fazla ligandlar kullanıyorsanız, DSC ile çalışma (2.5 adımından tekrar) arabelleği ligand kılcal damarlar kaldırmak ve Çapraz bulaşma engellemek için çalıştırma arasında 200 mL sifonu çek.
Not: Çoğalt bir deney üzerinde ücretsiz biomolecule ligand bağlı çalıştırdıktan sonra önceki ligand şiddetle kapiller duvarları adsorbs ve yeterli arabellek kızarma ile kaldırılmaz kontrol için gerçekleştirmek yararlıdır. Ücretsiz biomolecule için yerlerde ligand bağlı deneme sonra bir daha büyük büyüklük ve daha yüksek denatürasyon sıcaklık kaydırılır görünüyorsa, büyük olasılıkla önceki ligand kızarma sonra Kalorimetresi hala mevcut olduğunu. % 20 ile kılcal kuluçka tarafından adsorbed ligand kaldırmak Contrad-70 plastik kapaklar ve basınç kolu kapalı 60 ° C'de 1 h için. DSC yazılım, denge süre girilen sıfır ile "İzotermal" süresi ve 60 ° C izotermal ısı için deneysel yöntem sekmesini seçin 3.600 s altında için deneysel modunu değiştirmek. "Deneysel yöntem Ekle" seçeneğini tıklatın. İzotermal deney ekranın alt bölümünde görünür. Tamamlanma sonra araç 2 litre deiyonize su ile Temizleme ve 2.5 arasındaki adımları yineleyin.
- Örnek deneyler DSC başvuru taranan gibi yükleme yordamı ve deneysel parametreleri kullanarak çalıştırın. Ücretsiz biomolecule veri kümesi için örnek kılcal çalışma arabellek istenen konsantrasyon, ücretsiz biomolecule içerirken, başvuru kılcal çalışma arabellek içerdiğinden emin olun.
- Ligand bağlı deneyler için başvuru kılcal çalışma arabellekte ligand mevcuttur ve biomolecule artı ligand örnek kılcal arabellekte çalışma vardır emin olun. Adım 2,5 olduğu gibi farklı ligandlar eklemeler arasında sistem floş.
- Biomolecule ile ek deneme bağlı thermolabile ligand nerede yüksek sıcaklık denge dönemi için 600 artırılır gerçekleştirin s ve diğer tüm deneysel parametreleri olan adım 3.2.1 ile aynı.
Not: Yüksek sıcaklık denge dönem için ikinci ligand bağlı deneme süresi sadece ligand kısa denge zaman deneme daha hızlı tükenmiş olması için seçilir. Eğer tarama sayısının bir fonksiyonu olarak yavaş yavaş çürüme ligand bağlı doruklarına ilk deneme (örneğin, birbirini izleyen en yüksek maxima farklılıkları vardır ≤ 0,5 ° C), tahmin etmek için yüksek sıcaklık denge dönemde 10 - için 20 - kat artar yeterince ligand ikinci deneme sırasında tüketmek. Ligand dönüşüm oranı sabit doğru hesaplama ikinci deneme ilk göre ligand swifter tükenmesi olmasını gerektirir. İki deney küresel analizinden elde ligand konsantrasyonu-ecek var olmak benzer ve ligand tükenmesi yeterince ikinci denemede hızlandırılmış değildir Eğer bu nedenle kullanılamaz.
4. veri işleme
- Açık DSC deneme DSC veri analiz yazılımı dosyalarında ( Tablo malzemelerigörmek) ve e-tablolar ham güç veri verme.
- Yazılım için uygun veri içine ham güç veri içeren tablolar içe aktarın.
- Temel örnek veriler arabellek güç veri--dan belgili tanımlık özgür ve ligand bağlı biomolecule deneyler çıkararak çıkarma.
Not: thermolabile ligand deneme için her tarama ile ilk ligand konsantrasyonu azalıyor. Bu nedenle, örnek tarama 1 arabellek taramasından 1 çıkarmak idealdir. Kokain ile arabellek taramaları kayda değer olarak ligand dönüşüm devam eder ve bu nedenle bir tek thermolabile ligand arabellek tarama thermolabile ligand bağlı verilerin hepsini çıkarmak için kullanılabilir değiştirmeyin bulduk. - Temel düşülen örnek güç veri ısı kapasitesi için dönüştürün.
Not: Tahmini14,15,16-ebilmek var olmak biomolecule'nın kısmi belirli birim dönüştürme gerektirir. Güç ısı kapasitesi için dönüştürmek için denklem oldu daha önce açıklanan17.
5. veri analizi
- Genel olarak kısa denge zaman thermolabile ligand bağlı ısı kapasitesi dataset temel, ligand konsantrasyonu, katlama ve4daha önce açıklandığı gibi parametreleri bağlama ligand tek bir dizi uygun.
- Global uzun denge zaman veri kümesi için uygun4daha önce açıklandığı gibi thermolabile ligand dönüşüm oranı sabit hesaplamak için yineleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thermolabile ligand DSC için temsilcisi veri şekil 1' de gösterilir. Thermolabile ligand bağlı pik yüksekliği ve pozisyon gittikçe vardiya bu ilişkisiz biomolecule doğru thermolabile ligand her inceden inceye gözden geçirmek ile (Şekil 1a) tükenmiş gibi. Ücretsiz denatürasyon profil thermolabile ligand dönüşüm (Şekil 1b) son nokta için bir başvuru olarak kullanılır. Veri kinin için bağlı MN4 için bir negatif kontrol thermolabile ligand dönüşüm (Şekil 1b) olarak gösterilir. Son thermolabile ligand inceden inceye gözden geçirmek biraz daha yüksek geçiş orta ve thermolabile ligand dönüşüm ürün (benzoylecgonine) sahip MN4 için zayıf bir yakınlık gösteren tepe yükseklikleri ilişkisiz MN4 göre var. Şekil 1 ' deki veri kümeleri genel analiz kaynaklanan termodinamik parametreler Tablo 1' de listelenir. MN4 katlanır parametrelerini kokain veya kinin huzurunda seyreltik küçük moleküller ücretsiz biomolecule katlanır termodinamik huzursuz beklenen değil beri beklendiği gibi hata içinde aynıdır. Bağlama Parametreler bu izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC)18 ile iyi anlaşma ve kinin üzerinde kokain için MN4'ın tercih daha olumlu bir bağlama entalpi tarafından tahrik edilmektedir ortaya koyuyor. Şekil 2' de, yüksek sıcaklık denge dönemi artan thermolabile ligand konsantrasyonu daha belirgin indirimleri ile her tarama göreli olarak kısa denge dönem veri kümesi verir. İki veri kümelerini en iyi duruma getirilmiş küresel uygun toplama parametrelerini kullanarak, yüksek denge sıcaklığında ligand dönüşüm oranı sabit Resim 2 ilave çizgisinin eğimini hesaplanır.
Şekil 1. Thermolabile ligand DSC. Kokain (başlangıç konsantrasyonu 778 µM) (bir) MN4 yerlerde (83 µM) zorlayacak. Karşılık gelen uygun renkli çizgiler olarak gösterilmiştir iken MN4 ilk ve son taranmasını ligand huzurunda koyu kırmızı ve mavi daireler olarak gösterilir. (b) ücretsiz MN4 yerlerde (83 µM, siyah daireler) ve ardışık taramaları kinin (880 µM, renkli daireler) bağlı. Uygun ücretsiz ve kinin bağımlı veri kümeleri için sırasıyla siyah ve renkli çizgiler olarak gösterilmiştir. Referans4 ' ten Kimya Royal Society izniyle çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Thermolabile Ligand dönüşüm oranı sabit ölçme. yerlerde MN4 için (bir) kümesi bağlı kısa (120 s, koyu kırmızı) ve uzun (600 s, koyu mavi) denge ile kokain için 80 ° C'de sırasıyla kez. (b) (bir) veri kümelerini genel analiz tarama numara bir fonksiyonu olarak çıkarılan kokain konsantrasyonları. Deneysel noktaları ve Üstel uygun renkli daireler ve çizgiler sırasıyla gösterilir. İlave yukarıda açıklanan ek EQ 19'a en iyi duruma getirilmiş küresel uygun kokain konsantrasyonları için iki veri kümeleri4kullanarak Harkness vd. doğrusal bir uyum gösterir. Ligand 80 ° c termal dönüşüm oranı sabit çizgisinin eğimini hesaplanır. Hata oranı sabit thermolabile ligand dönüştürülmek için ± iki standart sapma verilir. Referans4 ' ten Kimya Royal Society izniyle çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Uygun parametreleri | Kokain eklendi | Kinin eklendi |
| ∆HUF | 271.3±1.8 | 272.5±4.0 |
| ∆SUF | 824.4±5.1 | 827.9±10.9 |
| ∆GUF | 21.6±0.2 | 21.6±0.9 |
| ∆HB1F | -75.2±1.6 | -101.0±4.0 |
| ∆SB1F | -154.2±5.0 | -213.7±12.0 |
| ∆CpB1F | -1.5±0.1 | -1.2±0.1 |
| ∆GB1F | -28.5±0.2 | -36.2±0.7 |
| ∆HB2F | -33.7±1.8 | - |
| ∆SB2F | -49.9±5.2 | - |
| ∆CpB2F | -2.2±0.1 | - |
| ∆GB2F | -18.6±0.3 | - |
Tablo 1. Termodinamik parametreler MN4 DSC veri kümeleri kullanarak kokain ve kinin küresel analizinden ligandlar ayıklanır. Parametreleri 30 ° C'de hesaplanan Kokain veya kinin bağlı katlanmış Amerika'ya B1F başvurur ve B2F benzoylecgonine bağlı katlanmış durumuna gelir. ΔH ve ΔG kJ/mol içinde ifade, ΔS ifade edilen J/mol/K ve ΔCp kJ/mol/K. içinde ifade hataları göre varyans/co-variance yöntemi19hesaplanan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Değişiklikler ve sorun giderme
Şekil 1 ve Şekil 2 kullanılan küresel uygun analiz ayrıntılarını olmuştur daha önce açıklanan4. Burada, performans ve thermolabile ligandlar ile DSC bağlama deneyler analiz pratik açılardan anahat. Yalnız thermolabile ligand ligand çıkarılır için DSC temel alınan Not + biomolecule dataset, etkili bir şekilde serbest veya termal dönüşüm tarafından absorbe ısı dışarı iptal kendisi işlemek. Standart thermolabile ligand küresel uygun analiz (Resim 1 ve Şekil 2) sistem sıcaklık tarama boyunca termodinamik denge altındadır ve thermolabile ligand konsantrasyonu sabit olduğunu varsayar Her thermogram, sadece yüksek sıcaklık denge döneminde azalan. Biz daha önce bu varsayım kokain bağlı MN4 için geçerlidir ve herhangi bir thermolabile ligand/biomolecule sistemi için Kinetik ile benzer tutmak için beklenen göstermiştir.
Ancak, hangi sistem termodinamik denge olması kabul edilemez ve/veya ligand konsantrasyonu tek bir tarama sabit kabul edilemez bazı durumlar vardır. İ) zaman katlanır/unfolding oranları tarama oranı karşılaştırıldığında yavaş III) olduğunda yüksek sıcaklıkta geri dönüşü olmayan toplama biomolecule uğrar II) ligand termal olarak hızla sıcaklık tarama oranı göreli olarak dönüştürür bu içerir ve IV). Ne zaman ligand Derneği/ayrılma oranları tarama hızı ile karşılaştırıldığında yavaş. Bu gibi durumlarda, termodinamik yerine Kinetik kontrolü altında sistemidir ve başvuru 4 verilen analiz kesinlikle uygulanamaz. Veri kantitatif şekil 3, ek dosya 1' de açıklandığı gibi benzetimi yapılabilir. Prensip olarak, bu Kinetik hesaplanmıştır bu analiz bu yazının kapsamı dışındadır ancak potansiyel olarak verimli veri, kinetik ve termodinamik denge DSC verileri sığdırmak için kullanılabilir. Bunun yerine, biz sigara denge durumları belirlenmesinde okuyucu yardımcı olacak bazı temsilcisi simüle DSC veriler mevcut.
Termodinamik denetim ideal bir örnek şekil 4ab. gösterilir DSC yerlerde ücretsiz biomolecule, superimposable (şekil 4a) ve inceden inceye gözden geçirmek ile thermolabile ligand histeresis gösterme, erime sıcaklığı üzerinde gözlenen öyle ki up-inceden inceye gözden geçirmek önceki aşağı-inceden inceye gözden geçirmek (katlama sıcaklığı ile eşleşir Şekil 4b). Thermolabile ligand hızla dönüştürdüğünde tarama oranı karşılaştırıldığında büyük distorsiyonları thermogram içinde görünür ve termodinamik denklemleri tepe şekil için şekil 4 c, dgösterildiği gibi hesap yapmak. Bu-ebilmek var olmak biraz tarama hızını artırarak hafifletti. Biomolecule toplayan bir sıcaklık bağlı şekilde, DSC izler birbirini izleyen ücretsiz biomolecule göstermek için ne zaman azalır büyüklüğü (şekil 4e), ek thermolabile ligand termal upshifts azalan bir desen oluşturur ideal durumda, azalan biomolecule konsantrasyonu (4f rakam) tarafından ölçekli ama benzer. Öyle ki belirgin denatürasyon sıcaklık up-inceden inceye gözden geçirmek üstünde aşağı-inceden inceye gözden geçirmek (üzerinde belirgin renaturation sıcaklık daha yüksek ne zaman katlanır/Kinetik unfolding yavaş tarama hızı histeresis ücretsiz biomolecule DSC izleri görülür karşılaştırılır Şekil 4 g). Thermolabile ligand ilavesi up-taramalar (şekil 4 h) için özellikle termal upshifts azalan tanıdık deseni yol açar. Son olarak, sistemleri hızlı katlanır ve yavaş bağlama ile histeresis ücretsiz DSC yerlerde (4i rakam), ücretsiz biomolecule için üretmek ancak thermolabile ligand verilerle histeresis up-inceden inceye gözden geçirmek belirgin erime sıcaklığını yerini göster önceki aşağı-tarama (şekil 4j) belirgin katlama sıcaklığını daha yüksektir. Yine de, termal upshifts azalan tipik desen up-inceden inceye gözden geçirmek ve aşağı-inceden inceye gözden geçirmek içinde görünür. Söz konusu olduğunda yavaş katlama veya bağlama Kinetik sigara-denge davranış olabilir her ne kadar bu tarama meydana gelen önemsiz ligand termal dönüşümü riskini biraz tarama hızını azaltarak ortadan kalkar. Uygulamada, tarama hızı ve üst denge sıcaklığı el ile şekil 4a, bbenzeyen verileri elde etmek için ayarlanabilir.
Teknik sınırlamaları
Termodinamik analizimizi DSC thermolabile ligandlar ile deneyler bağlama için katlama ve bağlama işlemleri oldukça hızlı ve thermolabile ligand dönüşüm her tarama yüksek sıcaklık bölümü önce yavaş gerektirir. Ne zaman katlanmış ve/veya bağlı devlet ömrünü yaklaşık 30'dan büyük s (kkapalı, ku < 0,03 s-1), histeresis 1 ° C min-1gerçekleştirilen taramaları discernable olur. Ayrıca, ne zaman ligand dönüşüm oranı sabit yaklaşıkc k 10-4 s-1 = denatürasyon geçiş önce ligand önemli tükenmesi tek bir tarama süresince olabilir. Geri dönüşü olmayan toplama oluştuğunda uygulama bizim analiz de uygunsuz olur. Bu gibi durumlarda, daha ileri modelleme verilerine uygulanan. Hiçbir ilgi bilgi ligand dönüşüm tamamlanmadan önce ilk denatürasyon geçiş ulaşır hızlı ise kullanılabilir.
Mevcut yöntemler açısından önemi
Bizim yöntemi ilk kez yüksek afinite, thermolabile ligandlar bağlama termodinamik ölçmek için kullanılacak DSC sağlar. Tüm taramalar bir küresel eş zamanlı analiz gerçekleştirerek, termodinamik parametreler ile yüksek doğruluk20ayıklanır. Bir ek yararı termal dönüşümü ürün ücretsiz biomolecule için hiçbir ilgi varsa tam veri kümesi bir deneyde toplanabilir olmasıdır. Buna ek olarak, thermolabile olmayan bir ligand için tipik bir deneysel DSC serisi üreten gerektirir ~ 7-10 toplam deneyler.
Gelecek uygulamaları
Bu yaklaşım ilaç keşif kampanyalar sıkı, thermolabile inhibitörleri karakterize için doğrudan uygulama alanı vardır. Antibiyotik ve benzodiazepinler gibi birkaç terapötik bileşiklerin thermolabile, hızlı hidroliz veya fizyolojik pH ve sıcaklık yakınındaki geçirmekte olduğu bilinmektedir ~ 60-70 ° C11. Bu DSC yöntemi belirlemek ve daha birçok karakterize iyi konumlandırılmış. De, değişiklik sistemler termodinamik yerine Kinetik kontrolü altında hesap için uygun iletişim kuralı yukarıda anlatıldığı gibi biyolojik konu ile ilgili pek çok daha fazla sistemleri kapıyı açmak potansiyeline sahiptir.
Protokol içindeki kritik adımlar
Göz önünde bulundurulacak en önemli deneysel yordamlardan birini diyaliz veya biomolecule ve ligand Exchange'e aynı çalışma tampon çözeltiler (iletişim kuralı adım 1.3-1.6) ' dir. Arabelleği uyuşmazlığı ligand ve biomolecule çözüm arasında tamamen belirsiz ilgili katlama veri temel ve örnek taramaları büyük eserler yol açabilir. Ayrıca, böylece basınçlandırma (iletişim kuralı adım 2.3) sırasında izlenebilir DSC basınç altında önce güç okuma stabilize esastır. Güç okuma tarafından değişirse daha fazla ~ 10 µW basınçlandırma sırasında kabarcıklar kılcal damarlar içinde büyük olasılıkla oluşturdular ve büyük eserler verilerde neden olabilir. Bu durumda, çözümler daha iyice degassed gerekiyor.
Şekil 3. Katlama, bağlayıcı bir Thermolabile Ligand ve geri dönüşü olmayan toplama biyomoleküler. Ürün (X) oranı sabit kcile thermolabile ligand (L) dönüştürür. X biomolecule için hiçbir ilgi vardır. Ücretsiz biomolecule alışverişler ilişkili durum (B) devlet (F) hızı sabitler kkapalı ve küzerindekatlanmış. F alışverişler gelişeceğini durumuyla hızı sabitler ku ve kf(U). U geri dönüşümsüz oranı sabit kaggtoplanan durumuyla (A) dönüştürür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Bilgisayar simülasyonu denge ve DSC Kinetically kontrollü deneyler devamsızlık ve Thermolabile Ligand varlığı. (bir) denge biyomoleküler katlanır. (b) denge katlama, thermolabile ligand taşıması ve yavaş thermolabile ligand dönüştürme. (c) denge biyomoleküler katlanır. (d) denge katlama, thermolabile ligand taşıması ve hızlı thermolabile ligand dönüştürme. (e) denge biyomoleküler katlama ve yavaş geri dönüşü olmayan toplama. (f) denge, ciltleme, katlama yavaş thermolabile ligand dönüşüm ve yavaş geri dönüşü olmayan toplama. (g) yavaş biyomoleküler katlanır. (h) yavaş katlanır, denge bağlama ve yavaş thermolabile ligand dönüştürme. (ben) denge biyomoleküler katlanır. (j) denge katlama, yavaş thermolabile ligand taşıması ve yavaş thermolabile ligand dönüştürme. Tüm panelleri, ilk ve son simüle taramalar sırasıyla kırmızı ve koyu lacivert, vardır. Sadece açık ve koyu mavi yerlerde göstermek kapı aynası tüm simüle taramaları yerleşimi ve yalnızca son iki mezarlığına görünür olduğunu gösterir. DSC deneyler 20 inceden inceye gözden geçirmek ile (10 erime ve tavlama 10) 0-80 ° c Sıcaklık aralığı ile 1 ° C min-1 tarama hızı, simüle Bazı simülasyon eğilimlerin daha iyi görselleştirme izin vermek için dar sıcaklık aralıkları göstermek kapı aynası. Simülasyonlar biomolecule ve ligand konsantrasyonlarda sırasıyla 200 µM ve 10 mM idi. Her deney taramadan önce 600 s denge teker teker 0 ° C ve 60 s denge vakit her bir sonraki taramaları ile simüle. Arrhenius parametreler için bağlama ve katlama denge vardı birTarih 5 x 10-1 M-1 s-1, birkapalı = 1 x 1019 s-1, EbirTarih =-20 kJ mol-1, Ebir = kapalı 120 kJ mol-1, birkat = 1 x 10-14 s-1, biraçılmak = 5 x 1018, Ebirkat =-80 kJ mol-1ve Ebiraçılmak = 120 kJ mol -1= . Bağlama ve katlama kinetically kontrol için Arrhenius parametreler vardı birTarih 5 x 10-3 M-1 s-1, birkapalı = 1 x 1016 s-1, EbirTarih =-20 kJ mol-1, E = bir kapalı 120 kJ mol-1, birkat = 1 x 10-16 s-1, biraçılmak = 5 x 1016, Ebirkat =-80 kJ mol-1ve Ebiraçılmak = 120 kJ mol -1= . Yavaş ve hızlı thermolabile ligand dönüşüm için Arrhenius parametreler vardı biryavaş = 7.509 x 1010 s-1, Ebiryavaş 94.65 kJ mol-1ve birhızlı = 1 s-1, Ebir = hızlı 10 kJ mol-1=. Yavaş geri dönüşü olmayan toplama için Arrhenius parametreler vardıagg. 5 x 107 s-1 ve Ebiragg. = 80 kJ mol-1=. Aşırı ısı kapasiteleri hesaplanan ΔH (unfolding)UF , ΔHBF (bağlama) ve ΔH (toplayarak)AF = 200, -140 ve 50 kJ mol-1, anılan sıraya göre. DSC kinetically kontrollü teorik açıklaması deneyler ile thermolabile ligandlar ve bu simülasyonları (ve gerekli parametreleri) yerine getirmek için kullanılan komut dosyası mevcuttur ek dosya 1. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.
Acknowledgments
R. W. H. V McGill Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC) eğitim programı içinde Bionanomachines tarafından desteklenmiştir. A. K. M., s. E. J. NSERC hibe 327028-09 (A. K. M) ve 238562 (s. E. J.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
References
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I. Microcalorimetry of biological macromolecules. Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).
- Brandts, J. F., Lin, L. N. Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry. Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).
- Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC. Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).
- Garbett, N. C., Chaires, J. B. Thermodynamic studies for drug design and screening. Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).
- Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. Measurements of binding thermodynamics in drug discovery. Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).
- Plotnikov, V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
- Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions. Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).
- Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure. Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).
- Murray, J. B., Alshora, H. I. Stability of Cocaine in Aqueous-Solution. J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).
- Waterman, K. C., et al. Hydrolysis in pharmaceutical formulations. Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).
- Mergny, J. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
- Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes. Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).
- Hinz, H. -J. Chapter 3. Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , Springer. Berlin Heidelberg. 45-128 (1986).
- Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs. Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).
- Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).
- Reinstein, O., et al. Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand. Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).
- Tellinghuisen, J. Statistical error propagation. J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).
- Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes. J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).
