निमेटोड जनसंख्या आधारित केमोसेन्सरी पसंद परख के स्वचालित विश्लेषण

Summary

हम एक व्यवहार रिकॉर्डिंग सेटअप और प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो नेमेटोड के स्वचालित विश्लेषण को सक्षम करता है, आबादी-आधारित परख में घुलनशील यौगिकों के लिए कैनोहाबादाइटिस एलिगेंस की प्राथमिकता। यह लेख एक व्यवहार कक्ष, व्यवहार परख प्रोटोकॉल, और वीडियो विश्लेषण सॉफ्टवेयर उपयोग के निर्माण का वर्णन करता है।

Abstract

निमेटोड, कैनोबाबाइटिटिस एलिगेंस 'केवल 302 न्यूरॉन्स की कॉम्पैक्ट नर्वस सिस्टम व्यवहारों के विविध प्रदर्शनों की सूची के अंतर्गत आता है। इन व्यवहारों के तहत तंत्रिका सर्किट के विच्छेदन को सुविधाजनक बनाने के लिए, मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य व्यवहारिक assays के विकास के लिए आवश्यक है पिछला सी। एलिगेंस के व्यवहारिक अध्ययन ने "ड्रॉप टेस्ट", एक "कैमोटैक्सिस परख" के विविधताएं और सी की प्रतिक्रिया की जांच के लिए एक "प्रतिधारण परख" का उपयोग किया है । घुलनशील यौगिकों के लिए एलिगेंस इस आलेख में वर्णित विधि तीन उपरोक्त assays की पूरक ताकत को जोड़ना चाहता है। संक्षेप में, प्रत्येक परख प्लेट के बीच में एक छोटा सा सर्कल चार quadrants में विभाजित है नियंत्रण और प्रयोगात्मक एकांतर से रखा समाधान के साथ। कीड़े को जोड़ने के बाद, परख प्लेटें एक व्यवहार कक्ष में लोड की जाती हैं जहां माइक्रोस्कोप कैमरे के इलाज क्षेत्रों के साथ कीड़े 'मुठभेड़ों के रिकॉर्ड होते हैं। स्वचालित वीडियो विश्लेषण तब किया जाता हैएनडी प्रत्येक वीडियो के लिए वरीयता सूचकांक (पीआई) मान उत्पन्न होता है। इस विधि की वीडियो अधिग्रहण और स्वचालित विश्लेषण सुविधाओं से प्रयोगकर्ता की भागीदारी और किसी भी संबद्ध त्रुटियों को कम करता है। इसके अलावा, प्रयोगात्मक परिसर के मिनट की मात्रा प्रति परख के लिए उपयोग किया जाता है और व्यवहार कक्ष के मल्टी-कैमरे सेटअप प्रयोगात्मक थ्रूपुट को बढ़ाते हैं। यह विधि विशेष रूप से आनुवंशिक म्यूटेंट और उपन्यास रासायनिक यौगिकों के व्यवहार स्क्रीन के संचालन के लिए उपयोगी है। हालांकि, नियंत्रण और प्रयोगात्मक समाधान क्षेत्रों के करीब निकटता के कारण प्रेरणा ढाल के नेविगेशन के अध्ययन के लिए यह विधि उपयुक्त नहीं है। यह तब भी इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए जब कीड़े की एक छोटी आबादी उपलब्ध हो। यद्यपि केवल अपने वर्तमान रूप में घुलनशील यौगिकों में प्रतिक्रियाओं परखने के लिए उपयुक्त है, इस पद्धति को मल्टीमॉडल संवेदी बातचीत और ऑप्टोगेंनेटिक अध्ययनों को समायोजित करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है। इस विधि को अन्य निमेटोड प्रजातियों के रसायनसूर्य प्रतिक्रियाओं परखने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

प्रजनन करने वाले जानवरों को कई संवेदी तौर तरीकों से इनपुट को एकीकृत करना चाहिए और उनके पर्यावरण को सफलतापूर्वक नेविगेट करने के लिए उचित व्यवहार रणनीतियों का चयन करना चाहिए। समझना कि बाह्य संवेदी इनपुट कैसे प्राप्त होते हैं और न्यूरोलॉजिकल जानकारी में ट्रांसड्यूस किया जाता है ताकि एक्शन चयन को मार्गदर्शन किया जा सके, न्यूरोबोलॉजी के क्षेत्र में एक केंद्रीय लक्ष्य है। आनुवंशिक रूप से अनुक्रमित निमेटोड, सी। एलिगेंस , एक आकर्षक मॉडल जीव है जिसमें संवेदी जीव विज्ञान और मल्टीमॉडल एकीकरण वाले तंत्रिका तंत्र का अध्ययन किया जाता है। हालांकि सी। एलिगेंस के पास केवल 302 न्यूरॉन्स हैं, यह घुलनशील यौगिकों, वाष्पशील odorants, और परिवेश तापमान ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} सहित पर्यावरण उत्तेजनाओं की एक विस्तृत विविधता के बीच का पता लगा सकते हैं और भेदभाव कर सकते हैं।नीमेटोड सी। एलिगेंस अपने रसायनज्ञों के उपकरण पर निर्भर करता है ताकि वे खाद्य स्रोतों को स्थानीय कर सकें और संभावित खतरों के बारे में सतर्क हो सकें। इस प्रकार, जंगली-प्रकार और उत्परिवर्ती सी की प्रतिक्रियाओं को स्क्रीन करने के लिए डिज़ाइन किए गए व्यवहार एसेज । रासायनिक उत्तेजनाओं के लिए एलिगेंस सी के नीचे जेनेटिक, सेलुलर, और तंत्रिका तंत्रों को विदारक बनाने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । एलिगेंस की उल्लेखनीय संवेदी क्षमताएं

घुलनशील यौगिकों की प्रतिक्रिया परख करने के लिए, तीन प्रकार के assays वर्णित किया गया है - ड्रॉप परीक्षण, chemotaxis परख, और प्रतिधारण परख। ड्रॉप टेस्ट में, यौगिक का एक छोटा बूंद एक चलती कीड़ा की पूंछ पर रखा जाता है और कृत्रिम विच्छेदन के बाद पहुंचने या आगे बढ़ने का निर्णय लेता है ⁴ । ड्रॉप टेस्ट के लिए थोड़ा प्रयोगात्मक तैयारी की आवश्यकता होती है और उपयोगी होता है, जब लेज़र-संचालित कीड़े के मामले में कीड़े का नमूना छोटा होता है। हालांकि, केवल एक कीड़ा के रूप मेंएक समय पर जांच की जा सकती है और प्रयोगकर्ता को परख के पूरे समय में उपस्थित होना चाहिए, ड्रॉप टेस्ट समय लेने वाला हो सकता है ड्रॉप टेस्ट भी एक नमूना के भीतर प्रत्येक कृमि के बीच ड्रॉप डिलीवरी में बदलाव के लिए कमजोर है, जो परख के समग्र परिणामों को प्रभावित कर सकता है। ड्रॉप टेस्ट की एक और सीमा यह है कि इसका उपयोग केवल विकृत यौगिकों के लिए कीड़ा की प्रतिक्रिया पर ही किया जा सकता है क्योंकि कृमि के आगे के आंदोलन से परिसर के आकर्षक या तटस्थ प्रभाव के बीच भेदभाव करना संभव नहीं है।

घुलनशील यौगिकों के लिए कैमोटैक्सिस परख आम तौर पर चार चतुर्भुजों में एक अगर प्लेट को विभाजित करता है, दो विपरीत क्वाड्रंटों के अगर में मिलाया जाने वाला प्रयोगात्मक समाधान और अन्य दो ट्रैक्टर ^{8 , 9} में मिलाया जाने वाला नियंत्रण समाधान। परख की शुरुआत में, कीड़े वाले बफर की एक बूंद को प्लेट के केंद्र में और कीड़े की संख्या में रखा जाता है। प्रत्येक क्वाड्रंट को विभिन्न समय बिंदुओं पर रन बनाए जाते हैं। कीमोटाक्सिस परख ड्रॉप टेस्ट की तुलना में अधिक सांख्यिकीय शक्ति प्रदान करता है क्योंकि प्रत्येक परख में बड़ी संख्या में कीड़े का परीक्षण किया जाता है। हालांकि, इस पद्धति की एक सीमा यह है कि रसायनरोधी परख प्लेटों की तैयारी प्रयोगात्मक परिसर की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है। इससे बड़े पैमाने पर व्यवहार स्क्रीन आयोजित करना मुश्किल हो जाता है अगर सीमित उत्पाद के साथ जटिल शुद्धि प्रक्रिया को ब्याज के चक्र प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, जैसा कि एस्केरोसाइड सिग्नलिंग अणुओं के मामले में ¹⁰ । इसके अलावा, परख के दौरान कीड़े की मैन्युअल गणना गलती की प्रक्रिया के दौरान त्रुटियों के लिए अतिसंवेदनशील होती है और प्लेटों की परेशानी के परिणामों को प्रभावित कर सकती है

दो aforementioned तरीकों के विपरीत, प्रतिधारण परख मशीन दृष्टि का इस्तेमाल करता है, जो स्कोरिंग प्रक्रिया के दौरान त्रुटि को कम करता है और परीक्षा के दौरान प्रयोगकर्ता के हस्तक्षेप को कम करता है > 11 कृमि व्यवहार के वीडियो रिकॉर्डिंग के कम्प्यूटरीकृत विश्लेषण, संभावित रूप से सूक्ष्म व्यवहार की गतिशीलता को प्रकट कर सकते हैं, जब स्कोरिंग केवल कुछ असतत समय बिंदुओं पर ही किया जाता है। प्रतिधारण परख में, दो समाधान स्पॉट को एक छोटे परिपत्र बैक्टीरियल फूड पैच के विपरीत पक्षों पर जोड़ा जाता है, जिसके बाद भोजन पैच के बीच में कीड़े की एक छोटी संख्या की नियुक्ति होती है। कीड़े का व्यवहार तब रिकॉर्ड किया जाता है, विश्लेषण किया जाता है, और प्रत्येक वरीयता क्षेत्र में कृमि पिक्सल की कुल संख्या के आधार पर वरीयता सूचकांक मान की गणना की जाती है। हालांकि एक आकर्षक भोजन पैच की उपस्थिति प्रत्येक परख में उपयोग की जाने वाली कीड़ों की छोटी आबादी को सक्षम बनाता है, पहले से ही घुलनशील प्रत्यारोपण ^{12 के} लिए परिहार व्यवहार को संवेदनशील बनाने के लिए भोजन को दिखाया गया है। इसके अलावा, कीड़े थोड़े तरंगदैर्ध्य प्रकाश के लिए एक photophobic प्रतिक्रिया प्रदर्शित करते हैं और माइक्रोस्कोप प्रकाश स्रोतों का उपयोग जो व्यवहार रिकॉर्डिंग सेटअप में सफेद रोशनी का उत्सर्जन करता है, व्यवहार को प्रभावित कर सकता हैS = "xref"> 13

इस लेख में चर्चा की गई विधि का उद्देश्य जनसंख्या आधारित परख का उपयोग करके घुलनशील यौगिकों के लिए सी। एलिगेंस की प्राथमिकता को रिकॉर्ड और विश्लेषण करना है। इस अंत में, मौजूदा विधि पहले से चर्चा की सभी तीन तरीकों से पहलुओं को एकीकृत और सुधारती है। यह बड़ी संख्या में कीड़े की जांच करने के लिए सक्षम बनाता है और प्रत्येक परख में इस्तेमाल होने वाले प्रयोगिक समाधान के लिए बहुत कम मात्रा में आवश्यक है। इसके अलावा, परख व्यवहार के बारे में कम-तरंगदैर्ध्य प्रकाश के प्रभाव को कम करने के लिए अवरक्त एलईडी बैकलाइटिंग के साथ कस्टम-निर्मित संलग्न वर्तन कक्ष में आयोजित किया जाता है। प्रत्येक कक्ष को कई माइक्रोस्कोप कैमरों के साथ भी लगाया जा सकता है, जो बेंच स्पेस से समझौता किए बिना प्रयोगात्मक थ्रूपुट बढ़ाता है। अंत में, वीडियो विश्लेषण सॉफ्टवेयर समय-समय पर जनसंख्या व्यवहार गतिशीलता को देखने के लिए प्रत्येक वीडियो के लिए वरीयता सूचकांक मान के साथ-साथ एक साथ कीड़ा अधिग्रहण प्लॉट का उत्पादन करता है। कक्ष स्थापना और एकएसएसए प्रोटोकॉल को मल्टीमॉडल व्यवहार प्रतिक्रियाओं जैसे कि odorants या केमोसेंसरी व्यवहार पर तापमान के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

यह लेख व्यवहार कक्ष और परख प्रोटोकॉल के निर्माण का वर्णन करता है। यह ज्ञात घुलनशील रिपेलेंट, तांबा आयनों ⁴ को जंगली प्रकार के कीड़े और केमोसेन्सरी दोषपूर्ण म्यूटेंट की प्रतिक्रिया परखने में इस पद्धति की उपयोगिता को दर्शाता है। अंत में, प्रदान की गई सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए वीडियो विश्लेषण प्रक्रिया विस्तृत है।

Protocol

1. व्यवहार चैंबर विधानसभा

नोट: व्यवहार कक्ष में एक लगभग घन-आकार का फ्रेम शामिल होता है जो स्पष्ट ऐक्रेलिक नीचे और कैमरे का समर्थन करता है, जिसमें अपारदर्शी कपड़े कवर के साथ कवर किया गया extruded एल्यूमीनियम बार होता है। वर्चुअर्ड चैंबर बनाने वाली एक्सट्रूडेड एल्यूमीनियम बार के बीच के जोड़ सभी सीधा होते हैं और "एल" -छोटे गए कोने वाले कोष्ठक (1 इंच चौड़े 1 इंच के पैरों के साथ) का उपयोग कर सुरक्षित होते हैं जो स्कूव और स्लाइड-इन के साथ प्रत्येक बार एक कोने ब्रैकेट पैर को जकड़ देता है टी पागल। प्रत्येक संयुक्त को या तो एक या दो कोने कोष्ठक के साथ सुरक्षित किया गया है जैसा नीचे बताया गया है। फ़ैब्रिक कक्ष के ऊपर कवर होते हैं एक ही शिकंजा के साथ एल्यूमीनियम फ्रेम सलाखों से जुड़े होते हैं और स्लाइड-इन टी-पागल होते हैं लेकिन कपड़े के कोनों में ग्रामेट्स के माध्यम से। शिकंजा स्लाइड-इन टी-नट्स के काउंटरस्कैंक पक्ष में ठीक से सम्मिलित हैं, फैलाने वाले होंठ के साथ की ओर नहीं। एल्यूमीनियम बार में एक स्क्रू / टी-नट फास्टनर असेंबली को जोड़ते समय, टी-अल्ट को चैनल में स्लाइड करेंस्लॉट के बाहर चिपके हुए पेंच के सिर के साथ बार के उचित चेहरे पर

1. कपड़ा कवर को तैयार करें।
   1. कक्ष के शीर्ष और चार पक्षों को कवर करने के लिए अपारदर्शी पॉलिएस्टर कपड़े के पांच टुकड़ों में कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करें।
      1. कक्ष के शीर्ष के लिए एक चौकोर 14 x 14 इंच ² शीट कपड़े काटें। चार आयताकार 11 x 14 इंच के ^दो चादरें कपड़े के किनारों के लिए कट करें
   2. फैब्रिक शीट्स के कोनों में ग्रामट्स स्थापित करें।
      1. एक पेंसिल और सरलीकरण का उपयोग करके सभी पांच पॉलिएस्टर फैब्रिक शीट के प्रत्येक किनारे से एक संदर्भ रेखा 0.5 इंच को चिह्नित करें।
      2. चार आयताकार शीट्स के लिए, ग्रामेट पेयर का उपयोग करें, जहां ग्रामेट्स केंद्रित होते हैं, जहां प्रत्येक कोने में पेंसिल रेखाएं एक दूसरे को छिपती हैं (अर्थात, प्रति शीट 4 ग्रामट)।
      3. स्क्वायर शीट के लिए, प्रत्येक ग्रामेट के साथ प्रत्येक ग्रामेट डालें जिसमें प्रत्येक ग्रामेट पेन्सिल लाइन पर केंद्रित होता है और प्रत्येक के अंत से 1.5 इंच की स्थिति होती हैचार पेंसिल लाइनें (जो कि, 8 ग्रामेट कुल, प्रत्येक कोने के पास दो)
   3. प्रत्येक ग्रामोम छेद में एक स्क्रू डालें और ढीले से प्रत्येक के लिए एक टी-नट संलग्न करें।
2. कैमरा माउंट बार बनाएँ
   1. प्रत्येक कैमरे के लिए एल्यूमीनियम एक्सट्रूज़न बार का एक इंच 2 इंच लंबा टुकड़ा कटौती करने के लिए देखा गया बैंड या इसके बराबर का प्रयोग करें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि बार की कटौती अंत बार विधानसभा के लिए आसानी से बार लंबाई के लिए लंबवत है।
   2. 0.25 इंच व्यास ड्रिल बिट के साथ एक ड्रिल प्रेस का प्रयोग करें प्रत्येक कैमरे के माउंट बार के केंद्र जाल के माध्यम से एक छेद ड्रिल करने के लिए, एक छोर से 0.75 इंच जैसे छेद ऊपर और नीचे के चेहरे पर सीधा है और बार की केंद्र रेखा के माध्यम से गुजरता है । वैकल्पिक रूप से, एक 0.25 इंच ड्रिल बिट के साथ हाथ में बिजली के ड्रिल का उपयोग करके छेद ड्रिल करें, लेकिन सुनिश्चित करें कि छेद बार के ऊपर और नीचे के चेहरे पर लंबवत है।
3. सभी कोने कोष्ठक तैयार करें।
   1. छेद के माध्यम से एक स्क्रू डालेंप्रत्येक कोने वाले कोष्ठक पैर, अंदर की ओर से स्क्रू डालना लापरवाही से प्रत्येक स्क्रू पर टी-अखरोट डालें
4. कैमरा माउंट असेंबली तैयार करें ( चित्रा 1 बी , परत 2)।
   नोट: कैमरा माउंट असेंबली एक "एच" -सैप्ड असेंबली है जो तीन कैमरा हॉल्स्टर्स का समर्थन करता है।
   1. कैमरा माउंट असेंबली के केंद्र बार में कैमरा माउंट बार अटैच करें।
      1. तीन कैमरे माउंट सलाखों को चरण 1.2 में खड़ी होकर खड़ी होकर लगाया गया हो। ड्रॉल्ड छेद से छोर के अंत में प्रत्येक माउंट बार के किनारे पर दो कोने कोष्ठक पर्ची करें
      2. कोष्ठकों के पैरों के साथ कोने के कोष्ठक को पट्टी के अंत के साथ फ्लश करें और जगह में सुरक्षित होने के लिए शिकंजा कस लें। यह "टी" के निचले भाग में ड्रिल छेद के साथ एक "टी" आकार बनाता है।
      3. काम की सतह पर 1 फुट एल्यूमीनियम एक्सट्रूज़न रखना एक कैमरा माउंट बार asse के टी-पागल पर्ची1 फुट बार के एक तरफ mbly (पिछले चरण से) 1 फुट बार की लंबाई के साथ माउंट बार को केंद्र और जगह में सुरक्षित रहने के लिए शिकंजा कस कर। 1 फुट बार के विपरीत दिशा में दूसरी दो माउंट बार खिसकाएं
      4. 1-पैर की पट्टी के मध्य से दो बार समीपस्थित करें, उनके आंतरिक कोने में करीब 2.5 इंच के कोष्ठक होते हैं। पट्टी के प्रत्येक छोर पर 1-पट्टी के किनारों पर कोने के कोष्ठक को ढंकना। कोष्ठकों के पैरों के साथ कोने के कोष्ठक को पट्टी के छोर से फ्लश करें और जगह में सुरक्षित होने के लिए शिकंजा कस लें।
   2. केंद्र बार में अंत की सलाखों को संलग्न करें
      1. पिछली चरण से एक "एच" आकार के गठन से विधानसभा के प्रत्येक छोर पर टी-नट्स पर दो 1 फुट एल्यूमीनियम एक्सट्रूज़न पर्ची। केंद्र पट्टी पर प्रत्येक अंत बार केंद्र और चार शिकंजा कस द्वारा सुरक्षित।
      2. प्रत्येक छोर पर एक, पिछले चरण में जोड़े गए दो अंत की सलाखों के शीर्ष पर चार कोने कोष्ठक पर्ची करेंप्रत्येक बार की कोष्ठकों के पैरों के साथ कोने के कोष्ठक की स्थिति पट्टियों के छोर से फ्लश करती है और जगहों को सुरक्षित रखने के लिए शिकंजा को कस कर देती है।
   3. कैमरा माउंट असेंबली में कैमरा खड़ा है और हॉलीस्टर्स संलग्न करें।
      1. तीन माइक्रोस्कोप कैमरों में से प्रत्येक के लिए, थैम्बस्रीव को ढकाकर और स्टड रॉड को स्लाइड करके कैमरा पिस्तौलूर निकालें।
      2. प्रत्येक कैमरा माउंट बार (अब "एच" के केंद्र पट्टी पर सुरक्षित) के लिए, एक वॉयरर को गोल-सिर स्क्रू पर रखें, कैमरा माउंट बार में ड्रिल छेद के माध्यम से स्क्रू करें और स्क्रू पर एक और वॉशर नीचे रखें । कैमरे के टैप छिद्र को स्क्रू पर स्टड रॉड नीचे डालें, कैमरा माउंट बार के खिलाफ सुरक्षित रूप से कस लें।
      3. दूसरे दो कैमरे के माउंट बार के लिए चरण 14.3.2 दोहराएं।
      4. प्रत्येक कैमरा स्टैंड रॉड पर कैमरे के पिस्तौलदान को पर्ची करके कैमरे के माउंट बार और स्क्रू की तरफ बढ़ते हुए खोलें। अस्थायी रूप से पिस्तौलदान कैमरा स्टैंड आरपिस्तौलदान के अंगूठे के साथ ओड
         नोट: अंतिम परिचालन स्थिति अनुभाग 2 में सेट की जाएगी
5. व्यवहार कक्ष फ्रेम ( चित्रा 1 ए ) को इकट्ठा करें।
   नोट: निर्माण की आसानी के लिए, कार्य की सतह पर चित्रा के फ्रेम ( चित्रा 1 बी , परत 1) की "शीर्ष" से शुरुआत और फ्रेम के "पैर" ( चित्रा 1 बी , परत की तरफ ऊपर की ओर) ऊपर की तरफ फ्रेम उल्टा करने के लिए इकट्ठा करें 3)।
   1. व्यवहार कक्ष के ऊपर की परत को इकट्ठा करने के लिए, चार 1-फुट एक्सट्रूडेड एल्यूमीनियम बार को स्क्वायर पॉलिएस्टर शीट ( चित्रा 1 बी , लेयर 1) में संलग्न करें।
      1. फैब्रिक शीट के प्रत्येक छोर के साथ दो टी-नटों पर एक बार स्लाइड करें, कपड़े की चौड़ाई के साथ बार को केंद्रित करना। फास्टनर को प्रत्येक बार कपड़े शीट को सुरक्षित करने के लिए कस कर।
      2. काम की सतह पर चौकोर पॉलिएस्टर शीट फैलाएंशीर्ष पर चार संलग्न एल्यूमीनियम बार। चार बार एल्यूमीनियम की सलाखों के ऊपरी हिस्से पर आठ कोने कोष्ठक पर्ची, प्रत्येक बार के प्रत्येक छोर पर एक। सलाखों के किनारों के साथ ब्रैकेट के ऊर्ध्वाधर पैर फ्लश के साथ सलाखों के कोने वाले कोष्ठ की स्थिति। टी-पागल में शिकंजा को कसने से सुरक्षित।
   2. प्रत्येक कोने में बदले में, एक अतिरिक्त 1 फुट एल्यूमीनियम एक्सट्रूज़न सीधे खड़े होकर, दो कोने वाले कोष्ठक पैरों पर टी-नट्स पर एक्सट्रूज़िंग फिसलते हैं।
   3. फास्टनर को कस करके क्षैतिज सलाखों के लिए सीधे पट्टी सुरक्षित करें, इस प्रकार दो आसन्न क्षैतिज सलाखों में शामिल होकर
      नोट: पूरा होने पर, आठ निकास (चार क्षैतिज और चार ऊर्ध्वाधर) तालिका पर एक चौकोर अंगूठी बनाकर चार पदों को ऊपर की ओर चिपकाएगा ( चित्रा 1 बी , परत 1)।
   4. पिछला चरण से फ्रेम के ऊपरी भाग में नीचे खंड 1.4 से "एच" - आकार वाले कैमरा माउंट विधानसभा के ढीले टी-पाप्स पर्ची करें। "एच एंड #"34; फ्रेम के प्रत्येक कोने पर कोने कोष्ठक के ऊपर आराम करने के लिए सभी तरह से नीचे निकल जाओ। चार कोने ब्रैकेट स्क्रू को कस करके कैमरे को माउंट असेंबल रखें।
   5. अंतिम चार 1 फुट extruded एल्यूमीनियम सलाखों ( चित्रा 1 बी , परत 3) का उपयोग कर कक्ष के नीचे की परत इकट्ठा।
      1. प्रत्येक 1-फुट बार के प्रत्येक छोर पर एक कोने ब्रैकेट पर्ची करें, ब्रैकेट के पैरों के साथ कोने कोष्ठक की स्थिति पट्टी के छोर से फ्लश करें और जगह में सुरक्षित होने के लिए स्क्रू को कस लें।
      2. उतार चढ़ाव के चैनलों में ढीले टी-नट के साथ फ्रेम उतार-चढ़ाव के बीच सलाखों को पर्ची करें। सलाखों की स्थिति में अपने कोने के कोष्ठकों के शीर्ष किनारों को ऊपरी भाग के खुले अंत से 1 इंच नीचे और कोने ब्रैकेट स्क्रू को कसने से सुरक्षित रखें।
6. चार आयताकार पॉलिएस्टर शीट्स के टी-पागल को सीधे चक्की के किनारों को कवर करने के लिए ईमानदार एक्सट्रूज़न बार पर चैनलों में स्लाइड करें।आर और फास्टनरों को जगह में सुरक्षित करने के लिए कसने।
7. चैम्बर के आंतरिक भाग तक पहुंचने के लिए एक तरफ का चयन करें और कक्ष के निचले स्तर पर दो शिकंजा और टी-पागल निकाल दें।
   नोट: जब फ्रेम सही हो जाता है, इस कवर के नीचे तल पर ढीले लटका रहता है और कक्ष के इंटीरियर तक पहुंचने के लिए उठाया जा सकता है
8. प्रत्येक कोने के सदस्य के शीर्ष अंत पर एक प्लास्टिक की टोपी रखें, जो पूरे फ्रेम के लिए पैर के रूप में काम करे। फ़्रेम दाएं-साइड-अप करें फ़्रेम के बेस परत के अंदर प्रति पैनल दो धारकों को घुमाएं और उन्हें जगह में सुरक्षित करने के लिए ( चित्रा 1 बी , परत 3)। परख प्लेटों ( चित्रा 1 बी , परत 3) के लिए एक मंच प्रदान करने के लिए पैनल धारकों के शीर्ष पर एक 12 x 12 इंच ² टुकड़ा स्पष्ट एक्रिलिक रखें।

2. कैमरा और स्टेज टेम्पलेट स्थिति निर्धारण

1. कंप्यूटर पर माइक्रोस्कोप कैमरा वीडियो अधिग्रहण सॉफ्टवेयर को डाउनलोड और इंस्टॉल करेंनिर्माता की वेबसाइट से
2. कैमरा ऑप्टिक्स के साथ तीनों कैमरे के प्रत्येक हॉरस्टर्स में माइक्रोस्कोप कैमरा स्लिप करें ऐक्रेलिक चरण और बैक लाइट की तरफ इशारा करते हैं। कैमरे के कंप्यूटर के यूएसबी पोर्ट से कनेक्ट करें मंच के नीचे स्थित अवरक्त एलईडी बैकलाइट पैनल को फ्रेम के नीचे स्थित करें। चालू करने के लिए बैकलाइट पैनल में प्लग करें।
3. पारदर्शिता पत्रक पर उपलब्ध समाधान-प्लेसमेंट और प्लेट-संरेखण टेम्पलेट प्रिंट करें ( पूरक फाइल देखें)।
   नोट: समाधान-प्लेसमेंट टेम्पलेट पर, प्लेट परिधि चक्र व्यास में 3.8 सेंटीमीटर है और ब्याज सर्कल के भीतर का क्षेत्र व्यास में 0.9 सेंटीमीटर है।
4. परिपत्र टेम्पलेट्स को संलग्न करते हुए आयताकार पारदर्शिता वाले टुकड़े प्राप्त करने के लिए ग्रिडलाइन के साथ कट करें।
5. वीडियो अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें और कैमरे के फ़ीड देखने के लिए खिड़की के शीर्ष पर गिने हुए थंबनेल पर क्लिक करें
6. माइक्रोस्कोप कैमरा संरेखण और बढ़ाई समायोजित करें।
7. एक माइक्रोस्कोप कैमरा लेंस ( चित्रा 2 बी ) के तहत एक प्लेट-संरेखण टेम्पलेट स्थिति।
8. कैमरे की स्टड रॉड के साथ कैमरा पिस्तौलिका को खड़ी करके खड़ी स्लाइड करें और कैमरे के आवर्धन डायल को घूर्णन करके कैमरे की बढ़ाई को समायोजित करके टेम्पलेट के नंबर मार्कर स्पष्ट रूप से कैमरे के क्षेत्र के देखने के किनारों पर दिखाई देने से दूरी को बदलें।
9. एक्रिलिक चरण के लिए प्लेट-संरेखण टेम्पलेट टेप करें
10. माइक्रोस्कोप कैमरे के नीचे थाली-संरेखण टेम्पलेट पर कीड़े की एक नमूना प्लेट रखें और मैग्निफिकेशन और काम की दूरी को परिष्कृत करें जब तक कीड़े की एक तेज छवि तब तक हासिल नहीं हो पाती जब तक कि दृश्य के क्षेत्र में नंबर मार्कर को बनाए रखा जा सके।
11. दूसरे दो माइक्रोस्कोप कैमरों के लिए चरण 2.6.1-2.6.4 दोहराएं।

3. नेमेटोड ग्रोथ और सिंक्रनाइज़ेशन

1. प्रयोगों से चार दिन पहले, बीस-चौदह 60 मिमीनिमेटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) अगर 50 लीटर एलपीएल के ल्यूरिआ-बर्टानी (एलबी) शोरबा में एस्चेरिचिया कोलाई के साथ प्लेट (देखें नुस्खा के लिए अनुभाग 5)।
   नोट: प्रत्येक 60 मिमी प्लेट एक परख प्लेट के लिए पर्याप्त कीड़े प्रदान करेगी। प्रति इलाज या जीनोटाइप प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है।
2. कमरे के तापमान पर रातोंरात, लिड्स के साथ सीधा को सूखा करने के लिए वरीयता वाले प्लेटों को छोड़ दें
3. अगले दिन, हर वरीयता प्राप्त प्लेट पर पंद्रह अच्छी तरह से तंग ग्रैविद hermaphrodites हस्तांतरण और कीड़े छह घंटे के लिए अंडे देना अनुमति देते हैं। यह प्रति प्लेट 360 अंडे अंडे देगा।
4. 6 घंटे के बाद, वरीयता वाले प्लेटों से कीड़े हटा दें और दोपहर को 20 डिग्री सेल्सियस पर वयस्कों में तीन दिनों तक बढ़ो।

4. कैमोसेंसरी पसंद परख

1. प्रयोग के पहले दिन, 35 मिमी एनजीएम अगर परख प्लेटें तैयार करें।
   1. 250 एमएल एनजीएम अगर तैयार करें (नुस्खा के लिए अनुभाग 5 देखें)।
   2. फ्लैट सू पर पांच या उससे कम के ढेर में अट्ठाईस खाली 35 मिमी प्लेट्स की व्यवस्था करेंrface। 5 एमएल एनजीएम अगर के साथ प्रत्येक परख प्लेट भरें। कमरे के तापमान पर रातोंरात, ढक्कन के साथ ईमानदार शुष्क करने के लिए परख प्लेटें छोड़ दें।
      नोट: अंगूठे के नियम के रूप में, प्रत्येक इलाज के लिए एक अतिरिक्त परख प्लेट तैयार करें या आकस्मिकताओं के मामले में जीनोटाइप परख लें।
2. प्रयोग के दिन, बैकलाइट को चालू करें, कंप्यूटर को बूट करें, और माइक्रोस्कोप कैमरा वीडियो कैप्चर सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें।
3. कंप्यूटर पर एक माइक्रोस्कोप कैमरा कनेक्ट करें और वीडियो रिकॉर्डिंग सेटिंग समायोजित करें।
   1. कैमरे के लाइव फीड को देखने के लिए सॉफ्टवेयर विंडो के शीर्ष पर गिने गए कैमरा थंबनेल पर क्लिक करें।
   2. कैमरा फीड के शीर्ष बाएं कोने में 'वीडियो प्रारूप' मेनू को खींच कर 'MJPG 1280 x 1024' चुनें। 'वीडियो प्रारूप' मेनू के बगल में 'फ़ोल्डर' मेनू को दबाएं और उस वीडियो का चयन करें जिसमें वीडियो फ़ाइलों को सहेजना है।
   3. के शीर्ष दाएं कोने पर 'ऑटो एक्सपोजर' आइकन पर क्लिक करेंकैमरे का फीड और ऑटो-एक्सपोजर को बंद करना। इनबिल्ट माइक्रोस्कोप कैमरा एल ई डी को बंद करने के लिए 'ऑटो एक्सपोजर' आइकन के दाईं ओर तुरंत 'एलईडी' आइकन पर क्लिक करें। निकटवर्ती 'सेटिंग्स' आइकन पर क्लिक करें: 'मोनोक्रोम' का चयन करें, अधिकतम 'कंट्रास्ट' चुनें, और 'चमक' को समायोजित करें जब तक कीड़े पृष्ठभूमि से अलग न दिखाई दें।
4. कैलिब्रेशन वीडियो प्राप्त करें
   1. मंच प्लेट-संरेखण टेम्पलेट ( चित्रा 2 ए ) के शीर्ष पर समाधान-प्लेसमेंट टेम्पलेट संरेखित करें। कैमरा फीड के बाईं तरफ 'टाइम-लोपेड वीडियो' रिकॉर्डिंग आइकन पर क्लिक करें और 1 फ्रेम / एस पर 5 सेकंड के वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए अवधि के लिए '5' और '1' को दर्ज करें वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए 'प्रारंभ' पर क्लिक करें
5. दूसरे दो माइक्रोस्कोप कैमरों के लिए 4.3 और 4.4 में चरण दोहराएं।
6. कक्ष से समाधान-प्लेसमेंट टेम्पलेट निकालें
8. सिंक्रनाइज़ कीड़े की एक प्लेट में 1.2 एमएल एनजीएम बफर को जोड़ने के लिए 5 एमएल ग्लास विंदुक का प्रयोग करें और बफर में कीड़े को स्थानांतरित करने के लिए धीरे से प्लेट को आंदोलन करें। प्लेट से बफर को पिपेट करें और बफर में एक साफ माइक्रोसेंट्रिविज ट्यूब में कीड़े बांटना।
   नोट: कृमि उनके संवर्धन अगर नमक एकाग्रता ¹⁴ से विचलन के प्रति संवेदनशील हैं। कृमि प्लेसमेंट के बाद अगर नमक एकाग्रता में परिवर्तन को कम करने के लिए, धोने की प्रक्रिया के लिए एनजीएम बफर का उपयोग करने की सलाह दी जाती है (विधि के लिए अनुभाग 5 देखें)। प्लेटों से कीड़ों को हटाने के लिए प्लास्टिक की पिपेट का प्रयोग न करें, क्योंकि कीड़े पक्षों के साथ चिपके रहेंगे। एक साथ चलाने के लिए परख प्लेटों की संख्या के रूप में एक समान संख्या में ट्यूबों को तैयार करें।
9. तीन ट्यूबों को 1-2 मिनट के लिए खड़े होने दें, जो कीड़े को नीचे तक व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें। एग्रीगेट की गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना संभवतः ट्यूबों से धोने वाले बफर को हटाने के लिए प्लास्टिक विंदुक टिप का उपयोग करें।ट्यूबों के नीचे एड कीड़े। 1 एनएलएम स्वच्छ एनजीएम बफर के साथ ट्यूबों को भरें।
10. चरण 4.7.2 दोबारा दोहराएं।

प्लेटों परख करने के लिए 10 मिमी क्यूक ₂ और एम 13 बफर समाधान जोड़ें (व्यंजनों के लिए अनुभाग 5 देखें)।

1. विदारक खुर्दबीन के चरण के ऊपर एक समाधान-प्लेसमेंट टेम्पलेट टेप करें।
2. प्लेट-संरेखण टेम्पलेट के दोनों तरफ डबल-पक्षीय टेप की एक पट्टी रखें। सुनिश्चित करें कि टेप प्लेट परिधि सर्कल के साथ ओवरलैप करता है लेकिन टेम्पलेट के बीच में ब्याज की रिकॉर्डिंग क्षेत्र को रोकता नहीं है।
3. प्लेट-संरेखण टेम्पलेट पर सर्कल के साथ परख प्लेट की परिधि संरेखित करें और जब तक टेम्पलेट प्लेट के निचले हिस्से का पालन नहीं करता तब तक दबाएं। विदारक माइक्रोस्कोप पर समाधान प्लेसमेंट टेम्पलेट मार्कर के साथ परख प्लेट टेम्पलेट नंबर मार्कर को संरेखित करें।
4. क्वार्टरों 1 और 4 में प्रत्येक एम 3 बफर के 1 μL को स्थानांतरित करने के लिए पी 2 विंदुक और प्लास्टिक की टिप का उपयोग करें चित्रा 2 ए ) में प्रत्येक 1 μL 10 मिमी क्यूक ₂ समाधान के स्थान पर एक नई टिप का उपयोग करें।
5. अन्य दो परख प्लेटों के लिए चरण 4.8.2-4.8.4 दोहराएं।

एक बार समाधान बूंदों को पूरी तरह से अगर में अवशोषित कर लेता है, तो प्रत्येक माइक्रोसॉसिटर्यूव्यू ट्यूब से इसी परख प्लेट के लिए धोया कीड़े बदलने के लिए एक गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।

परिपत्र इलाज क्षेत्र के ऊपर और नीचे के क्षेत्र में प्रत्येक कीड़े की एक बूंद रखें। एक ऊतक चार गुना मोड़ो और सभी परख प्लेटों पर अतिरिक्त वॉश बफर को अवशोषित करने के लिए कुंद का उपयोग करें।

टेम्प्लेट कोनों में नंबरों को संरेखित करके व्यवहार कक्ष में माइक्रोस्कोप कैमरों के नीचे तीन परख प्लेटें तुरंत व्यवस्थित करें। 2-3 मिनट की प्रतीक्षा करें ताकि कीड़े को परख प्लेटों में घुसने की अनुमति मिल सके।
नोट: सुनिश्चित करें कि अगले चरण में वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले व्यवहार कक्ष का दरवाजा फ्लैप बंद हो गया है।

परख प्लेटों के अगले दौर के लिए चरण 4.7-4.12 दोहराएं। प्रत्येक उपचार या जीनोटाइप के लिए कम से कम छः प्रतिकृति या रिकॉर्डिंग के दो दौर प्राप्त करें।

5. अभिकर्मक तैयारी

1. एनजीएम अगर और बफर तैयार करें
   1. 1 एल कांच की बोतल में, 1.5 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 8.5 ग्राम अगर और पेप्टाफोन की 1.25 ग्राम जोड़ें। आसुत पानी के 500 एमएल और बोतल के लिए एक हलचल बार जोड़ें। सामग्री के साथ आटोक्लेव बोतल
   2. एक हलचल प्लेट पर बोतल रखें और हलचल फ़ंक्शन पर स्विच करें।
   3. बाँझ तकनीक का उपयोग कर क्रम में जोड़ें: 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल का 0.5 एमएल, 1 एम कैल्शियम का 0.5 एमएलक्लोराइड, 1 एम मैग्नीशियम सल्फेट के 0.5 एमएल, और 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट के 12.5 एमएल।
   4. एनजीएम बफर बनाने के लिए चरण 5.1.1 से 5.1.2 को दोहराएं लेकिन चरण 5.1.1 में अगर और पेप्टाफोन छोड़ दें।
2. एलबी शोरबा तैयार करें
   1. 1 एल कांच की बोतल में, 5 ग्राम ट्रिप्टन, 2.5 ग्राम खमीर निकालने, 2.5 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 500 एमएल डिस्टिल्ड वॉटर, और 0.5 एमएल 1 एन सोडियम हाइड्रॉक्साइड जोड़ें। सामग्री के साथ आटोक्लेव बोतल
3. एम 13 बफर तैयार करें
   1. 1 एल कांच की बोतल में, ट्रिस के 1.817 ग्राम, सोडियम क्लोराइड की 2. 9 22 ग्राम, पोटेशियम क्लोराइड के 0.373 ग्राम और आसुत पानी का 500 एमएल जोड़ें। सामग्री के साथ बोतल आटोक्लेव करें
4. तांबा क्लोराइड (क्यूक ₂ ) समाधान तैयार करें
   1. क्यूक _{2 के} 0.134 ग्राम वजन करें 100 एमएम क्यूक ₂ स्टॉक सोल्यूशन बनाने के लिए 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में 10 एमएल ऑफ एम 13 बफर को मिलाकर जोड़ें। प्लास्टिक की ट्यूब को तब तक उलटा दें जब तक कि सभी सॉल्व्यू में न होlved।
   2. एक सिरिंज का उपयोग करें और 0.2 एमएल झिल्ली फ़िल्टर को एक शुद्ध 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में 100 मिमी क्यूक ₂ समाधान को शुद्ध करने के लिए फ़िल्टर करें।
   3. 10 मिमी क्यूक ₂ समाधान बनाने के लिए, 900 माइक्रोन एम 13 बफर और 100 माइक्रोन का 100 एमएम क्यूक ₂ स्टॉक समाधान को एक माइक्रोप्रोसेफ्यूज ट्यूब में जोड़ें। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए microcentrifuge ट्यूब उलटना

6. वीडियो विश्लेषण

1. पायथन 3 (https://www.python.org/downloads/) और ओपनसीवी सॉफ्टवेयर लायब्रेरी (http://opencv.org/downloads.html) डाउनलोड करें।
2. विश्लेषण के लिए तीन पायथन स्क्रिप्ट डाउनलोड करें (https://github.com/WormLabCaltech/ResidentWorm)।
   नोट: आगे बढ़ने से पहले सुनिश्चित करें कि सभी वीडियो फ़ाइलों को उपयोग करने के लिए mp4 प्रारूप में हैं
3. फ़ंक्शन और पैरामीटर विवरण देखने के लिए, कंसोल में 'सहायता (फ़ंक्शन नाम दर्ज करें)' टाइप करें और एंट दर्ज करें। उदाहरण के लिए, 'सहायता (अंशांकन)' टाइप करें और एंट दर्ज करें।
4. अंशांकन समारोह निष्पादित करेंरुचि के वीडियो क्षेत्रों को परिभाषित करने के लिए इनपुट पैरामीटर के साथ
   1. चर 'mp4filename' के लिए धारा 4 में लिया गया अंशांकन वीडियो का फ़ाइल नाम दर्ज करें फ़ाइल नाम दर्ज करते समय उद्धरण अंक शामिल करें
   2. 'Q * x' और 'Q * y' चर के लिए मूल्य 600 और 360 के साथ शुरू करें * क्वाड्रंट नंबर 1 से 4 तक लिखें। 'राड' वेरिएबल के लिए मान 310 से प्रारंभ करें। वेरिएंबल मान समायोजित करें जब तक कि आरओआई मास्क टेम्प्लेट पर चतुर्भुज की रूपरेखा के साथ संरेखित न करें।
   3. इस फ़ंक्शन के निष्पादन पर कंसोल में प्रत्येक आरओआई में कुल पिक्सल दर्ज करें जो कंसोल में मुद्रित किए जाएंगे। Preference_index फ़ंक्शन में 'ROI_size' पैरामीटर के लिए यह मान इनपुट करें
5. उचित थ्रेशोल्डिंग स्थिरता निर्धारित करने के लिए threshold_constant फ़ंक्शन निष्पादित करें। 'निरंतर' मान समायोजित करें जब तक कीड़े (सफ़ेद) को स्पष्ट रूप से नहीं देखा जा सकता है और पृष्ठभूमि में न्यूनतम नमक और काली मिर्च शोर होता है (काली)।
6. एक सीएसवी डेटाशीट, वीडियो की वरीयता सूचकांक, और साथ में कीड़ा अधिभोग की साजिश के निर्माण के लिए वरीयता_इनएक्स फ़ंक्शन निष्पादित करें।
   1. Preferences_index फ़ंक्शन के लिए इनपुट पैरामीटर के रूप में 'Q * x', 'Q * y', 'rad', 'ROI_size', और 'निरंतर' मानों का उपयोग 6.4 और 6.5 चरणों के अनुसार करें।
      नोट: प्रत्येक वीडियो फ्रेम के लिए, preference_index फ़ंक्शन प्रत्येक आरओआई में कीम पिक्सेल की संख्या की गणना करता है और आरओआई पिक्सल की कुल संख्या में से कीड़ा पिक्सल के प्रतिशत की गणना करता है। फ़ंक्शन फिर सूत्र का उपयोग करके प्रत्येक वीडियो फ़्रेम के लिए वरीयता सूचकांक मान बनाता है:
      
      नोट: एक बार प्रोग्राम ने वीडियो में सभी फ़्रेम का विश्लेषण किया है, तो वीडियो के लिए एक औसत वरीयता सूचकांक मान तैयार किया गया है। वीडियो की वरीयता सूचकांक के साथ एक कीड़ा अधिभोग की साजिश जिसमें शीर्ष पर मुद्रित किया गया है और साथ ही एक सीएसवी डेटाशीटवर्म पिक्सेल, प्रतिशत कीड़ा अधिभोग मान, और प्रत्येक वीडियो फ़्रेम के लिए वरीयता सूचकांक नामित फ़ोल्डर में सहेजा जाएगा जब कार्यक्रम समाप्त हो जाएगा।

Representative Results

चित्रा 3 ए अलग जीनोटाइप और उपचार जोड़ी के लिए प्राप्त वरीयता सूचकांक मूल्यों को दर्शाता है। 1 का वरीयता सूचकांक मूल्य प्रायोगिक आरओआई में रखा समाधान के लिए मजबूत आकर्षण का संकेत देता है, जबकि -1 का वरीयता सूचकांक मूल्य मजबूत प्रतिकर्षण को दर्शाता है। 0.02 की वरीयता सूचकांक प्राप्त किया गया था जब एम 13 बफर समाधान को नियंत्रण और प्रायोगिक ROI दोनों में रखा गया था, यह दर्शाते हुए कि आरओआई के लिए कोई स्थानिक पूर्वाग्रह नहीं है एन 2 कीड़े दृढ़ता से तांबे के आयनों से बचना -0.67 के वरीयता सूचकांक के परिणामस्वरूप, जो पिछले निष्कर्षों की पुष्टि करता है कि तांबे के आयनों को मजबूत प्रत्यारोपण ( अनुपूरक मूवी 1 ) ^{4 है} । ओएसएम -3 म्यूटेंट, जो संवेदी सिलीया के बाहर के क्षेत्रों के समुचित गठन का अभाव है, ने तांबे के आयनों (पीआई = -0.1 9) ^{15 की} एक महत्वपूर्ण गिरावट देखी। ओसीआर -2 म्यूटेंट, जो डी हैं तांबे की परिस्थितियों सहित कई एएसएच-मध्यस्थता वाले nociceptive प्रतिक्रियाओं में fective, भी काफी कम परिहार और तांबा आयनों (पीआई = 0.19) ( पूरक मूवी 2 ) ^{16 के} लिए कुछ हल्के आकर्षण प्रदर्शित करता है।

चित्रा 3 बी प्रतिनिधि कृमि अधिभोग भूखंड दिखाता है, जो प्रत्येक वीडियो में समय के साथ प्रयोगात्मक आरओआई बनाम नियंत्रण में कीड़े का घनत्व दर्शाता है। साजिश क्षेत्र के रंग का गहरा रंग, आरओआई में कीम पिक्सेल की संख्या अधिक है एम 13 बफर नियंत्रण के साथ इलाज किए गए N2 कीड़े के कब्जे की साजिश से पता चलता है कि दोनों ROI में कीड़े की संख्या परख के समान ही है। हालांकि, तांबा आयनों के उपचार के लिए एन 2 कीड़े का अधिग्रहण प्लॉट इंगित करता है कि कीड़े पूरी तरह से परख के दौरान प्रायोगिक रॉय से बचें।

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चित्रा 1: फोटो और व्यवहार चैंबर डिजाइन के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। ( ए ) व्यवहार चैम्बर सेटअप (बाएं) के सामने का दृश्य और कक्ष फ्रेम के सही योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (दाएं) अपारदर्शी पॉलिएस्टर शीट नीचे चेहरे को छोड़कर सभी चेहरे पर कक्ष को लगाते हैं, जो अवरक्त बैकलाइट पैनल से प्रकाश की अनुमति देता है। नंबर 1, 2, और 3 (बी) में एक्सट्रूज़न परतों के अनुरूप हैं। ( बी ) एक्सट्रूज़न परतों के शीर्ष दृश्य के व्यवहार जिसमें व्यवहार कक्ष फ्रेम शामिल है इसमें शीर्ष परत (1), बीच का कैमरा माउंट असेंबली परत (2), और नीचे चरण स्तर (3) शामिल है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 2: समाधान-प्लेसमेंट और प्लेट-संरेखण टेम्पलेट्स ( ए ) समाधान-प्लेसमेंट टेम्पलेट में चार ट्रैक्टर और नंबर संरेखण मार्कर हैं। नियंत्रण समाधान ऊपरी बाएं और नीचे सही चतुष्कोणुओं में रखा गया है जबकि प्रायोगिक समाधान ऊपरी दाएं और नीचे बाईं चतुर्भुज में रखा गया है। ( बी ) वीडियो-रिकॉर्डिंग और विश्लेषण के दौरान देखने के क्षेत्र में कीड़ों के अवरोध को कम करने के लिए प्लेट-संरेखण के टेम्पलेट में केवल संख्या संरेखण मार्कर हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 3: इस परख का उपयोग करके एकत्र किया गया उदाहरण डेटा ( ए ) जंगली-प्रकार एन 2 और उत्परिवर्ती सी एलिगेंस के लिए प्राथमिकता सूचकांक (पीआई) मान एम> एम 13 बफर और 10 मिमी क्यूक ₂ के जवाब में एन 2 कीड़े नियंत्रण और प्रायोगिक आरओआई के बीच कोई वरीयता नहीं दिखाते हैं, जब एम 3 नियंत्रण समाधान आरओआई दोनों में रखा गया था, लेकिन तांबे के आयनों (पीआई = 0.02 और -0.67, क्रमशः) में रखा गया था, लेकिन जोरदार प्रयोगात्मक आरओआई से बचा। ओएसएम -3 (पी 802) म्यूटेंट्स और ओसीआर -2 (एके 47) म्यूटेंट ने एन 2 (पीआई = -0.1 और 0.2, क्रमशः) की तुलना में तांबा आयनों में काफी कमी की है। प्रत्येक जीनोटाइप-ट्रीटमेंट युग्मन के लिए N = 6 assays,> 360 कीड़े प्रति परख, त्रुटि सलाखों से संकेत मिलता है ± 1 एसईएम, *** पी <0.001, एकमात्र एएनओवीए बाद-तह, ईमानदारी से महत्वपूर्ण अंतर (एचएसडी) परीक्षण के बाद। ( बी ) प्रायोगिक आरओआई (नीचे) में नियंत्रण आरओआई और तांबा आयनों में एम 13 बफर के साथ आरओआई (शीर्ष) और एन 2 कीड़े दोनों में एम 13 बफर के साथ एन 2 कीड़े के लिए प्रतिनिधि कृमि अधिभोग भूखंड। प्रत्येक अधिभोग भूखंड के नीचे के रंग का आकार कृमि पिक्सेल की संख्या को दर्शाता है।Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक मूवी 1: एनएमआई कीड़े का 10 मिमी कॉपर क्लोराइड के व्यवहारिक जवाब। एमएफई बफर (ऊपरी बाएं और नीचे दाएं) के साथ कीड़े नियंत्रण क्वैड्रंट्स से आकर्षित होते हैं, लेकिन एम 13 बफर (ऊपरी दाएं और नीचे बाएं) में भंग होने वाले तांबा आयनों वाले क्वांट्रंटों से बहुत अधिक सावधानी से बचें। वीडियो को 1 फ्रेम प्रति सेकेंड में रिकॉर्ड किया गया था और 15x तक तेजी आई थी कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक मूवी 2: ओसीआर -2 (एके 47) की कृमि को 10 मिमी कॉपर क्लोराइड के व्यवहारिक प्रतिक्रिया । वॉम्स एम 13 बफर (ऊपरी बाएं और नीचे दाएं) और चतुर्भुज दोनों के साथ नियंत्रण चौगुनी दोनों में लगभग बराबर हद तक घूमते हैंरिकॉर्डिंग अवधि भर में एम 13 बफर (ऊपरी दाएं और नीचे बाएं) में भंग होने वाले तांबा आयनों वाले म्यूटेंट रिकॉर्डिंग की शुरुआत में तांबे के आयनों वाले क्वाटरों के लिए थोड़ी प्राथमिकता दिखाते हैं। वीडियो को 1 फ्रेम प्रति सेकेंड में रिकॉर्ड किया गया था और 15x तक तेजी आई थी कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल: समाधान-प्लेसमेंट और प्लेट-संरेखण टेम्पलेट कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि परख प्लेटों के विभिन्न प्रयोगात्मक दिनों में सूखने का एक सुसंगत स्तर है। अलग सूखापन के स्तर के परिणामस्वरूप अगर अगर समाधान में अलग-अलग प्रसार दरों का परिणाम होगा और फलस्वरूप, व्यवहारिक परिणाम में भिन्नता होगी। इस प्रकार, परख प्लेटों को प्रयोगों से पहले दोपहर को ताज़ा करना चाहिए। उपचार के बीच की तुलना में आसानी के लिए प्रति परख परीक्षण कीड़े की संख्या को भी विनियमित किया जाना चाहिए। संदर्भ के लिए, एक जंगली प्रकार की कीड़ा औसत उपज पर 4-10 अंडे / एच देता है> 360 कीड़ों प्रति परख यदि ऊपर कीड़ा सिंक्रनाइज़ेशन प्रोटोकॉल ¹⁷ का पालन किया जाता है। यदि कुछ उत्परिवर्ती तनाव अंडा-बिछाने दोषपूर्ण होते हैं, तो अंडा-बिछाने के लिए अधिक गर्भित वयस्क कीड़े संतानों की लक्ष्य संख्या तक पहुंचने के लिए चुनें। प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम वॉशिंग प्रक्रिया और कृमि प्लेसमेंट के दौरान धीरे से कीड़े को संभालना है। कीड़े मैकेनिकल उत्तेजनाओं के प्रति संवेदनशील होते हैं, जो तनाव प्रतिक्रियाओं को इस तरह से बढ़ाते हैं एस उलटा और अंडे बिछाने निषेध ¹⁸ इसके अलावा, वीडियो विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने से पहले, आरओआई को सटीक रूप से परिभाषित करने और विशिष्ट प्रकाश की स्थिति के लिए इष्टतम थ्रेशोल्डिंग निरंतर मान निर्धारित करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए। यह भी अनुशंसा की जाती है कि अगर अंशांकन और थ्रेसहोल्डिंग प्रक्रिया को दोहराया जाए तो आखिरी प्रयोग चलने के बाद एक लंबी अवधि समाप्त हो गई है।

इस पद्धति की एक सीमा यह है कि यह छोटे कीड़ा आबादी को चलाने के लिए उपयुक्त नहीं है। हालांकि, यदि संवेदी व्यवहार पर भोजन की उपस्थिति के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए उचित नियंत्रण किया जाता है, तो कृमि के स्थानिक स्थान को रोकने के लिए भोजन का उपयोग करते हुए, इस स्थापना के साथ प्रतिधारण परख भी संभव है। इसके अतिरिक्त, इस पद्धति का उपयोग नजदीकी निकटता और नियंत्रण की थोड़ी मात्रा और प्रयोगात्मक समाधान बूंदों के कारण उत्तेजना ढाल नेविगेशन का अध्ययन करने के लिए नहीं किया गया है।

E_content "> भविष्य में, प्रोग्रामिंग सॉफ़्टवेयर जो कि बहु-कीड़ा ट्रैकिंग और सिंगल-वर्म सुविधा निष्कर्षण को सक्षम करता है, इस प्रणाली को ^{1 9 , 20} में एकीकृत किया जा सकता है। एकल कृमि व्यवहार के सूक्ष्म व्यवहार पैरामीटर को रिकॉर्ड करना जैसे कि उत्क्रमण की गति और शरीर के झुकाव का आयाम प्रदान करेगा आबादी-आधारित परख के संदर्भ में एक व्यक्तिगत कृमि के रसायनशोधन व्यवहार का अधिक विस्तृत चित्र। उपयुक्त गेज आकार के साथ सिरिंज सुई का उपयोग करके आरओआई के माध्यम से उबाऊ छेद से आदत का अध्ययन करने के लिए परख को भी संशोधित किया जा सकता है और इसके साथ छिद्रों को भरना प्रायोगिक यौगिक या नियंत्रण बफर के साथ। यह रिकॉर्डिंग समय की एक लंबी अवधि में परिसर के अधिक संगत सतह एकाग्रता को सुनिश्चित करेगा जैसा कि आदतन अध्ययन के दौरान आवश्यक है। इस पद्धति का एक अन्य संभावित उपयोग विभिन्न नेमेटोड प्रजातियों में तुलनात्मक व्यवहार अध्ययन करने के लिए है। इसके अलावा, व्यवहार कक्षमल्टीमॉडल उत्तेजनाओं के व्यवहार संबंधी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए कई तरीकों से संशोधित किया जा सकता है ऑप्टोजेनेटिक अनुप्रयोगों के लिए, उच्च तीव्रता वाले एलईडी सरणियों को कैमरे के बगल में संलग्न किया जा सकता है ताकि छेड़ के दौरान चुनिंदा ब्याज की न्यूरॉन्स सक्रिय हो सकें। संवेदी व्यवहार पर तापमान के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए ताप तत्वों, शीतलन प्रणाली और तापमान सेंसर को भी जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, गंध वितरण प्रणाली odorsensory और chemosensory रूपरेखा के बीच बातचीत की जांच करने के लिए कक्ष के अंदर स्थापित किया जा सकता है

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

कुछ तनाव Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र (सीजीसी) द्वारा प्रदान किए गए थे, जिसे एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम (P40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित किया गया है। यह काम हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल संस्थान द्वारा समर्थित है, जिसके साथ पीडब्लूएस एक जांचकर्ता है

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum T-slotted framing extrusions	McMaster-Carr	47065T101	Single profile, 1" size, solid
Brackets	McMaster-Carr	47065T236	1" long for 1" high single profile extrusions
Compact end-feed fasteners	McMaster-Carr	47065T139	1" (single), pack of 4
Twist-in solid panel holders	McMaster-Carr	47065T251	For 1" high extrusion
Plastic end caps	McMaster-Carr	47065T91	For 1" high extrusion
Optically clear cast acrylic sheet	McMaster-Carr	8560K211	3/16" thick, 12" x 12"
Vinyl-coated polyester fabric	McMaster-Carr	88505K57	0.027" thick, 61" width, black
Brass grommets	McMaster-Carr	9604K22	Trade size 0, 0.545" outer diameter
Steel washers	McMaster-Carr	90107A029	1/4" screw size
Rounded head screws	McMaster-Carr	90272A546	1/4" - 20 thread size, 1 - 1/2" long
Standard operating backlight	Smart Vision Lights	See local vendor	8" x 8", infrared 850 nm
IVP-C1 Variable Control Pot	Smart Vision Lights	See local vendor
T1 Power Supply	Smart Vision Lights	See local vendor
Dino lite Pro AM4113T	Dino-Lite Digital Microscope	See local vendor
MS09B microscope stand	Dino-Lite Digital Microscope	See local vendor

References

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