Summary
Questo manoscritto descrive un in vitro dell'ovulo metodo di coltivazione che permette l'imaging di cellule vive di Arabidopsis zigoti ed embrioni. Questo metodo viene utilizzato per visualizzare le dinamiche intracellulare durante la polarizzazione di zigote e la specifica di destino delle cellule nello sviluppo di embrioni.
Abstract
Nella maggior parte delle piante da fiore, lo zigote ed embrione sono nascosti nel profondo del tessuto di madre, e così è stato a lungo un mistero di come si sviluppano in modo dinamico; ad esempio, come lo zigote polarizza per stabilire l'asse del corpo e come l'embrione specifica vari destini delle cellule durante la formazione dell'organo. Questo manoscritto descrive un in vitro dell'ovulo cultura metodo per eseguire la formazione immagine di cellule vive di sviluppare zigoti ed embrioni di Arabidopsis thaliana. Il medium di coltivazione ottimizzato permette di zigoti o embrioni in anticipo a crescere nelle piante fertili. Attraverso la combinazione con un dispositivo di matrice micropillar poly(dimethylsiloxane) (PDMS), l'ovulo si svolge nel liquido di coltura nella stessa posizione. Questo sistema di fissaggio è fondamentale per osservare l'ovulo stesso sotto un microscopio per diversi giorni dalla divisione zygotic per la fine della fase embrionale. L'imaging di vivere-cella risultante consente di monitorare le dinamiche in tempo reale di polarizzazione di zigote, quali migrazione nucleare e riarrangiamento del citoscheletro e anche i tempi di divisione cellulare e specifica di destino delle cellule durante il patterning di embrione. Inoltre, questo sistema di coltivazione dell'ovulo possa essere combinato con trattamenti inibitore per analizzare gli effetti di vari fattori per lo sviluppo dell'embrione e con ottiche manipolazioni come rottura di laser per esaminare il ruolo della comunicazione cellula-cellula.
Introduction
Il piano di base del corpo di un organismo si sviluppa da uno zigote unicellulare. Nella maggior parte delle piante da fiore, divisione zygotic genera un apicale e delle cellule basali, che si sviluppano nella radice, rispettivamente1e sparare. Pertanto, è importante capire come il corpo di pianta si forma durante l'embriogenesi, ma non c'è stato uno strumento efficace per osservare direttamente le dinamiche della vita zigoti ed embrioni perché si sviluppano nel profondo il fiore. In varie specie di monocotiledoni, come mais e riso, un metodo di fecondazione in vitro è stato stabilito2,3. In questo metodo, le cellule uovo e dello sperma isolato sono fuse elettricamente o chimicamente, e la cella generata può svilupparsi in una pianta fertile. Tuttavia, nelle piante dicotiledoni, non c'è nessun in vitro fertilizzazione metodo che può produrre embrioni corretta, presumibilmente a causa dello stato non sincronizzate ciclo cellulare di gameti maschili e femminili4,5. Inoltre, il tessuto che circonda embrione (endosperma) svolge i ruoli importanti nell'embrione di sviluppo6.
In una specie di modello dicotilene, a. thaliana, un metodo di coltivazione in vitro è stato sviluppato focalizzando l'attenzione sull'ovulo intero, che contiene l'embrione e l'endosperma7. Questo sistema è stato usato con successo per analizzare gli effetti di vari agenti chimici su embriogenesi, ma non è adatto per l'imaging di time-lapse perché ha un basso tasso di sopravvivenza. Di conseguenza, un sistema di coltivazione del ovulo romanzo in vitro è stato sviluppato al fine di avviare più presto la stadio di zigote e producono piante fertili in un alto rapporto8. Dopo varie prove, è stato trovato quel mezzo di Nitsch e trealosio ha migliorato significativamente il tasso di sopravvivenza di ovuli8. Inoltre, perché l'ovulo si espande come cresce e così spesso si sposta lontano dal campo di osservazione del microscopio, un dispositivo PDMS è stato sviluppato per risolvere l'ovulo in media9. Il dispositivo PDMS abilitato l'imaging a lungo termine per 3-4 giorni, che è sufficiente per tracciare lo sviluppo da uno zigote, un embrione di cuore-fase. Utilizzando questo metodo, diventa possibile visualizzare le dinamiche di polarizzazione di zigote ed embrione patterning, non solo in condizioni normali, ma anche in presenza di inibitori chimici o in vari ambiti di provenienza mutante8,10 ,11.
Figura 1: Diagramma schematico dei marcatori fluorescenti specifici utilizzati per visualizzare zigoti ed embrioni attraverso l'ovulo.
Lo zigote Arabidopsis si sviluppa in un embrione nell'ovulo, che viene generato profondo all'interno del fiore. In questo sistema in vitro coltura, lo zigote ed embrione sono osservati attraverso l'ovulo, e quindi è importante utilizzare marcatori fluorescenti specifici che non sono espressi in altri tessuti dell'ovulo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
1. preparazione del terreno di coltura In Vitro dell'ovulo
- rendono il mezzo liquido per la coltura in vitro di ovulo (" N5T medio ") contenenti 1 x Nitsch tecnica basale miscela di sale, 5% (p/v) trealosio diidrato, 0.05 % (p/v) 2-(N-morfolino) ethanesulfonic acido (MES)-KOH (pH 5,8) e 1 x Gamborg ' soluzione di vitamine di s.
- Aggiustare il pH a 5,8 con KOH.
- Sterilizzare il mezzo in autoclave (121 ° C, 20 min) o filtrandola attraverso un filtro da 0,22 µm.
Nota: Il mezzo sterilizzato può essere memorizzato a 4 ° C per 2-3 mesi.
2. Preparazione del dispositivo matrice PDMS Micropillar
- tagliare il dispositivo di micropillar PDMS di un coltello, lama di rasoio o forbici per adattarsi con la parte di vetro (14mm φ) di un piatto di vetro-fondo di 35 mm.
Nota: La procedura completa della costruzione dispositivo PDMS è descritto in precedenti documenti 8 , 9, e così i dettagli sono omessi qui. Piatti con fondo di vetro con volumi più piccoli, ad esempio 4-pozzetti o 96 pozzetti piastre, possono essere utilizzati per l'imaging a breve termine senza il dispositivo. - Sterilizzare il lato superiore del dispositivo PDMS sotto luce UV per 15 min.
- Accendere l'apparecchio PDMS su utilizzando una pinzetta punta quadrata e tenerlo sotto UV luce per 15 min sterilizzare fondo.
- Trasferire il dispositivo PDMS sterilizzato in una piastra di coltura di 35 mm e aggiungere il supporto di N5T fino a quando il dispositivo è completamente imbevuto nel medio (circa 5-7 mL).
- Mettere il piatto in una camera a vuoto e ridurre la pressione a degas. Mantenere l'aspirazione per 3 h a tutta la notte fino a quando l'aria nel dispositivo viene sostituita dal mezzo.
Nota: Il dispositivo può essere staccato da bolle d'aria sotto una forte depressione. - Prendere il dispositivo dal piatto, tenendola con le pinzette a punta quadrata e metterlo su un tovagliolo di carta per rimuovere il mezzo supplementare sulla parte laterale e inferiore.
Nota: il mezzo sulla matrice micropillar (superficie superiore) non deve essere rimosso perché questo sarà utilizzato per la coltivazione di ovulo. - Trasferire il dispositivo su un vetro da diapositiva 76 x 26 mm, garantendo per mantenere la parte di micropillar come il lato superiore e coprire l'apparecchio con il coperchio di piatto di cultura 35 mm per evitare il terreno dall'asciugarsi durante la successiva estrazione dell'ovulo.
3. Anemofila dissezione ed estrazione dell'ovulo
- sterilizzare un ago (mm 0,40 G) e pinzette bene strofinando con etanolo al 70%. L'ago è facilmente gestibile collegandolo a un bastone di legno o siringa.
- Verifica l'infiorescenza della pianta e selezionare i corretto silique per l'esperimento. Le silique circa 5 mm contengono zigoti, e le silique di 8-10 mm includono giovani embrioni globulari.
- Accise i silique utilizzando una pinzetta e metterli su nastro biadesivo su un vetro di diapositiva 76 x 26 mm. Un anemofila contiene circa 40-60 ovuli e 3-4 silique (cioè, 120-240 ovuli) sono sufficienti per un unico dispositivo.
- Aprire l'anemofila (parete dell'ovaia) per vedere gli ovuli all'interno utilizzando l'ago sterilizzato e pinzette sotto un microscopio stereoscopico. Tagliare solo la parete dell'ovaia, in modo che gli ovuli non siano danneggiati.
- Trasferire l'anemofila aperto nel mezzo di N5T sul dispositivo PDMS (preparato al punto 2.7) e rilasciare gli ovuli nel mezzo con l'ago o una pinzetta.
- Mettere una piccola copertura vetrata (18 x 18 mm) sul dispositivo PDMS per spingere gli ovuli negli spazi nella matrice micropillar.
- Togliere il vetro di copertura tirandolo orizzontalmente con una pinzetta o le dita per rimuovere medium extra.
- Capovolgere il dispositivo PDMS, metterlo in un piatto fondo di vetro 35mm e premere leggermente il dispositivo spingendo con le pinzette punta quadrata per attaccarlo al vetro.
- Medie N5T versare delicatamente in vetro-fondo piatto di decantazione la bottiglia fino a quando il dispositivo PDMS è completamente imbevuto nel mezzo e sigillare il piatto con la pellicola di paraffina.
Nota: Il dispositivo PDMS può essere riciclato, ma dispositivi che sono troppo vecchi si staccano facilmente dalla parte inferiore del vetro. Inoltre, il dispositivo può galleggiare se esso non è completamente degassato nel passaggio 2.5 o il mezzo viene versato troppo in fretta.
Figura 2: procedura schematica per la preparazione del campione.
Questo flusso schematico corrisponde ai passaggi 3.5 a 4.1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
4. Time-lapse Imaging
- posizionare il piatto con fondo di vetro che è stato preparato in passaggio 3.9 su un microscopio invertito e selezionare adatti ovuli di concentrarsi su.
Nota: Perché gli ovuli variano in fase, la posizione e la direzione, ovuli adatti dovrebbero essere trovati controllando loro fluorescenza marcatore. - Avviare la live-imaging secondo il produttore ' s istruzioni del sistema microscopio.
Nota: La strumentazione del microscopio e i parametri sono diversi, e così gli utenti devono scegliere le impostazioni corrette che corrispondono allo scopo di esperimento. Ad esempio, le impostazioni utilizzate in questo manoscritto sono elencate nella tabella 1.
| attrezzature/impostazione | supplementare video 1, figura 3 (A) e 4 | Figura 3 (B) e supplementare Video 2 | supplementare Video 3 |
| microscopio | microscopio (A1R MP) invertito a scansione laser | disco rotante invertito il microscopio confocale (CSU-W1) | casella-tipo invertito sistema di microscopio confocale con una camera di incubazione stabile (CV1000) |
| Laser | ti femtosecond laser di impulso | laser LD 488 nm e 561 nm | 488 nm e 561 nm laser LD |
| O biettivi lente | 40 X obiettivo di immersione in acqua (NA = 1.15) con mezzo immersione | 60 X obiettivo obiettivo ad immersione in silicone (NA = 1.30), montato su un'unità di messa a fuoco Piezo | 40 X Diametro obiettivo (NA = 0.95) |
| Detect o | esterne non descanned GaAsP PMT rivelatore | telecamera EMCCD | fotocamera EMCCD |
| dicroiche specchio | DM495 e DM560 | DM488/561 | DM400-410/488/561 |
| filtro | < td > passa-banda filtri; 534/30 nm e 578/105 nmfiltri passa-banda; 520/35 nm e 593/46 nm | filtri passa-banda; 520/50 nm e 617/73 nm | |
| fetta lungo asse z | 31 z-stack con intervalli da 1 µm | inter 17 z-stack con 3 µm Vals | 7 z-stack con intervalli di 5-µm |
| intervallo di tempo | 20 min | 5 min | 10 min |
tabella 1: il Sistemi di microscopia e le impostazioni utilizzate in questo manoscritto.
I microscopi e i parametri sono diversi, e così ogni utente dovrebbe scegliere il sistema adatto per l'esperimento.
- controllare la sequenza di immagini acquisite e convertirlo nel formato di film generale, come. avi o. MOV per presentazione.
Nota: Se il software di microscopio non può emettere le immagini come un film in formato, è possibile salvare le immagini come TIF e quindi aprirli in ImageJ, un programma open source ispirato da NIH Image, per modificare il tipo di file. ImageJ è disponibile presso: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ può essere utilizzato anche per fare un Z-sInfilare il film, come la proiezione di massima intensità, come descritto in: https://imagej.net/Z-functions.
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Representative Results
Utilizzando questo sistema di coltivazione dell'ovulo, questo metodo può tracciare la dinamica vita di polarizzazione di zigote e patterning di embrione. Questo è un risultato, perché in precedenza non c'era nessuna tecnica per visualizzare il comportamento in tempo reale di zigote ed embrione, che sono nascosti nel profondo del tessuto di madre. Figura 3A e supplementare Video 1 mostrano che i microtubuli (MTs) nello zigote giovane si accumulano come un anello trasversa nella regione subapicale10. Questo anello di MT è mantenuto mentre lo zigote si allunga in direzione apicale. Dopo il completamento di zigote allungamento e migrazione nucleare nella regione apicale, l'anello di MT scomparirà e il MTs forma un mandrino per separare il DNA. Figura 3B e supplementare Video 2 mostrano che le cellule embrionali si dividono coordinatamente per formare una forma globulare radialmente simmetrico8. Questo metodo è applicabile per gli esperimenti farmacologici. Ad esempio, dopo l'applicazione di un inibitore di polimerizzazione dell'actina (Latrunculina B; Lat B) nel mezzo liquido di coltura gli ovuli contenenti zigote, è stata inibita la migrazione nucleare polar e così lo zigote diviso in maniera più simmetrica, che indica il ruolo del filamento di actina sulla polarizzazione zigote (Supplemental Video 3 )10. La formazione immagine a lungo termine dello sviluppo dell'embrione consente il tracciamento della direzione e temporizzazione di singole divisioni cellulari, che significa che la durata del ciclo cellulare e la geometria possa essere analizzati statisticamente. Infatti, precedentemente abbiamo indicato che la divisione delle cellule del lignaggio cellula apicale è più veloce di quello delle cellule basali regione8.
Figura 3: Vivere-imaging di zigote polarizzazione e Patterning di embrione.
(A) time-lapse osservazione di uno zigote che esprimono gli indicatori specifici per il nucleo (istone 2B-tdTomato; magenta) e microtubuli (MTs, trifoglio-TUA6; verde). Le immagini sono state acquisite usando un microscopio invertito a scansione laser (A1R MP). (B), time-lapse osservazione di un embrione che esprimono gli indicatori per il nucleo (istone 2B-sGFP; verde) e la membrana plasmatica (PM, tdTomato-LTI6b; magenta). Le immagini sono state acquisite usando un microscopio invertito confocale a disco rotante (CSU-W1). Le immagini sono state indicate come immagini di proiezione massima intensità, e i numeri indicano il tempo (h:min) dal primo fotogramma. Punte di freccia e staffe gialli Visualizza il nucleo e l'anello di MT trasversa, rispettivamente. Ciano parentesi indicano il mandrino (A) e il nucleo in divisione (B). Scala bar: 10 µm (A) e 30 µm (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo manoscritto presenta un semplice in vitro dell'ovulo coltivazione protocollo che è efficiente per l'uso nell'imaging di cellule vive di sviluppare zigoti e degli embrioni.
Il design del dispositivo PDMS potrebbe bisogno di ottimizzazione secondo allo stadio embrionale. Il primo dispositivo sviluppato era una gamma di microcage per regolare l'orientamento e per fissare la posizione di ovuli9, e quindi un dispositivo di micropillar è stato costruito per intercettare in modo più efficiente ovuli8. Inoltre, i micropillars sono più sottili e più morbida di un microcage e così non impediscono l'espansione dell'ovulo durante l'osservazione a lungo termine. Questo dispositivo di micropillar può contenere un ovulo per diversi giorni, dal palco zygotic fino il cuore embrionale fase8. In definitiva, tuttavia, l'altezza dell'ovulo completamente espansa supera l'altezza di micropillar, e così spinge il dispositivo a distanza. Quindi, l'altezza e la spaziatura del micropillars dovrebbe essere regolate se fase successiva gli embrioni sono la messa a fuoco.
Poiché l'ovulo è posizionato nella parte inferiore del piatto, deve essere utilizzato un microscopio invertito. Un microscopio confocale è sufficiente monitorare il modello di divisione delle cellule, come illustrato nella Figura 3B e supplementare video 2 e 38,11, e un microscopio confocale disco rotante è importante eseguire a lungo termine di imaging senza danno delle cellule. In contrasto, una microscopia di eccitazione del due-fotone, che è adatta per l'imaging profondo di vivere organismi12, è necessario visualizzare le dinamiche intracellulare di zigote (Figura 3A e supplementare Video 1)10. Pertanto, è fondamentale per utilizzare il sistema di microscopio adatto per gli esperimenti.
Come descritto nell'Introduzione e Rappresentante risultati, non c'erano nessun metodi esistenti che possono monitorare le dinamiche di vita dell'embrione in via di sviluppo nell'ovulo e zigote. Pertanto, utilizzando questo metodo di coltivazione dell'ovulo, i dettagli della polarizzazione di zigote e patterning embrione sono stati chiariti per la prima volta.
Questo metodo è applicabile per gli esperimenti farmacologici, come mostrato nella Supplemental Video 3. Inoltre, questo sistema di imaging è stato utilizzato per valutare gli effetti dei nuovi composti sintetizzati sulla divisione delle cellule embrionali11. Era successo anche combinato con rottura di laser e così ha rivelato che quando la cellula apicale è danneggiata, i derivati delle cellule basali cambiare il loro destino delle cellule per produrre una nuova cellula apicale8. Quindi, ulteriore applicazione di questo metodo ai vari materiali e tecniche fornirà strumenti potenti per comprendere i meccanismi molecolari dell'embriogenesi.
Per eseguire la formazione immagine a lungo termine con questo metodo, il punto cruciale è quello di preparare un marcatore fluorescente specifico e brillante che le etichette tessuti bersaglio e/o strutture. Perché lo zigote ed embrione sono osservati attraverso l'ovulo, come mostrato nella Figura 1, sfondo segnali nell'endosperma e altri tessuti dell'ovulo possono mascherare il vero segnale nell'embrione (Figura 4). Inoltre, per rilevare un segnale debole, deve essere incrementata la potenza del laser del microscopio, ma questo può danneggiare l'ovulo durante l'osservazione a lungo termine. Supplemental Video 4 dimostra che la potenza del laser di alta auto-fluorescenza nell'ovulo è aumentato e infine ridotto il sacco embrionale, in cui lo zigote è stato schiacciato. Pertanto, prima iniziare l'esperimento deve essere stabilita una linea marcatore specifico e brillante. Per quanto riguarda la maggiore luminosità, tdTomato e Clover sono meglio di RFP e GFP, rispettivamente.
Figura 4: Il segnale fluorescente di fondo nell'ovulo maschera segnale embrionali.
Immagine dell'ovulo che esprimono i marcatori del nucleo embrionale (istone 2B-tdTomato; magenta) e il nucleo epidermico (istone 2B-trifoglio; verde). Ovulo intero ed embrione asportato vengono visualizzati nella parte superiore e inferiore pannelli, rispettivamente. Frecce indicano la posizione dell'embrione. L'istone 2B-Clover si esprime non solo in embrione, ma anche nell'ovulo intero, e così è difficile trovare il segnale embrionale attraverso l'ovulo. Scala bar: 50 µm (A) e 10 µm (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Microscopia in questo lavoro è stato condotto presso l'Istituto di Transformative Bio-molecole (WPI-ITbM) dell'Università di Nagoya e supportata dal Giappone Advanced Plant Science Network. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Japan Science and Technology Agency (progetto ERATO T.H. e M.U.) e la Japan Society per la promozione della scienza: una sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 e JP15H05955 per M.U. e Nos. JP16H06465, JP16H06464 e JP16K21727 per Tartaglia), una sovvenzione per giovani scienziati (B, Nos. JP24770045 e JP26840093 per M.U.) e una sovvenzione per impegnativa ricerca esplorativa (No. JP16K14753 per M.U.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitsch basal salt mixture | Duchefa | N0223 | |
| trehalose dihydrate | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35-mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D111300 | |
| 35 mm culture dish | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm slide glass | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm slide glass | Matsunami Glass | C018181 | |
| needle (gauge 0.40 mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable. | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
References
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