Summary
本稿では体外胚珠栽培手法についてシロイヌナズナ受精および胚の住セルイメージ投射を可能にします。このメソッドを利用して、受精卵の偏波の中に細胞内動態と初期胚細胞運命決定を可視化します。
Abstract
ほとんどの顕花植物の受精および胚は母組織の奥深くに隠されて、従ってそれは長年どのように彼らを動的に開発の謎たとえば、どのように受精は体軸や器官形成の時に胚が様々 な細胞運命を指定する方法を確立する分極します。本稿では、受精とシロイヌナズナの胚の開発の住セルイメージ投射を実行する胚珠体外培養法について説明します。最適化された培地では、受精卵や初期胚肥沃な植物に成長することができます。ポリジメチルシロキサン (PDMS) 駆動式マイクロピラー アレイ デバイスと組み合わせて、胚珠は同じ位置に液体培地で開催されます。この固定は、ココヤシの部門から数日間胚後期に顕微鏡下で同じ胚珠を観察することが重要です。結果住セルイメージ投射を使用して核移行と細胞骨格の再編とも細胞分裂のタイミングや胚パターン形成時の細胞運命仕様など、受精卵の偏波の実時間ダイナミクスを監視できます。さらに、胚発育に及ぼす諸因子の影響を分析する阻害剤治療と細胞間コミュニケーションの役割を調べるレーザー破壊などの光の操作は、この胚珠培養システムを結合できます。
Introduction
単細胞受精卵から有機体の基本的なボディ計画を開発します。ほとんどの顕花植物のココヤシ部門は、樹状突起と撮影やルート、1それぞれに発展する基底のセルを生成します。したがって、胚発生に伴う植物体を形成する方法を理解することが重要だが、彼らは花に深く成長するのでリビング受精および胚のダイナミクスを直接観測する効果的なツールをされていません。トウモロコシ、米などのいくつかの単子葉種体外受精法は確立された2,3をされています。この方法では分離精子と卵細胞を電気的または化学的に、融合し、生成されたセル、肥沃な工場に開発。ただし、双子葉植物植物の雄性と雌性の配偶子の4、5の細胞周期の非同期状態のためおそらく適切な胚を作り出すことができる体外受精法ではありません。さらに、胚周囲組織 (胚乳) は、胚の開発6で重要な役割を果たしています。
モデルの双子葉植物の種、シロイヌナズナ、体外の栽培方法は、胚と胚乳の7を含む全体の胚珠に焦点を当てによって開発されました。このシステムは正常に様々 な化学試薬の胚発生に及ぼすを分析に使用されたが、低い生存率をもっているため時間経過イメージ投射のため適していません。そこで、新規培養胚珠の栽培システムは、受精卵の段階として早期に開始高比8で肥沃な植物を生成するために開発されました。様々 な試験後 Nitsch 培地が分かったし、トレハロースが胚珠8の生存率を大幅に向上します。さらに、胚珠の展開としては成長して、従って頻繁に顕微鏡の観察フィールドから移動、ために、9の中の胚珠を修正する PDMS 装置が開発されました。PDMS デバイスは、心期胚には受精卵から開発をトレースするのに十分である 3-4 日間の長期的なイメージングが有効になります。このメソッドを使用して、それは偏波受精卵・胚のパターンだけでなく通常の条件下でも低分子阻害剤の存在下でまたは様々 な突然変異体の背景8,10 のダイナミクスを可視化することが可能になります。 ,11。
図 1: 視覚化受精し胚を胚珠を使用特定の蛍光マーカーの模式図。
シロイヌナズナの受精卵は、花の奥深くに生成される胚珠の胚に開発しています。体外培養システム、受精卵・胚胚珠、観察、従って他の胚珠組織で表されない特定の蛍光マーカーを使用することが重要です。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Protocol
1 体外 胚珠培養培地の調製
- を 体外 の胚珠培養用液体培地 (" N5T 中 ") 1 x Nitsch 基底塩混合物、5% (w/v) トレハロース二水和物、0.05 を含む。% (w/v) の 2-(N morpholino) ethanesulfonic 酸 (MES)-島 (pH 5.8) 1 x Gamborg ' s ビタミン ソリューションです 。
- 島の 5.8 に pH を調整します 。
- は、オートクレーブに入れることによって媒体を滅菌 (121 ° C、20 分) または、0.22 μ m フィルターをフィルタ リングします
。 注: 滅菌媒体格納できる 4 ° C で 2 - 3ヶ月 。
2。PDMS 駆動式マイクロピラー アレイ素子の作製
- カット ナイフ、かみそりの刃または 35 mm ガラス底皿のガラスの部分 (14 mm φ) に収まるようにハサミで PDMS 駆動式マイクロピラー デバイス
。 注: PDMS 装置建設の完全な手順は前論文 8 , 9 で説明、ここでこうして、詳細は省略します。デバイスがなくても短期的なイメージングのため 4 ウェルまたは 96 ウェルのプレートなどの小さいボリュームでガラス底培養皿を使用できます 。
- 定置滅菌 15 分の紫外線の下で PDMS 装置の上側
- 正方形のチップ ピンセットを使用してによって PDMS 装置を切り、底を殺菌する 15 分の軽い UV の下でそれを維持します 。
- 35 mm ディッシュに滅菌の PDMS デバイスを転送し、デバイスは培地 (約 5-7 mL) で完全に浸漬されるまで N5T 培地を追加します 。
- 料理を真空チャンバーに入れて、ガスを抜き圧力を減らします。一夜にしてデバイスの空気が媒体によって置き換えられるまで 3 時間掃除機を維持します
。 注: デバイスは、強力な真空の下で空気の泡で切り離すことが 。
- 皿から正方形のチップ ピンセットでそれを保持することによって、デバイスを取るし、サイドと下部に余分なメディアを取り出してペーパー タオルの上に置く
。 注: これが胚珠の耕作のために使用されるため、駆動式マイクロピラー アレイ (上面) に媒体を削除しないでください 。
- アッパー サイドとして駆動式マイクロピラーの部分を保つために確保、76 mm × 26 mm スライド ガラス上にデバイスを転送し、次の胚珠抽出中に完全に乾くことから媒体を防ぐために 35 mm の文化料理ふた付きのデバイスをカバーします 。
3。Silique 郭清と胚珠抽出
- 70% エタノールで拭くことによって針 (0.40 mm G) と高級ピンセットを消毒します。針は、注射器や木の棒に接続し、簡単に処理します 。
- は、植物の花序をチェックし、実験のための適切な siliques を選択します。約 5 mm siliques 含む受精卵と 8-10 mm siliques 若い球状胚があります 。
- は、ピンセットを使用して、siliques を消費税し、76 × 26 mm スライド グラス上に両面テープの上に置きます。について 1 つの silique が含まれています 40 60 胚珠と 3-4 siliques (すなわち 120-240 胚珠) が 1 つのデバイスにとって十分です 。
- は、滅菌注射針と顕微鏡下で、ピンセットを使用して胚珠を表示する silique (子房壁) を開きます。胚珠は破損していないように子房壁のみをカットします 。
- (2.7 の手順で準備) PDMS のデバイスに N5T 中に開かれた silique を転送し、針やピンセットで媒体に胚珠をリリースします 。
- 駆動式マイクロピラー アレイ内のスペースに胚珠をプッシュする PDMS デバイス上に小さなカバー ガラス (18 mm × 18 mm) を配置します 。
- 余分なメディアを削除するピンセットや指を使用して横に引いてカバーガラスを脱ぐ 。
- PDMS デバイスを裏返し、35 mm ガラス底皿に置き、少しガラスに固執する正方形のチップ ピンセットを使用してを押してデバイスを押し 。
- ガラス底にそっと注ぐ N5T 媒体まで PDMS 装置は中、ずぶ濡れ中瓶をデカントで皿し、パラフィン フィルムが付いている皿をシールします
。 注: PDMS デバイスは、リサイクルすることができますが、あまりにも古いデバイスは、ガラス底から容易に切り離します。手順 2.5 では完全に脱がないまたは媒体は余りにすぐに注がれる場合デバイスがさらに、浮かぶかもしれない 。
図 2: 試料の概略プロシージャ
。
このフロー図は、手順 3.5 から 4.1 に対応します。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください
4 低速度撮影画像
倒立顕微鏡、3.9 ステップで準備されたガラス底皿を配置し集中する適切な胚珠をオン]- .
。 注: ステージ、位置、および方向で、胚珠が異なりますので適切な胚珠発見されるべき自分のマーカーの蛍光をチェックしています 。
- は、メーカーによるとライブ イメージングを開始 ' 顕微鏡システムの指示
。 注: 顕微鏡装置およびパラメーター多様であり従ってユーザーが実験目的に合った適切な設定を選択する必要があります。例として、この原稿で使用される設定は、表 1 に示す 。
| 機器/設定 | 図 3 (A) および補足のビデオ 1 4 | 図 3 (B) および補足のビデオ 2 | 補足動画 3 |
| 顕微鏡 | 倒立レーザー走査顕微鏡 (A1R MP) | 回転ディスク共焦点倒立顕微鏡 (CSU W1) | ボックス型逆安定したインキュベーション室 (CV1000) と共焦点顕微鏡システム |
| レーザー | フェムト秒パルス レーザー | 488 nm および 561 nm の LD レーザ | 488 nm および 561 nm の LD レーザ |
| O組込めますレンズ | 水浸対物レンズ × 40 (NA = 1.15) 浸漬媒体 | シリコーン油浸対物レンズ X 60 (NA = 1.30)、ピエゾ フォーカス ドライブにマウントされている | 40 X 対物レンズ (NA = 0.95) |
| 検出または | 外部非 descanned GaAsP PMT 検出器 | EMCCD カメラ | EMCCD カメラ |
| ダイクロイック ミラー | DM495 と DM560 | DM488/561 | DM400-410/488/561 |
| フィルター | < td> バンドパス フィルター;534/30 nm と 578/105 nmバンドパス フィルター; 520/35 nm、および 593/46 nm | バンドパス フィルター; 520/50 nm と 617/73 nm | |
| z 軸に沿ったスライス | 1 μ m 間隔で 31 z スタック | 17 z スタック 3 μ m の間ヴァルス | 5 μ m 間隔で 7 z スタック |
| 時間 | 20 分 | 5 分 | 10 分 |
テーブル 1:顕微鏡システム、この原稿で使用される設定します
。
顕微鏡とパラメーターは多様であり従って各ユーザーは、実験のための適切なシステムを選択してください
- 取得イメージ シーケンスを確認し、.avi またはプレゼンテーションに .mov などの一般的なムービー形式に変換します
。 注: 顕微鏡のソフトウェアは、ムービー形式として、映像を出力できませんは、ImageJ、NIH イメージ、ファイルの種類を変更するに触発されたオープン ソース プログラムで開いて .tif として画像を保存することが可能。ImageJ を提供しています: https://imagej.nih.gov/ij/。ImageJ は、Z s を作るためにも使用できます。説明したように最大強度投影など、ムービーを挟む: https://imagej.net/Z-functions です 。
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Representative Results
このメソッドはこの胚珠培養システムを用いた偏波受精卵・胚パターン形成生活動態をトレースできます。これは、以前母親組織に深く隠されている受精卵及び胚のリアルタイム挙動を可視化する技術がなかったので成果です。図 3 aと補足のビデオ 1若い受精卵における微小管 (MTs) 穎地域10の横のリングとして蓄積する可能性を示しています。受精は根尖方向に伸長しながら、この MT リングが維持されます。受精卵の伸長および根尖部を核移行完了後 MT リングが消え、MTs を形成する DNA を分離するスピンドル。図 3Bと補足のビデオ 2胚性細胞が放射状に対称な球状形8を形成する協調分割を表示します。このメソッドは、薬理学的実験のために適用されます。たとえば、アクチン重合阻害剤 (latrunculin B の適用後緯度 B) 極核移行の阻害に培養胚珠の受精卵を含む液体培地、およびしたがって受精受精卵偏波 (補足ビデオ 3のアクチン フィラメントの役割を示すより対称の方法で分割)10。方向のトレースを有効に胚の長期的なイメージングと幾何学と細胞周期の期間を意味する個々 の細胞の分裂タイミングを統計的に分析することができます。実際、我々 は以前頂端細胞系列の細胞分裂は基底細胞領域8より高速を示した。
図 3: ライブ イメージング偏波受精卵・胚パターン形成。
(A) 核 (ヒストン 2B tdTomato; マゼンタ) と微小管 (MTs、クローバー TUA6; 緑) の特定のマーカーを表現する受精の時間経過観察します。レーザー スキャンの倒立顕微鏡 (A1R MP) を使用して、画像に買収されました。(B) (ヒストン 2B sGFP; 緑) 核と細胞膜のマーカーを表現する胚のタイムラプス観察 (PM、tdTomato-LTI6b; マゼンタ)。画像は、回転ディスク共焦点倒立顕微鏡 (CSU W1) を使用して取得しました。画像は最大値投影画像として示されていた、数字は最初のフレームから時間 (h:min)。矢印と黄色のラケットは、それぞれ核と横の MT リングを示しています。シアンのかっこは、スピンドル (A) と (B) 分割核を示します。バーをスケール: 10 μ m (A) と (B) 30 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、単純な体外胚珠栽培プロトコルは、受精卵や胚の開発の住セルイメージ投射で使用するため効率的を紹介します。
PDMS 装置の設計は、胚の段階に応じて最適化を必要があります。開発の最初のデバイスは microcage 配列方向を調整し、胚珠9の位置を修正してより効率的に胚珠をトラップし、駆動式マイクロピラー デバイスを構築しました8。さらに、マイクロピラーも細くて、microcage よりも柔らかい、従って長期観察中に胚珠拡張を妨げません。この駆動式マイクロピラー デバイスは、胚の心臓原基ステージ8までココヤシの段階からの数日間、胚珠を保持できます。最終的には、ただし、完全に展開された胚珠の高さを超える駆動式マイクロピラー高さ、従ってそれは先のデバイスをプッシュします。したがって、高さや、マイクロピラーの間隔は、後で胚がフォーカス場合に調整必要があります。
胚珠は皿の下部に配置される、ため倒立顕微鏡を使用する必要があります。共焦点顕微鏡、図 3Bと補足動画 2、38,11, のように細胞分裂パターンを監視するための十分な回転ディスク共焦点顕微鏡は長期を実行することが重要です。イメージング細胞の損傷なし。対照的に、生活の深い撮影に適した、二光子励起顕微鏡生物12、受精卵 (図 3 aおよび補足のビデオ 1)10の細胞内動態を可視化する必要があります。したがって、実験に適した顕微鏡システムを使用することが重要です。
前述の紹介と代表の結果に、受精卵・胚胚珠の開発の生活原動力を監視することができます既存の方法はありませんでした。したがって、この胚珠培養法を使用して、初めて受精卵偏波および胚パターン形成の詳細を明らかにされています。
このメソッドは、補足動画 3のように薬理学的実験のため適用されます。また、このイメージング システムは胚の細胞分裂11に新たに合成された化合物の効果を評価していました。レーザー破壊とも正常に結合され、したがって頂端細胞を傷つけとき、基底細胞誘導体が新しい頂端細胞8を生成する彼らの細胞の運命を変更することを明らかにしました。したがって、さらにこのメソッドの様々 な素材や技術への応用が胚発生の分子機構を理解するための強力なツールが提供されます。
この方法で、長期的なイメージングを実行するには、重要なステップは、ターゲット組織および/または構造のラベルを明るい蛍光マーカーを準備です。図 1に示すように、胚珠を受精卵・胚を観察、胚乳における信号の背景、他の胚珠組織は、胚 (図 4) に真の信号を隠すことができます。また、弱い信号を検出する顕微鏡のレーザー パワーが増加する必要がありますが、これは長期観察中に胚珠を害することができます。補足動画 4は、高いレーザー パワー、胚珠の自己蛍光を増加、最終的に受精が押しつぶされた胚嚢を縮小を示しています。したがって、実験を開始する前に特定および明るいマーカー ラインが確立されます。高い明るさに関して tdTomato とクローバー、RFP や GFP よりそれぞれ。
図 4: 胚珠のバック グラウンド蛍光信号胚性信号をマスクします。
(ヒストン 2B tdTomato; マゼンタ) 胚の核と表皮の核 (ヒストン 2B クローバー; グリーン) のマーカーを表現する胚珠のイメージ。全体の胚珠と摘出胚上で表示され、それぞれのパネルを下げます。矢印は、胎児の位置をポイントします。胚、のみならず全体の胚珠にヒストン 2B クローバーは表現され、したがって胚珠、胚性信号を見つけることは困難です。スケール バー: (A) 50 μ m と 10 μ m (B)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品での顕微鏡で、研究所のトランスフォーマティブ生命分子 (WPI ITbM) 名古屋大学を行われ、日本高等植物科学ネットワークでサポートされています。この作品は、振興会の日本科学技術振興機構 (ERATO プロジェクト ノルウェールーテルし調印) 会からの助成金によって支えられた: 革新的な領域 (Nos 科学研究費補助金。JP24113514、JP26113710、JP15H05962、および調印、および Nos JP15H05955。JP16H06465、JP16H06464、T.H の JP16K21727)、科研費若手 (B、Nos。JP24770045 と調印の JP26840093)、科研費挑戦的萌芽研究号調印の JP16K14753)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitsch basal salt mixture | Duchefa | N0223 | |
| trehalose dihydrate | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35-mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D111300 | |
| 35 mm culture dish | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm slide glass | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm slide glass | Matsunami Glass | C018181 | |
| needle (gauge 0.40 mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable. | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
References
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