Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

In Vivo Billeddannelse af Cx3cr1normal god landbrugspraksis/NGL Reporter mus med røde-domæne optisk kohærens tomografi og Scanning Laser oftalmoskopi

Published: November 11, 2017 doi: 10.3791/55984
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Ophthalmology and Department of Clinical Research, Bern University Hospital and University of Bern

Summary

Denne protokol beskriver hvordan høj opløsning Billeddannende teknikker såsom spektrale domæne optisk kohærens tomografi og scanning laser oftalmoskopi kan udnyttes i små gnavere, ved hjælp af en oftalmologiske billedbehandlingssystem for platform, for at indhente oplysninger om retinal tykkelse og microglial celle distribution, henholdsvis.

Abstract

Spektrale domæne optisk kohærens tomografi (SD-OCT) og scanning laser oftalmoskopi (SLO) er flittigt brugt i eksperimentel oftalmologi. I denne protokol, mus udtrykker grøn fluorescerende proteiner (NGL) promotor af Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1normal god landbrugspraksis/normal god landbrugspraksis) blev brugt til at afbilde mikroglia celler i vivo i nethinden. Mikroglia er bosiddende makrofager af nethinden og har været impliceret i flere retinal sygdomme1,2,3,4,5,6. Denne protokol giver en detaljeret metode til generering af retinale B-scanninger, med SD-OCT og billeddannelse af mikroglia celle distribution i Cx3cr1normal god landbrugspraksis/NGL mus med SLO i vivo, ved hjælp af en oftalmologiske billedbehandlingssystem for platform. Protokollen kan bruges i flere reporter mus linjer. Der er dog nogle begrænsninger i protokollen præsenteres her. Først, både SLO og SD-OLT, når det bruges i tilstanden høj opløsning indsamle data med høj aksial opløsning, men den laterale opløsning er lavere (3,5 µm og 6 µm, henholdsvis). Desuden, fokus og mætning niveau i SLO er stærkt afhængigt af parameteren udvælgelse og korrekt justering af øjet. Derudover bruger udstyr designet til menneskelige patienter i mus er udfordrende på grund af den højere samlede optiske effekt af musen øjet i forhold til det menneskelige øje; Dette kan føre til lateral forstørrelse unøjagtigheder7, som er også afhængige af forstørrelse af musen linsen bl.a. Men på trods af at den aksial scanning holdning er afhængig af laterale forstørrelse, aksial SD-okt målingerne er præcise8.

Introduction

Undersøgelse af retinale patologi vurderes i eksperimentel oftalmologi, normalt ved hjælp af histologiske teknikker. Men histologi kræver dyre euthanization og kan medføre ændring af de faktiske egenskaber af væv. SD-OCT og SLO anvendes rutinemæssigt i klinisk oftalmologi til diagnostiske formål og til overvågning af flere retinal sygdomme såsom diabetisk makulaødem9, forreste iskæmisk optisk neuropati10eller retinitis pigmentosa11 . SD-OCT og SLO er non-invasiv teknik, der genererer høj opløsning billeder af nethinden, der er visualiseret gennem det forstørrede elev uden yderligere indgriben. SD-okt indeholder oplysninger af retinale struktur og retinal tykkelse ved at indsamle backscattering data for at oprette tværsnit billeder af nethinden, mens SLO indsamler fluorescens data til at producere stereoskopiske billeder med høj kontrast af nethinden. I dag er begge teknikker bruges i stigende grad i eksperimentel oftalmologi ved hjælp af små gnavere12,13,14,15 (eller endda zebrafisk16,17) og kan give både kvalitative og kvantitative oplysninger12,17,18,19,20,21.

Ophobning af endogene fluorophores som lipofuscins eller dannelsen af drusen i nethinden kan visualiseres ved SLO som auto fluorescerende signal. Denne funktion gør SLO en værdifuld teknik til diagnose og overvågning af retinale sygdomme, såsom aldersrelateret makuladegeneration eller retinitis pigmentosa22,23. I eksperimentelle oftalmologi, kan auto fluorescens imaging (AF) anvendes til påvisning af specifikke celletyper i reporter mus linjer. F.eks er mus heterozygous for udtryk for normal god landbrugspraksis promotor af Cx3cr124 fordelagtige for i vivo visualisering af microglial celler i den normale nethinden og for undersøgelse af mikroglia/makrofag Dynamics i retinal sygdom21. Mikroglia er de bosiddende makrofager af nethinden, der spiller en afgørende rolle på væv homøostase og væv reparation efter skade1,25,26. Mikroglia aktivering i nethinden er blevet rapporteret i retinal skade, iskæmi og degeneration, tyder på en rolle for disse celler i retinal sygdom2,3,4,5, 6.

Formålet med denne protokol er at beskrive en relativt enkel metode for nethinde billedbehandling og måling af retinale tykkelse ved hjælp af SD-okt, og visualisering af normal god landbrugspraksis positive mikroglia celler i Cx3cr1normal god landbrugspraksis/NGL mus nethinden bruger SLO (Heidelberg Spectralis HRA + OCT system). Denne protokol kan udnyttes til billedbehandling og tykkelse målinger af sunde eller syge nethinder i forskellige mus linjer. Derudover kan morfometrisk analyser udføres for identifikation og kvantificering af mikroglia numre og mikroglia aktivering i nethinden ved hjælp af SLO21. Mikroglia celler er associeret med degenerative sygdomme i centralnervesystemet (CNS), herunder nethinden27,28,29. Således, ved at kombinere de to metoder, der anvendes i denne protokol, korrelation af mikroglia distribution og retinal degeneration kan gøres, som kan lette overvågning sygdommens sværhedsgrad eller effektiviteten af terapeutiske tilgange i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

i alle procedurer, BALB/c voksne mandlige og kvindelige mus som udtryk for normal god landbrugspraksis promotor af Cx3cr1 blev brugt 24. Mus blev behandlet ifølge ARVO erklæring om brug af dyr i Ophthalmic og Vision forskning og alle procedurer blev godkendt fra den schweiziske regering Federal schweiziske forordninger om dyrevelfærd. Mus var bedøvede af en subkutan injektion af medetomidine hydrochlorid (0,75 mg/kg) og ketamin (45 mg/kg). Ordentlig anæstesi blev bekræftet ved at overvåge den respirationsfrekvens og dyret ' s refleks mod en hale knivspids. I slutningen af forsøgene, mus blev aflivet med CO 2 inhalation.

Bemærk: udføre hver tænkelig session så hurtigt som muligt (maksimalt 20 min), siden kataraktdannelse følgende anæstesi kan hæmme retinal visualisering 30.

1. systemkonfiguration

  1. Tænd computeren.
  2. Tænd strømforsyningen. Meddelelsen " Start erhvervelse modul " vises på enhedens kontrolpanelet skærm.
  3. Dobbelt klik på softwarens genvej på skrivebordet til at operere softwaren.
  4. Klik på databasevisning, den " tilføje patienten " ikon.
  5. Indsætte alle nødvendige oplysninger i pop-up-vinduet (efternavn, fornavn, titel, fødselsdato, køn og patient-ID) og klik på " ok ". Vinduet pop indstillet hornhinde krumning til 2 mm og klik på " ok ".
  6. Placer et 78D standard oftalmologiske berøringsfrie spaltede lampe linsen foran standard 30 ° optik og fastgøre det sikkert med tape.
  7. Sikre, at filteret håndtaget i venstre side af enheden er placeret på angivelsen " A " til at give både IR + OCT og AF imaging ( figur 1).

2. Musen forberedelse

  1. Brug en medetomidine hydrochlorid dosis 0,75 mg/kg og en ketamin dosis af 45 mg/kg i fosfatbufferet saltopløsning (PBS, pH 7,4) til at forberede bedøvelse løsning. Således, for en 20 g mus, bland 15 µL af medetomidine hydrochlorid med 18 µL af ketamin til en endelige mængden af 50 µL i PBS. Gemme løsning ved 4 ° C i op til én uge.
  2. Forstå mus af harmoniske og Påfør en dråbe af tropicamid 0,5% + phenylephrin hydrochlorid 2,5% på hvert øje at opnå elev dilatation.
  3. Holde musen tilbageholdende, og med en insulin sprøjte knyttet til en 30G kanyle, injicere 50 µL af opløsningen anæstesi subkutant. Sæt musen tilbage i sit bur, der er placeret over en varmepude. Vente 3-5 min, indtil musen er fuldt bedøvet. For at vurdere bedøvelsesmiddel dybde, hugge halen af musen. Tjek den cornea refleks ved forsigtigt at røre ved musen hornhinden med en vatpind. Hvis ingen positiv refleks er observeret, fortsætte med at billeddannelse.
    Bemærk: Det er vigtigt at overvåge respirationsfrekvens under anæstesi. Hvis musen ikke er fuldt bedøvet, den respirationsfrekvens øges ved en smertefuld stimulus.
  4. Hydrat mus hornhinden med en anvendelse af 2% hydroxypropylmethylcellulose dråber på hvert øje.

3. SD-okt

  1. placere en opvarmning plet ca 32 ° c på den skræddersyede platform fastgjort på enhedens hage resten ( figur 1).
  2. Til billede det højre øje, skal du placere musen på den venstre del af platform ( figur 1). Sikre, at den rigtige bane med musen ansigter linsen og dens krop ligger liggende på den venstre del af platformen.
  3. Påfør en dråbe af hydroxypropylmethylcellulose på det højre øje og Placer en + 4 dioptri stive gas-gennemtrængelige kontaktlinse på det (sfærisk effekt:-25.00 til +25.00 dioptrier). Gemme kontaktlinse i afbalanceret saltopløsning (BSS). Hen til fange linsen, bruge plast eller silicium pincet til at undgå skader.
  4. Tryk på den gule boks i højre hjørne af kontrolpanelets display at starte modulet erhvervelse (grøn boks på figur 2A). Den gule boks vil blive grøn og menuerne på kontrolpanelet vises på skærmen ( figur 2A).
  5. For erhvervelse af B-scanninger, Vælg indstillingen IR + OCT på kontrolpanelet ( figur 2A). Valgte indstillinger er markeret med blåt på kontrolpanelet.
  6. Vælg " nethinden " under " program og struktur " i software og flytte linsen mod mus øjet ved hjælp af micromanipulator på enheden ( figur 1). Før fokuserer på nethinden, kontrollere, at angivelsen " OD " er markeret på den nederste venstre del af skærmbilledet. Softwaren automatisk identificerer venstre (OS) og højre (OD) øjet baseret på placeringen af målet.
    Bemærk: Hvis målet er placeret på midten af platformen, vises en fejlmeddelelse i bunden af skærmen. I så fald igen placere musen lidt indtil softwaren genkender det korrekte øje.
  7. Med fokus knop, fokusere på nethinden indtil de store fartøjer er tydeligt ses i fundus billedet i venstre side af skærmen. Flytte kameraet ved at dreje på micromanipulator venstre eller højre, for at flytte kameraet i retningen, eller med eller mod uret, til at flytte kameraet op eller ned, hhv.
    Bemærk: Flytte musen på platformen eller flytte linsen opad eller nedad til at opnå den foretrukne lokalisering af synsnerven hovedet i det infrarøde billede.
  8. Tænder følsomhed knob mod uret for at reducere eller med uret for at øge lysstyrken af fundus billedet. Når optimal fokus opnås, en SD-okt B-scanning vises på højre side af skærmen.
    Bemærk: Hvis B-scan ikke kan visualiseres ved at justere fokus, tryk på tastekombinationen Ctrl + Alt + Shift + O på tastaturet. I pop-up-vinduet, justere værdien af reference arm indtil B-scan vises på skærmen.
  9. Nederst til højre på skærmen, Vælg enkelt scanningen fra menuen mønster (enkelt linje i figur 2B).
  10. Slår micromanipulator af enheden ( figur 1), venstre, højre, fremad eller bagud (til at tænde for kameraet i retningen) for at sikre, at B-scan er beliggende mellem øverste og nederste hjørner af SD-OLT Skan vindue.
  11. Skal værdien automatisk Real-Time (kunst) til mindst 9 at opnå høj kvalitetsbilleder.
    Bemærk: Kunst forbedrer billedkvaliteten ved flere på hinanden følgende scanninger i gennemsnit. Jo højere den " kunst " værdi, jo højere signal til støjforhold og dermed billedkvaliteten. Men ved at øge den " kunst " værdi, erhvervelse tid øges også.
  12. Tryk på den " erhverve " knappen ( figur 2) på skærmen Kontrolpanel og erhverve billederne.
  13. Re-holdning med musen for at billedet venstre øje og gentage trin 3.2-3.12.
  14. Fjerne kontaktlinse med plastik/silicon pincet og læg det i BSS.
  15. Hydrat mus hornhinden med en frisk dråbe hydroxypropylmethylcellulose og fjerne overskydende med en silkepapir.
  16. Fjerne standard 30 ° optik ved at dreje det mod uret.
  17. Montere 55 ° linse og gentage trin 3.4-3.12 til hvert øje.

4. Auto fluorescens Imaging

  1. uden at flytte musen på platformen, Vælg IR på kontrolpanelet.
  2. Med fokus knop, fokusere på de store retinal fartøjer.
  3. På betjeningspanelet skal du vælge AF.
  4. Tænder følsomhed knob mod uret for at reducere eller med uret for at øge billedets lysstyrke.
  5. Tryk på følsomhed knop og indstille den " kunst " værdi på 67 eller mere at opnå høj kvalitet billeder.
  6. Når sæt " kunst " værdi er nået, skal du trykke på " erhverve " på kontrolpanelet for at erhverve billedet. Tryk på følsomhed knop igen for at stoppe gennemsnit. Justere fokus til at visualisere forskellige retinal lag.
  7. Fjerne 55° linse og montere bredt felt 102° linse. Følg trin 4.1 – 4.6 for begge øjne i hvert mus og alle de mus.
  8. Klik “ gemme billeder ” på venstre øverste kant af vinduet og klik derefter på “ afslutte ”. For at gemme billederne på computeren, Vælg mus på listen på højre del af skærmen ved at dobbeltklikke på navnet på musen. Dobbeltklik på hvert billede separat og derefter klikke på diskette ikonet. Gemme billedet som .tif, .bmp, .jpg eller .png på den ønskede mappe. At afslutte software pressen “ fil ” og “ frakørsel ”.

5. Anæstesi vending

  1. hydrat mus øjne med en dråbe af hydroxypropylmethylcellulose og returnere musen på en varmepude.
  2. Forbered Atipamezol løsning i en dosis på 2,25 mg/kg til at tilbageføre de beroligende virkninger af medetomidine hydrochlorid. For en 20 g mus, skal du tilføje 9 µL af atipamezol i en endelige mængden af 150 µL PBS. Gemme løsning ved 4 ° C i op til én uge.
  3. min efter bedøvelse injektion (trin 2.2), injiceres 150 µL af Atipamezol løsning subkutant.
  4. Overvåge musen indtil recovery fra anæstesi. Når musen er fuldt genoprettet (5-10 min efter Atipamezol injektion) sætte det tilbage i sit bur. Recovery er angivet af dyrets evne til at vende sin krop når der på den ene side, at genvinde walking aktivitet, og reagerer som reaktion på miljømæssige stimulation.

6. Manuel Retinal tykkelse måling fra SD-okt billeder

  1. åbne OCT scanningen ved at dobbeltklikke på navnet på dyret.
  2. Åbne B-scan opnås med 30 ° eller 55 ° linsen.
  3. Vælg " tykkelse profil ".
  4. Tryk på den " redigere laget segmenter " ikon ( figur 2B). Softwaren automatisk identificerer den indvendige begrænsning og basere membran.
  5. Om nødvendigt manuelt korrekt placering af den indvendige begrænsning og basere membran. For at gøre dette, skal du vælge lag ændres fra venstre side af skærmen og derefter indstillingen rød cirkel ( figur 2B). Træk en cirkel med museknappen trykket ændre linjen.
  6. Ændre linje for at placere den tilsvarende lag korrekt. Klik på " du gemme og lukke " at afslutte vinduet.
    Bemærk: På grund af refleksionsevne af årehinden, softwaren kan identificere den base membran forkert. Således er det at foretrække at definere det manuelt, før du fortsætter til retinal tykkelsesmålinger.
  7. Vælg " nethinden " under de " lag " indstilling. Et diagram af retinale tykkelse vises i bunden af skærmen.
  8. Klik på en anden placering i diagrammet eller på B-scanning for at se den retinale tykkelse (angivet i µm) for den valgte stilling.
  9. Måler den retinale tykkelse i den ønskede afstand fra den optiske nerve hoved og kopiere værdierne i et regneark.
  10. Gentag trin 5.1-5.9 for hver musen for både 30 ° og 55 ° linse.
  11. Statistisk analyse med ønskede software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af protokollen præsenteres her, SD-okt scanner og SLO billeder blev fremstillet af Cx3cr1normal god landbrugspraksis/NGL mus i samme imaging-session. Figur 3 omfatter repræsentant SD-OCT enkelt scanninger opnås med en 30 ° eller en 55 ° linse (figur 3A) og repræsentative SLO billeder opnås med en 55 ° eller en 102 ° linse, hvor normal god landbrugspraksis positive mikroglia celler er visualiseret. Højere refleksionsevne af årehinden er observeret i SD-OLT scanninger opnås med de 30 ° i forhold til 55 ° linse. Retinal arkitektur er imidlertid klart i både 30 ° og 55 ° billeder (figur 3, højre forstørrede billeder). Efter manuelle korrektioner af retinale grænser (inderste begrænsning og basere membran), en god korrelation af retinale tykkelsesmålinger blev observeret mellem de 30 o og 55 ° linsen ved måling i samme afstand fra synsnerven hoved ( Figur 3 c; Pearson korrelation = 0.967, p < 0,0001). Tidligere undersøgelser har vist, at retinal tykkelsesmålinger på SD-okt scanninger korrelat godt med ex vivo målinger på histologiske retinal afsnit15,31 og dermed SD-OLT kan bruges som en non-invasiv teknik retinal tykkelse målinger. Ved hjælp af SLO, kunne vi identificere normal god landbrugspraksis positive mikroglia celler som hyperreflective signal i auto fluorescerende billeder, men bredt felt 102 ° linse var i stand til at dække en større fundus område i forhold til 55 ° linse. SLO kan også udnyttes til overvågning af retinale mikroglia celler distribution og aktivering i reporter mus med en funktionel fractalkine receptor (Cx3cr1normal god landbrugspraksis / + mus) i normal eller syge nethinde12, 21,32. Kombination af SD-OLT med SLO i den samme imaging session kan give oplysninger om mikroglia distribution og aktivering ved retinal degeneration og kunne være nyttige for overvågningen retinal sygdomme i mus21.

Figure 1
Figur 1: repræsentativt billede af den enhed, der bruges i den nuværende undersøgelse. For at billedet det højre øje med musen, er musen placeret på den venstre del af den skræddersyede platform med sin højre bane mod linsen og dens krop ligge liggende på den venstre del af platformen. Højden på platformen kan blive justeret ved at dreje med uret (til at sænke platformen) eller mod uret (til at opløfte platformen) "hage resten justering". Filter håndtaget skal placeres til "A" til at tillade IR + OLT og AF billedbehandling. Med fokus knop (ikke synlig på figuren), kan eksperimentatoren ændre fokus for scanneren. Micromanipulator kan bruges til at belyse og justere nethinden for høj kvalitetsbilleder korrekt. Målet kan flyttes op, ned, højre eller venstre ved kamera håndtag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Illustration af enhedens kontrolpanel. (A) på venstre del af kontrolpanelets display erhvervelse tilstande kan vælges (infrarød, IR; auto fluorescens, AF eller indocyanine grøn angiografi, ICGA, kombinerede eller ikke med optisk kohærens tomografi, OCT). På den midterste del af panelet kan erhvervelse indstilling vælges (intensiteten af hvis billede, afsnit eller volumen scanninger). Synsfeltet bestemmes af de indlæste linse. Med følsomhed knop kan IR eller AF billedets lysstyrke indstilles. Ved at trykke på følsomhed knop, starter softwaren gennemsnit billeder fremstillet i IR eller AF at give en lang-seriøs billed. (B) Illustration af menuen erhvervelse mønster. (C) oversigt over funktioner, der bruges i software med det tilsvarende ikon. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: OCT scanner og auto fluorescerende billeder af Cx3cr1normal god landbrugspraksis/NGL mus nethinder. (A) B-scanninger af musen nethinden opnås med en 55 ° (øverste panel) eller en 30 ° linse (nederste panel). Højere forstørrelser af de gule bokse præsenteres på højre panel. (B) billeder af normal god landbrugspraksis positive mikroglia celler i nethinder af Cx3cr1normal god landbrugspraksis/NGL mus fremstillet med en 55 ° og en 102 ° linse (venstre og højre paneler, henholdsvis). (C) Retinal tykkelsesmålinger, målt på samme afstand fra synsnerven hovedet på SD-okt scanninger stammer fra 30 ° og 55 ° linsen. En god korrelation blev observeret mellem de to linser (Pearson korrelation = 0.967). Skalere barer: 200 µm, 100 µm på forstørret SD-okt billeder (en, højre panel). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikel viser en protokol for erhvervelse af retinale B-scanninger og billedbehandling af normal god landbrugspraksis positive mikroglia distribution i mus nethinden i samme imaging-session. SD-OCT og SLO bruges i stigende grad i dyremodeller af retinal sygdom for at give oplysninger af retinale forandringer over tid10,14,17,18,21. Med denne protokol, Cx3cr1normal god landbrugspraksis/NGL eller Cx3cr1normal god landbrugspraksis / + mus nethinden kan være afbildet i ikke-invasivt og kan indhentes oplysninger af retinale tykkelse. Dette er kritisk vigtigt i retinal sygdom eksperimentelle modeller, hvor sygdommens sværhedsgrad ændrer sig over tid, eller når terapeutiske behandlinger er testet. Protokollen beskrives desuden, hvordan reporter mus linjer kan udnyttes til i vivo billeddannelse af fluorescerende celler i nethinden.

Protokollen præsenteres her har dog visse begrænsninger. Første kan billeddannelse af musen nethinden i enheder designet til mennesker være udfordrende på grund af den højere samlede optiske effekt af musen øjet, hvilket kan føre til lateral forstørrelse unøjagtigheder7. De aksiale SD-okt målinger er imidlertid præcis8. Derudover opfølgende undersøgelse i mus ved hjælp af indstillingen "Opret henvisning" af softwaren er temmelig vanskelig på grund af den ikke faste holdning med musen på platformen og dermed langsgående billeddannelse af musen nethinder kan være udfordrende. Langsgående justering af øjet kan opnås ved at placere synsnerven i midten af det infrarøde billede og derefter får de ønskede billeder. For at korrigere for øje rotation, manuelle tilpasninger af SD-okt da ansigt billeder kan udføres efter erhvervelse og anvendelse på tykkelsesmålinger som beskrevet andetsteds33. Udover den imaging system, der anvendes i denne protokol, blevet andre billeddiagnostiske systemer også udviklet, der giver en større vinkel og kan billedet en større retinal område uden brug af kontaktlinse. Optos kan for eksempel dække en større retinal overflade men med større billede variation i forhold til den enhed, der bruges i nuværende undersøgelse34. På trods af disse begrænsninger, kan denne protokol udnyttes i flere eksperimentelle modeller af retinal sygdom. De oplysninger, der kan opnås indeholder retinal tykkelse ændringer (hævelse, atrofi), påvisning af nethindeløsning eller tilstedeværelsen af hyperreflective prikker og fluorophore-mærket celler og stigning eller fald af deres numre.

Kombination af de to metoder i mus heterozygous for udtryk for Cx3cr1 (Cx3cr1normal god landbrugspraksis / +), som har en funktionel fractalkine receptor, muliggør eksperimentatoren samtidig opdager i vivo ændringer af retinale integritet i realtid og mulige mikroglia ophobning i nærheden af retinale abnormiteter (fx, retinal hævelse, retinal atrofi) under retinal sygdom eller skade. Derudover anvender morfometrisk analyse, mikroglia aktiveringstilstanden kan vurderes baseret på soma størrelse og kompleksitet af mikroglia behandler21. I retinal sygdomme, såsom retinal vene okklusion, er aktivering og ophobning af mikroglia/makrofager på retinal atrofisk sites blevet observeret27. Desuden i mus defekt for Nr2e3 gen (nukleare Receptor underfamilie 2 gruppe E medlem 3), en musemodel af den recessively nedarvede forbedret S-kegle følsomhed syndrom (økonomiske), det ydre nukleare lag folde (rosetter) kan observeres på tidligt postnatal dage.

Interessant, mikroglia celler kan findes inde i rosetter og det er blevet foreslået, at mikroglia kan bidrage til degeneration af fotoreceptorer observeret i nethinder af disse mus35,36. Da aktivering af mikroglia har været impliceret i er en bred vifte af retinale sygdomme og nogle gange ledsaget af ændringer i retinal arkitektur10,27,37,38 , kombination af SD-OCT og SLO kan afsløre sammenhænge mellem mikroglia aktivering og retinal degeneration. Trods nogle udfordringer, den nuværende protokol kan levere disse oplysninger på langs, og det ville således være værdifulde for korrelationen mellem nethinde beskadige med mikroglia distribution/aktivering og for overvågning af terapeutisk behandling effektivitet21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en bevilling af den schweiziske National Science Foundation (SNSF, #320030_156019). Forfatterne fik støtte fra Heidelberg Engineering GmBH, Tyskland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectralis Imaging system (HRA+OCT) Heidelberg Engineering, Germany N/A ophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye Explorer Heidelberg Engineering, Germany N/A Version 1.9.13.0
78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens Volk Optical Inc., Ohio, USA V78C
Spectralis wide angle 55° lens Heidelberg Engineering, Germany 50897-002
ultra widefield 102° lens Heidelberg Engineering, Germany 50117-001
medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) Provet AG, Lyssach, Switzerland Swissmedic Nr. 50'590 - ATCvet: QN05CM91 anesthetic/analgesic
ketamine 50mg/ml (Ketalar) Parke-Davis, Zurich, Switzerland 72276388 anesthetic
tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) ISPI, Bern, Switzerland N/A pupil dilation
Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany 9151125
hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) OmniVision, Neuhausen, Switzerland N/A
+4 dpt rigid gas permeable contact lens Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY N/A Base Curve: 7.20 to 8.40 mm
Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm
Power: -25.00 to +25.00 Diopters
balanced salt solution (BSS) Inselspital, Bern, Switzerland N/A
silicon forceps N/A N/A
atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) Provet AG, Lyssach, Switzerland N/A α2 adrenergic receptor antagonist
GraphPad Prism 7 GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA N/A statistical analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Madeira, M. H., Boia, R., Santos, P. F., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Contribution of microglia-mediated neuroinflammation to retinal degenerative diseases. Mediators Inflamm. , 673090 (2015).
  2. Ng, T. F., Streilein, J. W. Light-induced migration of retinal microglia into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (13), 3301-3310 (2001).
  3. Langmann, T. Microglia activation in retinal degeneration. J Leukoc Biol. 81 (6), 1345-1351 (2007).
  4. Joly, S., et al. Cooperative phagocytes: resident microglia and bone marrow immigrants remove dead photoreceptors in retinal lesions. Am J Pathol. 174 (6), 2310-2323 (2009).
  5. Arroba, A. I., Alvarez-Lindo, N., van Rooijen, N., de la Rosa, E. J. Microglia-mediated IGF-I neuroprotection in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 9124-9130 (2011).
  6. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Exp Eye Res. 81 (6), 700-709 (2005).
  7. Geng, Y., et al. Optical properties of the mouse eye. Biomed Opt Express. 2 (4), 717-738 (2011).
  8. Lozano, D. C., Twa, M. D. Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in SD-OCT imaging. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).
  9. Vaz-Pereira, S., et al. Optical Coherence Tomography Features Of Active And Inactive Retinal Neovascularization In Proliferative Diabetic Retinopathy. Retina. 36 (6), 1132-1142 (2016).
  10. Kokona, D., Haner, N. U., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. Imaging of macrophage dynamics with optical coherence tomography in anterior ischemic optic neuropathy. Exp Eye Res. , (2016).
  11. Makiyama, Y., et al. Macular cone abnormalities in retinitis pigmentosa with preserved central vision using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. PLoS One. 8 (11), e79447 (2013).
  12. Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
  13. Joshi, R., et al. Spontaneously occurring fundus findings observed using confocal scanning laser ophthalmoscopy in wild type Sprague Dawley rats. Regul Toxicol Pharmacol. 77, 160-166 (2016).
  14. Muraoka, Y., et al. Real-time imaging of rabbit retina with retinal degeneration by using spectral-domain optical coherence tomography. PLoS One. 7 (4), e36135 (2012).
  15. Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
  16. Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
  17. Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
  18. Huber, G., et al. Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5888-5895 (2009).
  19. Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative Analysis of Mouse Retinal Layers Using Automated Segmentation of Spectral Domain Optical Coherence Tomography Images. Transl Vis Sci Technol. 4 (4), 9 (2015).
  20. Sim, D. A., et al. A simple method for in vivo labelling of infiltrating leukocytes in the mouse retina using indocyanine green dye. Dis Model Mech. 8 (11), 1479-1487 (2015).
  21. Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. J Vis Exp. (99), e52731 (2015).
  22. Acton, J. H., Cubbidge, R. P., King, H., Galsworthy, P., Gibson, J. M. Drusen detection in retro-mode imaging by a scanning laser ophthalmoscope. Acta Ophthalmol. 89 (5), e404-e411 (2011).
  23. Greenstein, V. C., et al. Structural and functional changes associated with normal and abnormal fundus autofluorescence in patients with retinitis pigmentosa. Retina. 32 (2), 349-357 (2012).
  24. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  25. Wang, X., et al. Requirement for Microglia for the Maintenance of Synaptic Function and Integrity in the Mature Retina. J Neurosci. 36 (9), 2827-2842 (2016).
  26. Ebneter, A., Casson, R. J., Wood, J. P., Chidlow, G. Microglial activation in the visual pathway in experimental glaucoma: spatiotemporal characterization and correlation with axonal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6448-6460 (2010).
  27. Ebneter, A., Kokona, D., Schneider, N., Zinkernagel, M. S. Microglia Activation and Recruitment of Circulating Macrophages During Ischemic Experimental Branch Retinal Vein Occlusion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 944-953 (2017).
  28. Lin, Y. L., Potter-Baker, K. A. Using theoretical models from adult stroke recovery to improve use of non-invasive brain stimulation for children with congenital hemiparesis. J Neurophysiol. , (2017).
  29. Combadiere, C., et al. CX3CR1-dependent subretinal microglia cell accumulation is associated with cardinal features of age-related macular degeneration. J Clin Invest. 117 (10), 2920-2928 (2007).
  30. Bermudez, M. A., et al. Time course of cold cataract development in anesthetized mice. Curr Eye Res. 36 (3), 278-284 (2011).
  31. Toth, C. A., et al. A comparison of retinal morphology viewed by optical coherence tomography and by light microscopy. Arch Ophthalmol. 115 (11), 1425-1428 (1997).
  32. Ebneter, A., Kokona, D., Jovanovic, J., Zinkernagel, M. S. Dramatic Effect of Oral CSF-1R Kinase Inhibitor on Retinal Microglia Revealed by In Vivo Scanning Laser Ophthalmoscopy. Transl Vis Sci Technol. 6 (2), 10 (2017).
  33. Gabriele, M. L., et al. Reproducibility of spectral-domain optical coherence tomography total retinal thickness measurements in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6519-6523 (2010).
  34. Nakao, S., et al. Wide-field laser ophthalmoscopy for mice: a novel evaluation system for retinal/choroidal angiogenesis in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5288-5293 (2013).
  35. Wang, N. K., et al. Origin of fundus hyperautofluorescent spots and their role in retinal degeneration in a mouse model of Goldmann-Favre syndrome. Dis Model Mech. 6 (5), 1113-1122 (2013).
  36. Wang, N. K., et al. Cellular origin of fundus autofluorescence in patients and mice with a defective NR2E3 gene. Br J Ophthalmol. 93 (9), 1234-1240 (2009).
  37. Thanos, S. Sick photoreceptors attract activated microglia from the ganglion cell layer: a model to study the inflammatory cascades in rats with inherited retinal dystrophy. Brain Res. 588 (1), 21-28 (1992).
  38. Hughes, E. H., et al. Generation of activated sialoadhesin-positive microglia during retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (5), 2229-2234 (2003).

Tags

Medicin sag 129 mikroglia retina optisk kohærens tomografi scanning laser oftalmoskopi i vivo billeddannelse oftalmologi
<em>In Vivo</em> Billeddannelse af <em>Cx3cr1<sup>normal god landbrugspraksis/NGL</sup> </em> Reporter mus med røde-domæne optisk kohærens tomografi og Scanning Laser oftalmoskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter,… More

Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy. J. Vis. Exp. (129), e55984, doi:10.3791/55984 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter