Summary
ここでは、臍帯血単核球由来ヒト由来多能性幹細胞からの軟骨分化のプロトコールを提案する。
Abstract
人間の関節軟骨は、それ自体を修復する能力が欠けている。従って、軟骨変性は治癒的ではなく、保存的治療によって治療される。現在、 エクスビボで増殖した軟骨細胞または骨髄由来間葉系幹細胞（BMSC）を用いて損傷軟骨を再生する努力がなされている。しかしながら、これらの細胞の制限された生存能力および不安定性は、軟骨再建におけるそれらの適用を制限する。ヒトに誘導された多能性幹細胞（hiPSC）は、再生的応用のための新しい選択肢として科学的な注目を集めている。無制限の自己複製能力と多能性を有することにより、hiPSCは、軟骨修復のための新しい置換細胞源として注目されている。しかし、高品質の軟骨形成性のペレットを大量に得ることは、臨床応用への大きな課題です。この研究では、胚様体（EB）由来の外胚葉細胞を軟骨分化のために使用した。成功した軟骨形成は、PCRおよびアルシアンブルー、トルイジンブルー、およびコラーゲンI型およびII型（それぞれCOL1A1およびCOL2A1）に対する抗体で染色した。我々は、臍帯血単核細胞由来iPSC（CBMC-hiPSC）の軟骨形成性ペレットへの分化のための詳細な方法を提供する。
Introduction
hiPSCsの使用は、薬物スクリーニングおよび種々の疾患の機械的研究のための新しい戦略を表す。再生的な観点から、hiPSCsはまた、関節軟骨1,2などの治癒能力が限定された損傷組織の置換のための潜在的な供給源でもある。
天然の関節軟骨の再生は、数十年にわたり挑戦されてきた。関節軟骨は柔らかく白い組織で、骨の端を覆い、摩擦から保護します。しかし、損傷したときの再生能力は限られており、自己修復はほとんど不可能である。したがって、数十年にわたって軟骨の再生に焦点を当てた研究が進行中である。
従来、軟骨形成系統へのインビトロ分化は、通常、膝関節から単離したBMSCまたは天然軟骨細胞を用いて行った3 。原因それらの軟骨形成能、BMSCおよび天然軟骨細胞は、軟骨形成におけるそれらの使用を支持する多くのメリットを有する。しかし、それらの限定された拡大および不安定な表現型のため、これらの細胞は、関節軟骨欠損の再構築にいくつかの限界に直面する。 インビトロ培養条件下では、これらの細胞は3-4継代後にそれら自身の特徴を失う傾向があり、最終的にそれらの分化能力に影響を及ぼす4 。また、天然軟骨細胞の場合、これらの細胞を得る際には、膝関節へのさらなる損傷が不可避である。
BMSCまたは天然軟骨細胞とは異なり、hiPSCはインビトロで無期限に増殖することができる。適切な培養条件では、hiPSCは軟骨分化の代替源として大きな可能性を秘めています。しかし、hiPSCの本質的な特性を変えることは難しい5 。さらに、それはいくつかの複雑なin vitro ste特定の細胞型にhiPSCsの運命を導くps。これらの合併症にもかかわらず、hiPSCsの使用は、自己複製能力が高く、軟骨細胞を含む標的細胞に分化する能力があるため、依然として推奨されている6 。
軟骨形成分化は、通常、MSC様前駆細胞を用いて、ペレット培養またはマイクロマス培養などの三次元培養系で行われる。 hiPSCを使用する場合、MSC様前駆細胞を生成するプロトコルは、既存のプロトコルとは異なる。いくつかのグループは、表現型をMSC様細胞に直接変換するために、hiPSCの単層培養を用いる。しかし、ほとんどの研究では、EBを用いてMSC8,9,10,11に似た外殖細胞を生成しています。
様々なタイプの成長因子を用いてコンドロゲを誘導するnesis。通常、BMPおよびTGFβファミリータンパク質は、単独でまたは組み合わせて使用される。分化は、GDF5、FGF2、およびIGF1などの他の因子によっても誘導されている12,13,14,15。 TGFβ1は、MSCs 16において用量依存的に軟骨形成を刺激することが示されている。他のアイソタイプであるTGFβ3と比較して、TGFβ1は、軟骨前軟骨間細胞の凝縮を増加させることによって軟骨形成を誘導する.TGFβ3は、間葉細胞増殖を有意に増加させることにより軟骨形成を誘導する17 。しかし、TGFβ3は、TGFβ1より研究者により頻繁に用いられる7,10,18,19。 BMP2は、ヒトにおける軟骨形成性マトリックス成分に関連する遺伝子の発現を増強するインビトロ条件下での関節軟骨細胞20 。 BMP2は、TGFβタンパク質21と組み合わせてMSCにおける軟骨形成に重要な遺伝子の発現を増加させる21 。 BMP2は、SmadおよびMAPK経路22を介してTGFβ3の効果を相乗的に増強することも示されている22 。
この研究では、CBMC-hiPSCを、低付着ペトリ皿中でEB培地を用いてEBに凝集させた。伸長細胞は、EBをゼラチンコートディッシュに付着させることによって誘導された。外胚葉細胞を用いた軟骨形成分化をペレット培養により行った。 BMP2およびTGFβ3の両方による処理は、細胞を首尾よく凝縮させ、軟骨形成ペレット形成のための細胞外マトリックス（ECM）タンパク質蓄積を誘導した。この研究は、CBMC-hiPSCを用いた単純で効率的な軟骨形成分化プロトコルを示唆している。
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Protocol
このプロトコルは、カトリック大学（KC12TISI0861）の制度審査委員会によって承認された。再プログラミングに使用したCBMCは、ソウル・セント・メアリー病院の臍帯血バンクから直接入手した。
1. iPSCとの軟骨形成分化
- CBMC-iPSC生成
- 先の研究23に示されたプロトコルを用いてCBMC-hiPSCを生成する。
- 血球を15 mLコニカルチューブに集め、血球計数器を使用して数えます。
- 3×10 5細胞を調製し、515×gおよびRTで5分間遠心分離する。吸引によって上清を捨て、血球培地0.5mLに細胞を再懸濁する。
- 細胞をコーティングされていない24ウェルプレートのウェルに移し、製造者の推奨に従って、センダイウイルス混合物を添加する。
- 1,150 xgおよび30℃で30分間プレートを遠心分離する。
- 後部37℃、5％CO 2で一晩（O / N）インキュベートする。
- 翌日、形質導入された細胞をマトリックス被覆ウェルに移す。 30℃で30分間1,150 xgでプレートを遠心分離する。
- 遠心分離後、上清を除去し、1mLのiPSC培地を添加し、37℃、5％CO 2で細胞O / Nを維持する。
- 37℃および5％CO 2で付着細胞を維持する。毎日培地を交換し、新鮮なiPSC培地に交換してください。
注：コロニーは、形質導入後14日目〜21日に出現する。
- EB生成
- 37℃および5％CO 2で hiPSCを維持する。新鮮なEssential 8（E8）培地と交換して、培地を毎日交換してください。
- E8培地でビトロネクチンでコーティングした100 mmディッシュで2 x 10 6個の hiPSCを調製します。
- 培養ディッシュからE8培地を除去し、滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄する。
- 1を加えるmLの1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を添加し、37℃および5％CO 2で2分間インキュベートする。
- 3mLのE8培地で細胞を採取し、新しい15mLコニカルチューブに移す。室温（RT）で2分間250xgで細胞を遠心分離する。
- 細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引し、E8培地5 mLに細胞を再懸濁する。
- 血球計数器を用いて細胞を計数し、100mmペトリ皿ごとに2×10 6個の細胞を調製する。調製した細胞を、10μMのρ-関連キナーゼ（ROCK）阻害剤を含むE8およびEB培地（1：1）の10mL混合物中に再懸濁する。
- 37℃、5％CO 2で細胞をO / Nでインキュベートする。
- 翌日、ピペットで集めたEBを採取する。細胞を250xgで1分間遠心分離する。上清を除去し、10mLの新鮮なE8培地にEBを再懸濁する。
- 生成されたEBを5日間拡大し、毎日の変更をfresで行うh E8培地。さらに成熟するために、培養培地をE7培地に交換する。 37℃、5％CO 2でさらに5日間EBを維持し、新鮮なE7培地で毎日培地を交換する。
注：E7培地は、FGF2を含まないE8培地である。
- EBからの伸長細胞誘導
- 1％ゼラチン6mLを100mmディッシュに加え、37℃および5％CO 2で30分間インキュベートする。
- 使用前にゼラチンを取り出し、2〜3時間完全に乾燥させます。
- EBを50 mLコニカルチューブに移す。 EBがコニカルチューブの底に落ち着くようにします。 EBを乱すことなく上清を除去する。
- EBを20％ウシ胎児血清（FBS）を含む10mLのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）に再懸濁する。 EBをゼラチンコートされた100mmディッシュに移す。 10μMのROCK阻害剤を添加する。
- 細胞を37℃、5％CO 2で7日間インキュベートし、維持する。私を変えるROCK阻害剤を添加することなく1日おきに投与する。
- 軟骨形成のペレット形成
- 皿から培地を吸引し、細胞をPBSで3回洗浄する。
- 1 mM EDTA 1 mLを加え、37℃、5％CO 2で2分間インキュベートする。
- 20％FBSを含む5mLのDMEMを用いて細胞を採取し、新しい15mLコニカルチューブに移す。
- 細胞を250 xgおよび室温で2分間遠心分離する。上清を捨て、20％FBSを含む10mLのDMEMにペレットを再懸濁する。
- 濾過し、40μmの細胞ストレーナーを用いて細胞塊を捨て、単一の細胞を回収する。血球計数器を用いて単一細胞を計数する。
- 細胞を250 xgおよび室温で2分間遠心分離する。 100μLの軟骨形成分化培地（CDM）を含む15mLコニカルチューブ中にペレットあたり上清および種子3×10 5細胞を除去する。
- ペレット形成のために、細胞を5分間、680×gおよびRT。
注：ペレットは、軟骨形成性のペレットの分化の間、15mLの円錐管中に維持される。 - 37℃および5％CO 2で一晩細胞をインキュベートする。
- 2〜3日ごとにCDMを変更してください。 3日以内に、ペレットは平らで回転楕円体の形態を示す。 37℃および5％CO 2で21日間ペレットを維持する。
2.染色による軟骨形成ペレットのキャラクタリゼーション
- 軟骨形成包埋
- 包埋する前に、58℃でパラフィンを調製し、溶解する。
- ペレットを1 mLの4％パラホルムアルデヒドに1.5 mLチューブで室温で2時間固定する。
注意：パラホルムアルデヒドは非常に有毒である。眼、皮膚、粘膜との接触を避ける。暴露を最小限にし、吸入を避ける。 - ガセットの1つの層をカセットに置き、ピペットを使用して固定ペレットを移す。折りたたむことでペレットを覆うカセット蓋を閉じます。
- 100mLの70％エタノール（EtOH）中で10分間ずつ2回脱水を開始する。 80％および95％EtOH中で連続的に10分間洗浄することによりペレットを脱水する。
- ペレットを10分間100％EtOHに移す。新鮮なEtOHで3回繰り返します。
- 「清澄化」するために、溶液をEtOHとキシレンの100mL、1：1混合物と交換し、続いてEtOHとキシレンの1：2混合物をそれぞれ10分間交換する。ペレットを100％キシレンで2回、それぞれ10分間インキュベートすることによって残りのEtOHを除去する。
- パラフィン浸透のために、ペレットを連続キシレンおよびパラフィン混合物中でインキュベートする。パラフィン浸透プロセス全体を58℃で実施する。ペレットを100mLのキシレンとパラフィンの2：1混合物に30分間インキュベートする。
- 溶液をキシレンとパラフィンの1：1混合物100mLと交換し、30分間インキュベートする。
- この溶液をキシレンとパラフィンの1：2混合物100mLに交換し、30分。
- 最終的な浸潤のために、ペレットを100％パラフィンの最初の浴に移し、2時間インキュベートする。
- ペレットを100％パラフィンの第2の浴に移し、58℃でO / Nをインキュベートする。
- 翌日、ピンセットを使ってペレットを金型に静かに移す。パラフィンディスペンサーからモールドにパラフィンを加えます。パラフィンを4℃で30分間固めます。
- 切片を7μmでスライスし、切片をスライド上に移す。スライドを一晩乾燥させ、使用準備が整うまでRTで保存します。
- スライドの準備
- 100％、90％、80％、および70％EtOHの各100mLを順次5分間ずつ移動させることにより、スライドを脱パラフィンする。
- スライドガラスをガラス瓶に入れ、水道水で5分間すすぎます。
- アルシアンブルー染色
- スライドを1％アルシアンブルー溶液50 mLに30分間インキュベートする。
NOTE：アルシアンブルーを3％酢酸溶液で希釈する。酢酸を用いてpHを2.5に調整する。 - スライドガラスをガラス瓶に入れ、水道水で2分間すすいでください。
- スライドを脱イオン水（DW）ですすぎ、核高速赤色溶液で2分間対比染色する。
- スライドをガラス瓶に入れ、水道水で1分間すすいでください。
- 2.3.5）手順2.6でスライドを脱水してマウントします。
- スライドを1％アルシアンブルー溶液50 mLに30分間インキュベートする。
- トルイジンブルー染色
- スライドを50mLのトルイジンブルー溶液で4分間インキュベートする。
- スライドガラスをガラス瓶に入れ、水道水で5分間すすぎます。
- 手順2.6でスライドを脱水してマウントします。
- 免疫組織化学的染色
- 内因性ペルオキシダーゼをブロックするために、スライドを3％H 2 O 2中で15分間インキュベートする。
- 1：100に希釈した一次抗体（抗COL1A1および-COL2A1）200μLをトリスバスライドに1％ウシ血清アルブミン（BSA）と5％正常ヤギ血清（NGS）を含む生理食塩水（TBS）を加え、4℃でO / Nをインキュベートする。
- 翌日、スライドをガラス瓶に入れ、0.1％ポリソルベート20（TBST）を含む50mLのTBSでそれぞれ5分間3回洗浄する。
- スライドに2次抗体（ヤギ抗ウサギIgG抗体、1％BSAおよび5％NGSを含有するTBS中に1：200希釈）200μLを適用し、RTで40分間インキュベートする。
- ガラス瓶にスライドを置き、それぞれ5分間50 mLで3回洗浄する。
- シグナル増幅のために、HRP結合ストレプトアビジン溶液をスライドにアプライし、10分間インキュベートする。
- ガラス瓶にスライドを置き、それぞれ5分間50 mLで3回洗浄する。
- DAB-ペルオキシダーゼ基質溶液を混合し、各スライドに200μLの溶液を適用し、1分間インキュベートする。
- スライドガラスをガラス瓶に入れ、水道水で5分間すすぎます。
- 対比染色Mayerのヘマトキシリンで1分間処理した。
- DWでスライドを洗う。
- 手順2.6でスライドを脱水してマウントします。
- 脱水とマウント
- 70％、80％、90％、および100％EtOHの各100mLを順番に移動させてスライドを脱水する。
- スライドを1分間、キシレンの2回の変更に浸漬する。
- カバースリップに50μLのマウント溶液を加え、スライドを上に置きます。
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Representative Results
この研究では、EB細胞から伸長細胞を誘導することにより、CBMC-hiPSCから軟骨形成性ペレットを作製した。多分化能が高いことが確認されたCBMC-hiPSCを用いて軟骨形成分化を誘導した11 。我々のプロトコルの簡単なスキームを図1Aに示す 。分化の前に、iPSCコロニーを拡大した（ 図1B ）。拡大されたiPSCをEBとして組み立て、分化を開始した（ 図1C ）。生成したEBをゼラチンコートディッシュに付着させて、伸長細胞を誘導した（ 図1D ）。次いで、伸長細胞を回収し、軟骨形成性のペレットを生成するために使用した。 21日の分化後、小さなビーズ様軟骨形成性のペレットを得て、さらなる特徴付けに使用した（ 図1E ）。 インビトロで生成されたチョンの品質種々のアッセイによってドロジックペレットを確認した。
本発明者らは21日目に軟骨形成性のペレットの質を組織学的に評価した.BMSC軟骨形成性のペレットを陽性対照として用いた。分化した軟骨細胞によって分泌されたECMタンパク質の蓄積は、 図2Aのアルシアンブルーおよびトルイジンブルー染色によって確認された。ラクナおよびプロテオグリカン産生などの健康な軟骨の主要な特徴は、分化プロセスが21日間にわたって継続するにつれて増加した。 CBMC-hiPSCから生成された軟骨形成性ペレットは、健康な軟骨における主要なECM成分であるCOL2A1を発現した（ 図2B ）。 CBMC-hiPSC由来のペレットのCOL2A1発現は、BMSC由来のペレットよりも高かった。線維性軟骨のマーカーであるI型コラーゲンの発現は、COL2A1の発現と比較してCBMC-hiPSC由来のペレットにおいて低かった。 21日目の軟骨形成ペレット中の軟骨ECMタンパク質の遺伝子発現を、リアルタイムPCRによって確認した。 CBMC-hiPSC由来ペレットのアグリカン（ACAN）発現は、BMSC由来ペレットのアグリカン（ACAN）発現と同様であった（ 図3A ）。 COL2A1の発現は、CBMC-hiPSC由来のペレットにおいて有意に高かった（ 図3B ）。軟骨形成前駆細胞マーカーである性決定領域Y-box 9（Sox9）の発現も評価した。 CBMC-hiPSCから生成したペレットは、高レベルのSox9を発現した（ 図3C ）。本発明者らは、これらの遺伝子が、21日目にBMSC対照ペレットと比較して、CBMC-hiPSC軟骨形成性ペレットにおいて有意に上方制御されることを確認した。肥大マーカーであるCOL1A1の発現を評価した（ 図3D ）。 CBMC-hiPSC由来のペレット中のCOL1A1の発現は、BMSC-デリペレット。分化効率を、COL2A1対COL1A1の比によって分析した（ 図3E ）。 CBMC-hiPSC由来のペレットにおける比の増加は、COL1A1と比較してCOL2A1の発現が比較的高いことを示した。結論として、本発明者らは、CBMC-hiPSCの軟骨分化能力を確認した。生成されたCBMC-hiPSC由来の軟骨形成性ペレットの品質は、BMSCの品質と適合する品質を有していた。
図1：hiPSCsの軟骨形成分化。 （ A ）hiPSCからの軟骨形成ペレット生成のスキーム。 （ B ）生成されたCBMC-hiPSCの形態。 （ C ）生成されたEBの形態。 （ D ）ゼラチン被覆培養皿に付着したEB由来の外胚葉細胞。 （ E ）tの画像彼は21日間の分化後に軟骨形成ペレットを得た。間隔の単位はミリメートルで表示されます。スケールバー=200μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：軟骨形成ペレットの組織学的分析。 （ A ）アルシアンブルーおよびトルイジンブルー染色を用いた21日目の軟骨ペレットの組織学的評価。 （ B ）COL1A1およびCOL2A1抗体で染色された軟骨形成性ペレットの免疫組織化学画像。スケールバー=100μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：軟骨形成性ペレットの遺伝子発現。 （ A ）ACANの相対的遺伝子発現。 （ B ）COL2A1の相対的遺伝子発現。 （ C ）SOX9の相対的な遺伝子発現。 （ D ）COL1A1の相対的な遺伝子発現。 （ E ）COL1A1の遺伝子発現。 （ F ）COL10A1の遺伝子発現。 （ G ）COL2A1：COL1A1遺伝子発現の比。ペレットを収穫し、21日間の分化後に分析した。データはリアルタイムPCRを用いて得られ、サンプル当たり3回の実験（n = 3）の平均標準誤差として表示された。遺伝子発現は、内部対照としてGAPDHに対して標準化された。 （* p <0.05、** p <0.01、*** p <0.001）。k ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
| 細胞数 | 外殻細胞収量 | ペレット歩留まり | |
| hiPSCs | 2×10 6 | 2-5×10 7 | 70〜150 |
| MSC | 2×10 6 | - | 6 |
表1：MSCおよびhiPSCの収率比較。
| ターゲット名 | 方向 | プライマー配列 | サイズ |
| フォワード | TTCCGCGACGTGGACAT | 77 bp | |
| 逆 | TCAAACTCGTTGACATCGAAGGT | ||
| ACAN | フォワード | AGCCTGCGCTCCAATGACT | 107bp |
| 逆 | TAATGGAACACGATGCCTTTCA | ||
| COL2A1 | 前方に | GGCAATAGCAGGTTCACGTACA | 79bp |
| 逆 | CGATAACAGTCTTGCCCCACTTA | ||
| COL1A1 | フォワード | CCCCTGGAAAGAATGGAGATG | 148 bp |
| 逆 | TCCAAACCACTGAAACCTCTG |
表2：リアルタイムPCRにおける軟骨形成マーカーに対するプライマーの配列。
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Discussion
このプロトコルは、CBMCからhiPSCを首尾よく生成した。ヤマナカ因子24を含むセンダイウイルスベクターを用いて、CBMCをhiPSCに再プログラミングした24 。分化には3例を用い、すべての実験でこのプロトコールを用いて軟骨原性ペレットを作製した。多くの研究により、hiPSCの軟骨細胞への分化に関するプロトコールが報告されている25,26,27,28。しかし、CBMC-hiPSCsの軟骨の再生および回復の候補の使用を確認するためには、さらなる研究が必要である。
軟骨形成は、様々な体細胞型11,25,26,27,29から生成されたhiPSCを用いて確認された。多くのレポート再プログラムに使用される体細胞の起源がhiPSC30,31,32,33の分化結果に影響を及ぼし得ることを示す。臍帯血は、HSCおよびMSCが豊富な源である。血液細胞やMSCのような臍帯血由来の細胞の違いに関する報告はない。しかし、以前の研究では、関節軟骨細胞由来hiPSCは、臍帯血または皮膚線維芽細胞から産生されたhiPSCよりも軟骨形成を起こしやすいことが示されている29 。線維芽細胞、心臓前駆細胞、および内皮細胞から生成されたhiPSCを用いた内皮細胞分化の結果は、特に10〜20 34の初期継代において、最終分化iPSC誘導における組織特異的体細胞記憶を反映し得ることを示した。 hiPSCの初期継代において、内皮細胞 - デリved hiPSCsは、より効率的に内皮系統に分化した。しかし、これらの細胞系の間の有意差は、20継代を超えるhiPSCでは消失した。したがって、臨床研究で使用される初期の継代において、hiPSCによって保持される体細胞の記憶を注意深く検討することが重要である。
最近、欠陥のある関節軟骨を修復するための様々な処置が開発されている。微細亀裂は、自然修復のための骨髄の流入を誘発するために骨の複数の穴を穿孔することによって行われる35 。膝関節置換術（knee arthroplasty）としても知られている膝置換術は、損傷した軟骨を置換するために使用される。しかしながら、微小亀裂は、重度の関節軟骨損傷には有用ではなく、膝関節置換術に使用される器具は10〜15年ごとに交換しなければならない。
今日では、細胞ベースの療法は、軟骨修復の有望な代替方法である。自己由来の軟骨細胞移植（ACI）は広い細胞ベースの軟骨回復のために使用される。 ACIは、自己軟骨細胞を欠陥に直接注入することによって行われる。しかしながら、自己軟骨細胞は、インビトロ培養条件下で線維芽細胞様細胞に変化する。自己軟骨細胞の収穫プロセス中に、さらなる損傷が避けられない。 MSCは、軟骨再生のための細胞源として示唆されている。臍帯血は、エンジニアリング軟骨のためのMSCの有用で入手しやすい細胞源である（ 36） 。しかし、臍帯血MSCを単離するための成功率は議論の余地がある37,38 。数多くの研究が、臍帯血MSCの単離が成功したことを報告している。いくつかの研究では、臍帯血量はMSC単離の収率に影響する重要なパラメータであることが示されている36,39 。高品質のMSCを得るためには、細胞の通過も重要である。以前の研究では、MSCは、ある細胞分裂数の後に寿命が制限されています。老化に入ることにより、MSCは、正常な体細胞と同様に、増殖の減少を特徴とする40 。したがって、細胞老化および染色体異常を避けるために、臍帯血由来のMSCを6回目の継代の前に使用しなければならない41 。
これらの制限を回避するために、ヒトiPSCsは、生産性の高いパーソナライズされた細胞ベースの治療法の新たな可能性を開拓した11 。確立されたhiPSCは、理論的に無限に増殖することができる。また、ドナーと同じ免疫同一性で、 インビボで移植された場合、拒絶反応を回避し、副作用を低下させることができる。同種治療のための臍帯血バンクのhiPSCバンクへの移行は、多大な可能性と可能性を秘めている42 。再プログラム化前のホモ接合性HLA型CBMCのスクリーニングは、同種異系iPSC系統forの臨床治療。ホモ接合型iPSC系統は、同種移植後の免疫学的反応を避けることができる。この概念は、HLA-ホモ接合軟骨11を生成することによる軟骨再生にも適用することができる。
通常、軟骨形成分化は、2つの重要な段階：EB由来の外胚葉細胞の誘導およびペレット形成を介して行われる。 hiPSCのEB由来外胚葉細胞への初期分化は、それらの軟骨形成分化能を高めるために重要である。 hiPSCから分化した外胚葉細胞は、天然のBMSC 7,43と機能的および分子的に類似している。以前の研究では、間葉様細胞を誘導するための前分化段階として単層培養またはEB培養を用いた10,43。しかし、単層培養による直接的な分化は、EBの使用に比べて時間がかかり、また、chオンデンジェニックペレットは、肥大特性を有する線維軟骨に分化する傾向がある。発生した間葉系前駆細胞の細胞形態及び軟骨分化能は、細胞単層9の細胞密度によって大きく異なることが報告されている。
本発明者らは、単層培養と比較して比較的迅速かつ簡単な方法である外生細胞を誘導するためにEBを使用した。このプロトコルを使用して、我々は比較的少数のhiPSCを用いて多くのペレットを生成することができた（ 表1 ）。 EBのサイズおよび数は、成功した軟骨形成性のペレットの大量生産のために重要であった。その理由から、我々は、生成されたEBの半分以上が100μmより大きくなるまで、E8培地中で凝集したEBを拡大した。 EB拡大後、我々はFGF2を含まないE8培地でEBを維持した。以前は、研究者らは、中胚葉系統誘導のためにFGF2を含まないEBを産生したxref "> 9。
生成された外生細胞をより高密度で維持しようと試みたにもかかわらず、いくつかの限界が依然として残っています。生成された外生細胞が類似の形態を共有することを確認したが、細胞は依然として異種である可能性がある。以前の研究では、特定の細胞型を選別しようと試みた。しかしながら、この手順は、少数の細胞の収集をもたらした。強化された特性を有する多量の軟骨形成性ペレットを生成するためには、より大きなスケールで均一な外殖細胞を単離するための新しい試みが必要となる。
様々なグループが、単層またはEB培養を用いてhiPSCから前駆細胞を誘導している。 MSCと高い類似性を有する前駆細胞の誘導は、より高品質の軟骨形成性のペレットを得るための鍵となり得る。 EBに由来するこれらの前駆細胞は、MSCのものと同様の特徴を有する。しかし、これは線維芽細胞性である。したがって、外胚葉細胞に関する詳細な検証研究が必要である。
この研究では、比較的多量の軟骨形成性ペレットを生成することができるプロトコールを提案する。本発明者らは、CBMC-hiPSCを用いて再生された軟骨は健康な表現型を示し、組織再生のための材料として使用できることを確認した。しかしながら、さらなる適用のためには、より短い分化スケジュールを有する改善された方法が必要である。より高いレベルのヒアルリンで軟骨を検証するための品質管理基準のさらなる開発は、軟骨再生のための細胞材料としてCBMC-hiPSCを将来適用する場合にも必要とされる。プロトコールは単純であるが有効であり、ペレット形成の前に追加の選別プロセスを必要としない。結論として、このプロトコルを使用して、高品質軟骨ペレットを、疾患モデリング、薬物スクリーニング、および再生医療に関する研究のために生成して、t彼は軟骨の性質。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この作業は、韓国保健医療技術研究開発プロジェクト（HI16C2177）の助成を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Description |
| E8 Medium Materials | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | E8 Medium (500 mL) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | E8 Medium (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | E8 Medium (Conc.: 100 ng/mL) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | E8 Medium (Conc.: 64 μg/mL) |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Name | Company | Catalog Number | Description |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Alcian blue | Sigma Aldrich | A3157-10G | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252-25G | |
| Safranin O | Sigma Aldrich | 090m0039v | |
| Nuclear fast red | Americanmastertech | STNFR100 | |
| xylene | Duksan | 115 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| Mayer's hematoxylin solution | wako pure chemical industries | LAK7534 | |
| DAP | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| Name | Company | Catalog Number | Description |
| Chondrogenic Differentiation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | Chondrogenic media component (500 mL) |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | Chondrogenic media component (Conc.: 1%) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM) |
| rhBMP-2 | R&D | 355-BM-050 | Chondrogenic media component (Conc.:100 ng/ml) |
| Recombinant Hman TGF-beta3 | R&D | 243-B3-002 | Chondrogenic media component (Conc.:10 ng/ml) |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Chondrogenic media component (Conc.: 1%) |
| ITS+ Premix | BD | 354352 | Chondrogenic media component (Conc.: 1%) |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma Aldrich | D2915-100MG | Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M) |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | Chondrogenic media component (Conc.: 1%) |
| Sodium pyruvate solution | Sigma Aldrich | S8636 | Chondrogenic media component (Conc.: 1%) |
| L-Proline | Sigma Aldrich | P5607-25G | Chondrogenic media component (40 μg/ml) |
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