Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

Published: February 28, 2019 doi: 10.3791/55989
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University

Summary

We beschrijven de gedetailleerde procedures en de strategieën voor het meten van de mechanische eigenschappen en mechanische ontvouwen trajecten van één eiwitmolecules met behulp van een atomic force microscope. We tonen ook representatieve resultaten als een referentie voor selectie en motivering van goed één eiwit molecuul opnames.

Abstract

De bepaling van het vouwen proces van eiwitten uit hun aminozuur volgorde naar hun oorspronkelijke 3D-structuur is een belangrijk probleem in de biologie. Atomaire kracht microscopie (AFM) kan dit probleem aanpakken doordat rekken en ontspanning van één eiwitmolecules, waardoor direct bewijs van specifieke ontvouwen en uiteinde kenmerken. AFM gebaseerde single-molecuul kracht-spectroscopie (AFM-SBF) biedt een manier voor het consequent meten van hoog-energetische conformaties in eiwitten die in traditionele bulk (biochemische) metingen niet mogelijk zijn. Hoewel tal van papieren werden gepubliceerd om aan te tonen van de beginselen van AFM-de SBF, is het niet eenvoudig om uit te voeren van de SBF experimenten te wijten aan een gebrek aan een uitputtend volledige protocol. In deze studie, we kort illustreren de beginselen van AFM en uitgebreid de protocollen, procedures en data-analyse in detail te beschrijven als een richtsnoer te bereiken goede resultaten van de SBF experimenten. We blijk geven van representatieve SBF resultaten van één eiwit mechanische ontvouwen metingen en wij het oplossen van strategieën voor enkele voorkomende problemen.

Introduction

Voorschotten in één molecuul kracht spectroscopie (SBF) door AFM hebt mechanische manipulatie en precieze karakterisering van één eiwitmolecules ingeschakeld. Deze karakterisering heeft nieuwe inzichten over eiwit mechanica1,2,3, eiwit-ligand interacties4, eiwit-eiwit interacties5, waar de eiwitvouwing geproduceerd en ontworpen op basis van eiwitten materialen6,7,8. De SBF is vooral handig voor de studie van eiwit ontplooiing, zoals die zich uitstrekt door AFM kunnen de chemische en fysische bindingen in het molecuul eiwit geleidelijk uitbreiden volgens hun stijfheid, die aanleiding geven tot een steeds toenemende werklast lengte. Deze overstrekking van een eiwit-molecuul kan produceren een abrupte overgang in de bocht van de kracht-extensie wat resulteert in een breuk-gebeurtenis (of dwingen piek). De piek van kracht geeft directe informatie over de openende kracht en structurele verandering van de eiwitten tijdens het mechanische ontvouwen. Één van de eerste studies met behulp van AFM titin1 gemeten en gevonden nieuwe aspecten van eiwit ontvouwen en uiteinde onder fysiologische omstandigheden zonder gebruik te maken van onnatuurlijke denatureringsmiddelen zoals geconcentreerde chemicaliën of extreme temperaturen.

De SBF experimenten worden uitgevoerd op een scala aan instrumenten, hoewel hier we alleen de AFM overwegen. De AFM bestaat uit vier hoofdelementen: de sonde, de detector, de monsterhouder en de piëzo-elektrische scanner. De sonde is een scherpe tip over het free-swinging einde van een cantilever. Na kalibratie, wordt buigend van de uitkraging tijdens het uitrekken van een bijgevoegde molecuul gemeten met behulp van een laserstraal die blijkt uit de achterkant van de uitkraging precies bepalen met behulp van de wet van Hooke de krachten. De teruggekaatste laser beam projecten in een Kwadrant fotodiode detector die een spanning in verhouding tot de verplaatsing van de laserstraal uit het midden van de diode produceert. Het substraat met de eiwitSteekproef in vloeistof is gemonteerd op een 3D piëzo-elektrische podium die kan worden bestuurd met sub nanometer precisie. Een computer leest de spanning van de detectoren fotodiode en regelt de 3D fase door middel van een computergestuurde voedingsspanning. Deze piëzo actuator fasen zijn meestal uitgerust met capacitieve of spanningsmeter positie sensoren juist maatregel piezo verplaatsing en juiste hysteresis via feedback controlesysteem. De signaaluitgang van de sensor van de piëzo-controller wordt omgezet in afstand met behulp van de constante spanning van de piezo thats fabriek-gekalibreerd. Een voorbeeld kracht-extensie curve van een trekken experiment is afgebeeld in Figuur 2.

Er zijn twee soorten AFM-SBF experimenten: constante snelheid en constante kracht trekken metingen. Constante kracht de SBF metingen worden beschreven in Oberhauser et al. 9, terwijl hier richten we ons op constante snelheid metingen. Een typische AFM constante snelheid trekken experiment wordt gedaan door middel van spanning tot een piezo voorzichtig verplaatsen een substraat ten opzichte van een ' Freischwinger '-tip. Een typisch experiment heeft de tip in eerste instantie tegen het oppervlak te drukken. De trekken meting is begonnen door het bewegen van het substraat vanaf de tip om uit contact. Als een eiwit in contact met de tip in eerste instantie komt, het zal worden getrokken en de zich ontvouwende spoor van geweld tegen verplaatsing zullen worden gemeten. Het substraat wordt dan teruggebracht in contact met het uiteinde en een ontspannende trace wordt gemeten waar de vouwing van eiwitten kan worden bepaald uit de verplaatsing van kracht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. eiwitten voorbereiding

  1. Het klonen van DNA.
    1. Een opeenvolging van DNA van belang, bijvoorbeeld, de opeenvolging van DNA van NI10C10, synthetiseren of isoleren via PCR van het organisme van de host met behulp van standaard moleculaire biologie technieken11. Het gen van belang met beperkingsplaatsen flank tijdens synthese of door het plaatsen van sites in de 5'-eind van de PCR inleidingen overeen moeten komen met een module in de plasmide-pEMI91 (Addgene #74888)12.
    2. Afzonderlijk verteren zowel de plasmide pEMI9112 en de opeenvolging van DNA van belang met een paar beperkingsplaatsen zodat de opeenvolging van belang zal worden geflankeerd door de tandem die i91 herhaalt (Zie Figuur 1). Volg het standaardprotocol voor de beperkingsplaatsen.
    3. Zuiveren het verteerd product met behulp van de Elektroforese van het gel en vervolgens het afbinden van de producten die met behulp van T4 DNA ligase, volgens een standaard protocol. Na afbinding, transformeren de plasmide in E. coli cellen voor reiniging van de plasmide en zuiveren van de plasmide gebruikt standaard protocollen. Volgorde controleren dat de volgorde met succes werd omgevormd met T7 inleidingen of interne pEMI91 inleidingen.
  2. Transformatie.
    1. Eiwit expressie cellen, zoals C41 verwijderen (DE3) pLysS cellen, uit een vriezer-80 ° C en de dooi volledig op ijs.
    2. Voeg 1 µL van plasmide DNA aan de cellen en roer kort; pipetteren omhoog en omlaag is niet aan te raden omdat het voeren van luchtbellen en warm van de cellen.
    3. Incubeer de buis van de cultuur met de cellen en het plasmide op ijs gedurende 30 minuten.
    4. Warmte schok de cellen in een waterbad bij 42 ° C gedurende 45 s.
    5. Retourneren van de buis aan ijs gedurende 2 minuten.
    6. 950 µL van de pond-Bouillon in de cellen plaats en schud bij 250 omwentelingen per minuut gedurende 1 uur bij 37 ° C.
    7. Plaatsen van ongeveer 200 µL van de transformatie op LB platen met 100 µg/mL ampicilline. Als met behulp van een plasmide dan pEMI91, gebruikt u de juiste antibioticum voor dat plasmide. Plaats van de plaat 's nachts in een incubator bij 37 ° C. De volgende dag, verwijderen plaat van incubator, wikkel met parafilm en winkel gekoeld tot 1 maand.
  3. Eiwit expressie.
    1. Inoculeer 15 mL LB Bouillon medium met 100 µg/mL ampicilline in een tube van 50 mL bij 37 ° C's nachts groeimogelijkheden door een tip van de steriele pipet om een enkele bacteriële kolonie op de plaat aan te raken en pipetteren op en neer in de LB.
    2. Breng de cultuur 15 mL in 1 liter LB Bouillon medium met 100 µg/mL ampicilline en schud gedurende 4-12 uur bij 37 ° C (tot600 > 0,8 OD).
    3. 10 mL van de cultuur voor de voorbereiding van de plasmide verzamelen.
    4. Voeg 0.2-1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) en de gemoederen tot kamertemperatuur voor overnachting expressie.
    5. Oogsten van cellen de volgende dag door opsplitsen in vier buizen en centrifugeren bij 4.000 × g gedurende 40 min en dan bevriezen de pellet-80 ° c voor enkele uren.
    6. Stuur de plasmiden geëxtraheerd uit de cellen voor het rangschikken met de inleidingen die overeenkomt met de ingevoegde cassette van de eiwit-12 en controleer of de trouw van de ingevoegde DNA.
  4. Eiwitreiniging.
    1. Ontdooi een buis van bevroren cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Schorten ontdooide cellen in lysis-buffermengsel (38 mL water, 2 mL 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 10 µg/mL DNase, 1 mM PMSF, 1 mM TCEP, 500 µg Mo/mL lysozym van glycerol) en schud op ijs gedurende 1 uur.
    3. Bevriezen van de lysed cellen bij-80 ° C gedurende enkele uren en vervolgens opnieuw ontdooien bij kamertemperatuur.
    4. Draai de lysate neer bij 13,100 × g gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
    5. Het supernatant doorlopen in een gravity stroom kolom voor de specifieke tag (bijvoorbeeld Strep-tag of His-tag).
    6. Het uitvoeren van een uitwisseling van de buffer met behulp van een centrifugaal-filter door middel van de juiste buffer voor Strep-tag of His-tag en bewaren bij 4 ° C vóór gebruik.

2. glijbanen voorbereiding voor de bereiding van de monsters

  1. Glas dia's met behulp van Piranha-oplossing te bereiden.
    1. Plaats 10-30 stuks van ronde glazen cover slips (straal van 7,5 mm) in een bekerglas 40 mL glas.
      Opmerking: Het uitvoeren van deze stap en de volgende stappen uit in een zuurkast. Standaard procedures voor het omgaan met gevaarlijke chemische stoffen tijdens deze stap volgen.
    2. Voeg 30 mL geconcentreerd zwavelzuur van (18.4 M).
    3. Voeg 10 mL van 30% waterstofperoxide.
    4. Verwarm het mengsel gedurende 10-30 minuten tot 95 ° C.
    5. Decanteren zorgvuldig de Piranha-oplossing in een aparte afvalcontainer (te worden hergebruikt of verwijderd).
    6. Spoel de dia's met gedeïoniseerd water te verwijderen van Piranha-oplossing.
    7. Opschorten van de dia's in 40 mL aceton.
    8. Aceton in een afval container decanteren en resuspendeer de dia's in 40 mL ethanol.
    9. Gebruik schone pincet zorgvuldig uitpakken van één dia tegelijk en droog met argon of gezuiverde lucht.
    10. Plaats schoon en gedroogde dia's onder vacuüm tot de gouden verdamping of onder argon voor langdurige opslag.
  2. Bereiden gold gecoate dia's (optioneel).
    Opmerking: Deze stap vereist het gebruik van de verdamper van een vacuüm (e-bundel), die beschikbaar is in vele cleanroom faciliteiten aan grote universiteiten.
    1. Vijf Microscoop dia's (25 x 75 mm rechthoekige vorm) snij doormidden met behulp van een glasscutter.
    2. Dubbelzijdige plakband van toepassing in het midden van elk van de 10 halve Microscoop dia's.
    3. Snijd de plakkerige kant van een kleverige nota en toepassen op de dubbelzijdige tape zodat de plakkerige kant van de notitie gezicht-omhoog is. De notitie is over het algemeen minder lijm, maar nog steeds stevig hecht aan dia's om te voorkomen dat toekomstige breken. Dan kunnen deze halve Microscoop dia's nu werken als houder van de dia's van de glazen.
    4. Druk voorzichtig op vier schoon glas dia's (uit sectie 2.1.10) naar elke hoek van de plakkerige kant van de houder.
    5. De glazen dia's verplaatsen naar een verdamper van e-bundel. Voldoen aan de specificaties van de verdamper te passen 70 nm van chroom en 300 nm van goud aan de oppervlakte.
    6. Bewaar het goud beklede dia's onder argon.

3. de monstervoorbereiding

  1. Dia voor te bereiden.
    1. Selecteer een schone ijzer schijf (15 mm doorsnede) en plak er een zelfklevende tab op.
    2. Unattach het stuk van de dekking van het zelfklevende tabblad.
    3. Selecteer een stuk van schone glas (van sectie 2.1.10) of goud (uit sectie 2.2.7) zal en plaats deze stevig op de plakkerige kant van de schijf van ijzer, dit de voorbeelddia.
  2. Deponeren eiwit op dia.
    1. Dialyze van de polyprotein in de buffer voor het experiment (25 mM Tris-HCl, pH 7,6 met 150 mM NaCl) met behulp van een buffer wisselingskolom zoals een centrifugaal filter van 0,5 mL. Het eiwit in de kolom voor 10 min op 13.000 rpm draaien omkeren van de kolom en elueer de proteïne in een nieuwe buffer door spinnen bij 1000 omwentelingen per minuut gedurende 2 minuten.
    2. De geschatte eiwitconcentratie bepalen door het meten van de absorptie bij 280 nm, met behulp van een spectrofotometer.
    3. Verdun het eiwit tot 10-100 µg/mL in een eindvolume van 100 µL.
    4. Breng de 60 µL van eiwit oplossing in het midden van de dia aan. Wees voorzichtig in dit stadium niet te laten iedere vloeistof onder aangaan de kloof tussen het glas en de ijzeren dia, omdat dit leiden zwelling van de lijm tijdens het experiment en de ongecontroleerde monster bewegingen tot kan.
      Opmerking: Gouden slides zijn hydrofobe en een sferische droplet zal vormen, terwijl glas slides meer hydrofiele zijn en de eiwit-oplossing kan worden verspreid.
    5. Laat het monster gedurende 10-60 minuten bij kamertemperatuur zitten. Gedurende deze tijd, gaat u verder met de volgende stap om te beginnen met het opzetten van de atomaire kracht Microscoop.

4. een atomic Force Microscope (AFM) Setup

Opmerking: Hieronder volgt een algemene beschrijving voor het opzetten van de AFM en enkele specifieke details kunnen verschillen afhankelijk van de specifieke instrumenten gebruikt. De instrumentatie gebruikt is gedeeltelijk huis-gebouwde en in Scholl13in detail beschreven.

  1. Monteer de uitkraging op een AFM-cel.
    1. Kies de uitkraging met de juiste eigenschappen voor de toepassing. Gebruik kraagt met lente-constanten zijn 4-10 pN/nm voor lage ontvouwen krachten (~ 10-50 pN), terwijl gebruik met lente constanten 15-100 pN/nm voor hoge ontvouwen krachten kraagt.
    2. Zorgvuldig de uitkraging vanaf het einde halen en leg deze in de sonde cel te houden.
    3. Zorg ervoor dat de cel bedrijf stevig houdt de uitkraging op zijn plaats voordat u verdergaat.
    4. Plaats de cel van het bedrijf in het hoofd van de AFM voor het uitlijnen van de laser.
  2. Hiermee lijnt u de laser in het hoofd van de AFM.
    1. Plaats van het hoofd op een omgekeerde Microscoop en een battery pack verbinden met het hoofd van de AFM voor het voeden van de laser in het hoofd.
    2. Sluit een camera aan de Microscoop detector zodat het laserlicht kan worden gevisualiseerd op een TV of monitor.
    3. Plaats de laser zodat het is gelegen op het puntje van de uitkraging
  3. Mount hoofd met monster.
    1. Spoel 10 µL van buffer in elk van de poorten van de sonde cel te houden.
    2. Neem de voorbeelddia die heeft al aan het broeden en decanteren 40 µL van vloeistof uit de bebroede oplossing. 40 µL van de buffer aan de dia toevoegen. Plaats de voorbeelddia op de magneet boven de piezo.
    3. Zorg ervoor dat de AFM fase in de verhoogde positie. Zodanig dat de AFM cantilever zich boven de druppel monster, plaats dan het hoofd van de AFM op het podium.
  4. Hiermee centreert u de gereflecteerde laserstraal op de fotodiode.
    1. Knip een klein stukje papier en plaats deze tegenover de AFM fotodiode.
    2. Het verplaatsen van de laser van de AFM met behulp van de knoppen, zodat de laser spot op het papier gericht en helder wordt.
    3. De AFM hoofd spiegel zodanig aanpassen dat de laser raakt de fotodiode om te maximaliseren van het totale signaal in alle kwadranten (A + B + C + D) en zorgt ervoor dat het signaal van het verschil tussen de bovenste twee en twee kwadranten onderste te nul (A + B-C-D).

5. een atomic Force Microscope kalibratie

  1. Meet de macht spectrum.
    1. Op het filter aangesloten op de AFM, schakelt u de instelling van de filter voor de AFM hoofd signaal tot volledige bandbreedte.
    2. Over de AFM zelf, door ervoor te zorgen dat de piezo uitgeschakeld is, aangezien dit lawaai aan het signaal zal toevoegen.
    3. Gebruik de AFM software14 voor het meten van het gemiddelde van 512 berekeningen van de macht spectrum van 1024 gegevenspunten per berekening.
    4. Gebruik de AFM software15 te integreren van de spectrale vermogensdichtheid over de eerste piek, die correspondeert met de hoofdmodus van trillingen voor de uitkraging.
  2. Bereken fotodiode gevoeligheid.
    1. Over de AFM zelf, zet de piëzo-controller en de filter instellen op 500 Hz (low-pass filter).
    2. Het verschil-signaal dat moet worden schommelt rond nul in het AFM-software controleren. Snel omlaag het hoofd van de AFM een paar honderd buitenschroefmaten met behulp van micropositioners. Herhaal het hoofd naar beneden en controleren het verschil signaal voor consistente sprongen. Het oppervlak is zeer nabijgelegen wanneer het signaal springt beginnen steeds meer in de hoogte.
    3. Zodra de doorbuiging signaal verzadigde bij contact met het oppervlak vetzuren, het hoofd uit de buurt van het oppervlak iets verplaatsen.
    4. In de software van de AFM, de input besturingselementen te gebruiken voor het regelen van de piëzo-spanning om te zoeken naar de oppervlakte, door te verplaatsen omhoog of omlaag 100-5000 nm. Als het oppervlak nog steeds niet te bereiken is, verder te verminderen van de afstand tussen het hoofd en het monster handmatig.
    5. In de software van de AFM, doe een trekken experiment met een scan-formaat van ongeveer 500 nm zodat de tip in contact voor ongeveer 100 komt nm van piezo reizen.
    6. Het meten van de helling van de lineaire regio van de fotodiode signaal versus piezo verplaatsing curve waar de AFM tip in contact met het oppervlak van het substraat blijft.
    7. Bereken de lente-constante en de gevoeligheid met behulp van de helling en de geïntegreerde macht spectrum (Equation 1).

6. data-acquisitie

  1. Voorbereiding.
    1. Op de filters aangesloten op de AFM, stelt u de filter instellen zodat de sampling-frequentie is ten minste tweemaal de bandbreedte (Nyquist criterium), die een bovengrens voor de low-pass cutoff krijgt.
  2. Metingen.
    1. De scan instellen met de totale theoretische grootte van de zich ontwikkelende polyprotein (aantal aminozuren × 0.365) plus ongeveer 40% te voorzien in dringende tegen het substraat. Bijvoorbeeld, trekken een 9 x I91-constructie zal een theoretische ongevouwen lengte hebben van ongeveer 300 nm, zodat de grootte van de scan ongeveer 420 moet nm.
    2. De AFM software, plaats de uitkraging zodat er 80% van de scan-formaat uit de buurt van het oppervlak (in dit geval over 340 nm uit de buurt van het oppervlak).
    3. Zet in de software van de AFM, de snelheid van de scan naar 300 nm/s aanvankelijk.
      Opmerking: Deze snelheid kan worden aangepast om langzamer of sneller zijn, afhankelijk van de toepassing.
    4. Een trekken experiment uitvoeren en de resulterende positie van de piëzo en het signaal fotodiode meet. De AFM-software gebruiken voor het initiëren van de scan.
    5. In het AFM-software, blijven metingen uit te voeren totdat er ongeveer 10.000 opnames.
      Opmerking: In het algemeen, de pick-up van een positieve bestuurde molecuul bedraagt rond 0,5%16, dus 10.000 nodig zijn om te kunnen verzamelen van voldoende gegevens te analyseren.

7. de gegevensanalyse

  1. Gegevens normaliseren.
    1. Voor elke opname, berekenen de uitbreiding met extensie verplaatsings - F/kc = (kc is van 5.2.7).
    2. De basislijn kracht niveau bepalen door het nemen van het gemiddelde van ofwel het begin of het einde van het spoor van de kracht-uitbreiding, waar geen kracht pieken aanwezig zijn en waar de uitkraging is niet tegen het oppervlak op te drukken. De curve van de gehele kracht-extensie kan vervolgens worden verschoven door deze gemiddelde waarde.
    3. Vertalen de gegevens zodat de uitbreiding wordt uitgelijnd tussen de nul y-as. Dit is omdat de molecule moet worden ingesteld op nul extensie aan het begin van een trace.
  2. Het identificeren van proteïne van belang.
    1. Opnames met ten minste vier I91 gebeurtenissen waarmee een single-molecuul vingerafdruk te identificeren. Deze opnames vastleggen waar "single-molecuul metingen".
    2. Het opslaan van gebeurtenissen die aangeduid met één-molecuul evenementen voor verdere analyse zijn.
  3. Contour-lengte increment bepalen.
    1. Voor elke opname, past een worm-achtige ketting-model tot ontplooiing gebeurtenis, Equation 2 waar Equation 3 bij kamertemperatuur, p is de lengte van de persistentie (meestal 0.4 tot 1 nm), x is de uitbreiding in nanometer en L is de contour lengte in nanometer.
      Opmerking: Vorm van de worm-achtige keten is een geïnterpoleerde oplossing voor de exacte, een meer exacte numerieke oplossing wordt gevonden in Bouchiat et al. 17. alternatieve montage modellen kunnen worden gevonden in Su et al. 18.
    2. Berekening van het verschil tussen de waarden voor L voor twee opeenvolgende openende gebeurtenissen bepaald, en dit verschil is bedacht de "contour-lengte increment".
  4. Bepalen de kracht van de breuk.
    1. Bereken de kracht van de breuk voor een bepaalde ontvouwen gebeurtenis door middel van het hoogste punt voor de grootste daling in de zich ontvouwende curve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representatieve resultaten van dit protocol zijn afgebeeld in Figuur 2. Beide panelen tonen representatieve kracht-extensie curven van eiwitten. De top ziet u resultaten van een I91-polyprotein, terwijl de onderkant de I91 proteïne flankerende een eiwit toont-of-interest, het NI10C molecuul. Deze opnames tonen de karakteristieke kracht van I91 (200 pN) en lengte increment contour (28 nm) waarin wordt aangegeven dat de uitlijning en de kalibratie van de AFM geslaagd. Deze kracht-extensie krommen kunnen vervolgens worden geanalyseerd door worm-achtige kettingen (gestippelde lijn) die helpen om te bepalen van de lengte van de kracht onafhankelijk van de molecule en bepalen het aantal ongevouwen residuen. Nadat geanalyseerd, de contour-lengte stappen (verschil tussen de latere contour-lengtes) en de zich ontvouwende kracht kan worden gebruikt om te bepalen van de eiwitstabiliteit, ontvouwen tarief en ontvouwen traject19.

Figure 1
Figuur 1: plasmide kaart van polyprotein. Dankzij deze polyprotein plasmide kaart volgorde en fysieke DNA is beschikbaar door de bewaarplaats van de Addgene (www.addgene.org/74888). Het toont de prototypische polyprotein ontwerp voor AFM, waar een polyprotein bestaat uit 8 identieke herhalingen van I91 eiwit ("grijze dozen") die de flank van een proteïne van belang (rood). Elke module bevat een unieke beperkingsplaats waarmee aanpassing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: vertegenwoordiger SMFS resultaten. A. representatieve kracht-extensie curve voor poly I91 eiwit. Bedoel contour lengte increment tussen pieken is ~ 28 nm, en het ontvouwen van krachten zijn tussen de 100-200 pN. B. de curve van de representatieve kracht-extensie voor (I91)3-NI10C-(I91)3 eiwitten. Toename van de gemiddelde omtrek lengte voor ankyrin herhalen is ~10.5 nm, en ontvouwen krachten zijn tussen 8-25 pN. Het patroon van de regelmatige saw-tooth voor herhalingen van de ankyrin wordt gevolgd door I91 ontvouwen pieken. De trekken snelheid voor zowel sub a en B zijn 0,02 nm/ms. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een cruciale stap in het protocol is het gebruik van een polyprotein, beschreven in stap 1.1.2, die als een positieve controle fungeert aan de "vingerafdruk" single-molecuul gebeurtenissen. In het algemeen, er moet worden ontvouwen evenementen van de polyprotein eiwitten (voor I91, betekent dit een ontvouwen troepenmacht van ongeveer 200 pN en contour toename met lengte van ongeveer 28 nm) tot ondubbelzinnige conclusie is gekomen dat de proteïne van belang uitgevouwen is. Bijvoorbeeld, wanneer de proteïne van belang wordt geflankeerd door drie I91 domeinen aan beide zijden, moeten dan er ten minste vier I91 evenementen om te concluderen dat het positief een single-molecuul evenement. Als er niet een positieve controle door middel van een polyprotein, of op andere wijze dan alle gegevens aansprakelijk voor verkeerde interpretaties is.

De klonen strategie voor het plasmide is afhankelijk van het gen en de plasmide van belang. Wij hebben ter beschikking gesteld een polyprotein plasmide die kan worden gebruikt in combinatie met dit protocol12. Plasmiden zijn beschikbaar voor deze stap die bevatten unieke beperkingsplaatsen voor eenvoudige klonen van20,21. Deze plasmiden alleen verlangen een unieke set van beperkingsplaatsen gemakkelijk klonen in de proteïne van belang in het plasmide. Er zijn ook methoden beschikbaar voor het maken van deze plasmide van kras met behulp van Gibson vergadering22 die het voordeel heeft dat het gemakkelijk het schilferen eiwitten wijzigen tijdens het invoegen van de proteïne van belang. Er zijn ook plasmiden met modulaire polyproteins met codon geschud domeinen die een eenvoudige manier om efficiënt de volgorde de gehele proteïne van belang bieden, hulp bij het waarborgen van de trouw-21.

De keuze van goud of glas hangt af van of het eiwit specifieke bijlage beschikbaar heeft. Gouden substraten voorzien in vormen van Au-Cys bindingen tussen de polyprotein en het oppervlak. Als een Cys wordt toegevoegd aan het einde van de polyprotein, kan dan dit dienen als een manier om specifiek het eiwit hechten aan het oppervlak. Glazen substraten kunnen worden gebruikt door zelf, die nuttig zijn voor sommige eiwitten die doen niet adsorberen goed naar goud en zijn ook eenvoudiger te genereren. Glas dia's kunnen ook worden gebruikt als een voorloper van met behulp van specifieke bevestiging met speciaal gemaakte polyproteins23. Mica substraten kunnen ook worden gebruikt, die nuttig kunnen zijn voor sommige eiwitten hebben specifieke heffingen sites die aan de negatief geladen oppervlak binden kunnen.

AFM spectroscopie op eiwitten heeft verschillende belangrijke beperkingen. Bereiding van de monsters kan mislukken als het eiwit kan geen verbinding aan de randen in een polyprotein. Eiwitten die te klein is voor het produceren van meetbare contour-lengte stappen of te zwak om te weerstaan aan kracht zal ook niet kunnen worden opgelost door de AFM. Typische resolutie in AFM experimenten kunt alleen oplossen van krachten zo laag als 10-15 pN als gevolg van de typische RMS lawaai in AFM uitkragingen, hoewel recente vooruitgang hebben geboekt beschikbaar betere resoluties met geavanceerde instrumentatie24. De snelheid voor constante snelheid experimenten is ook beperkt tot ongeveer 4 nm/s25, en de beste resolutie bereikt meestal korter dan 10 µs24Staten kan detecteren. Als eiwitten minder mechanisch stabiel, ze zijn beter gekenmerkt met optisch pincet heeft een lagere bereik van kracht en meestal een hogere temporele resolutie. Er zijn nog verbeteringen in de toekomst beschikbaar aan AFM, zoals combineren met FRET26, AFM imaging om vast eiwit posities27 en toenemende resolutie met speciaal ontworpen uitkragingen28te gebruiken.

De AFM techniek is aanzienlijk ten opzichte van bestaande methoden, omdat het toestaat dat uitpakken van kinetische parameters, zoals ontvouwen tarief en overgang staat afstand op een niveau van één molecuul29. Terwijl andere traditionele biochemische methoden (NMR, chemische denaturatie, gestopt-flow fluorescentie) ook informatie over kinetische parameters krijgen kunnen, zijn de resultaten van deze methoden functies van een eiwit-ensemble en niet een enkel molecuul. Dit maakt een belangrijk verschil in gevallen waar er verschillende en verschillende ensembles van een één eiwit. AFM heeft aangetoond te kunnen onderscheiden van de subpopulaties, in plaats van gemiddeld hen samen30.

De gedetailleerde uitleg van het experiment de SBF op eiwitmolecules hierboven nog steeds doet niet vooruitlopen op mogelijke problemen die kunnen worden opgelost met ervaring. In de volgende bespreken we gemeenschappelijke problemen en probleemoplossing die betrekking hebben op het opereren van een AFM voor constante snelheid experimenten.

Kracht Sinusoidal-vormige basislijn. De sinusoïdale vorm is schadelijk voor het bepalen van de juiste kracht piekwaarde omdat het moeilijk voor de berekening van de basislijn. Het probleem wordt veroorzaakt door interferentie van de laser weerkaatst door de uitkraging. Om dit probleem te verlichten, kan de positie van de laser punt op de uitkraging worden enigszins verschoven, zolang de nieuwe positie een goede som signaal van de fotodiode behoudt. Als het probleem nog steeds aanhoudt, kunt u overwegen herpositionering van de uitkraging in de sonde cel te houden.

Fotodiode signaal doet niet verzadigen in één stap bij het aanraken van de oppervlakte de eerste keer. Bij het aanraken van het oppervlak, springt het signaal fotodiode in verschillende stappen totdat de verzadigde waarde wordt bereikt. Dit betekent dat de tip niet het laagste punt in het AFM-hoofd en een andere plaats op de chip van de sonde het monster oppervlak voorafgaand aan het uiteinde van de uitkraging mogen aanraken. Dit probleem moet worden vastgesteld om te blijven van de SBF metingen en juiste kracht-extensie curve. U kunt het probleem oplossen, probeer de positie van de uitkraging in de sonde die cel heen en weer bewegen en aanpassen van de dichtheid van de haak die de uitkraging in plaats grijpt. Als dit niet helpt, probeer over te schakelen naar een andere cantilever op dezelfde chip of zelfs omzetten in een nieuwe ' Freischwinger '-chip.

Vele evenementen op retractie, of geen gebeurtenissen helemaal. Dit is gerelateerd aan het vinden van de juiste eiwitconcentratie voor het experiment. Als er altijd één grote kracht piek (> 500 pN) verschijnen op de uitrekkende trace en geen andere pieken worden weergegeven terwijl het uitvoeren van experimenten op gold gecoate oppervlak, de uitkraging is eigenlijk het meten van goud-goud interactie sinds de monster-moleculen op het oppervlak zijn ook schaars. In dit geval moet de concentratie van het eiwit monster gestort op het gouden oppervlak worden verhoogd. Echter als er meerdere onregelmatig gevormde toppen die voorkomen op alle uitrekkende sporen van elke trekken cyclus, het geeft aan dat er teveel moleculen naar de oppervlakte die een laag of een ingewikkeld netwerk gevormd op het oppervlak wordt geabsorbeerd. In dit geval moet het monster worden gewassen door de buffer die wordt gebruikt voor het verwijderen van overtollige eiwitmolecules. Soms de voorbereiding van een nieuw monster met lagere concentratie eiwit is nodig om zich te ontdoen van dit probleem. Als de nieuwe monster ook het probleem niet oplossen, controleert u de berijpte ringvormige groef op de AFM cel te houden om te zien als een vloeistof erin doorgedrongen. De groef moet droog tijdens het experiment omdat iedere vloeistof in de groef zou koppel de trillingen van het monster in de cel van het bedrijf en ervoor zorgen dat het signaal fotodiode abnormaal wijzigen wanneer de uitkraging en het oppervlak in aanraking bent.

Valse modulatie van fotodiode signaal, tussen de afritten. Dit is een indicatie van flow die de uitkraging heen en weer, die wordt meestal veroorzaakt door een kleine luchtbel die is bij het transitovervoer door de vloeistof kanalen kan duwen. Dit soort problemen zal verstoren metingen met enorme signaal stijgingen of dalingen. Om dit probleem oplossen, hef het hoofd van het substraat, zodat de vloeistof rond de uitkraging niet langer de vloeistof rond het substraat raakt. Dan breng ze terug samen, en beweeg het hoofd terug naar de oppervlakte. De Reformatie van de vloeistof kolom in de cel van de AFM is meestal genoeg om het verstoren van de zeepbel van de vloeistof kanalen, maar als niet, herhalende noodzakelijk is.

Systematische verhoging of verlaging van fotodiode signaal. Drijven is een fenomeen dat is aanwezig in elk experiment, waar de uitkragingen en de tip zal altijd drift zeer snel na het aanraken van de vloeibare druppel op het oppervlak van de steekproef. Drift kan worden veroorzaakt door temperatuur evenwichtsinstelling, waarin de temperatuur-geïnduceerde uitzetting of inkrimping van de uitkraging zorgt ervoor dat trillingen in het signaal. Meer dan 10 min wachten voordat het eerste experiment uitvoeren zal leiden tot aanzienlijke afname drifting snelheid. Bij het uitvoeren van experimenten trekken, als de uitrekkende en ontspannen trace niet met elkaar, overeenkomen dan is er een hysteresis tussen de twee helften van de trekken cyclus, die correspondeert met een snel drifting tempo en vereist extra tijd te bereiken evenwicht. Als de kracht basislijn naar boven met een kleine hoek kantelt, de drifting snelheid is sneller dan de snelheid van het trekken zelf en het is beter om het opschorten van het experiment te wachten op minder trillingen van de tip.

Kracht-extensie kromme eerste regio is niet verticale. Het is nuttig om te kijken naar de kracht-extensie plot van opnamen nadat zij zijn verkregen uit een nieuw gekalibreerde setup. Deze opnames worden een verticale regio niet weergegeven wanneer de uitkraging tegen het oppervlak drukt, dan de kalibratie een probleem kan zijn als het moet worden herhaald vanaf stap 5.

Fotodiode signaal verdwijnt na enige tijd. Dit kan worden veroorzaakt door de verdamping van de buffer in de vloeistof cel. Het is belangrijk om te hydrateren de cel door toepassing van meer buffer elk uur of zo, zodat het monster van uitdrogen en maken het onbruikbaar voor verdere experimenten.

Intrinsieke lawaai is hoog (> 30 pN). Een grote hoeveelheid ruis (gemeten als de RMS van de schommelingen van de gekalibreerde fotodiode) is kenmerkend voor extern geluid. AFM experimenten moeten gebeuren op een tabel van de lucht te verminderen het bedrag van de koppeling naar het gebouw, maar extern geluid kan ook worden veroorzaakt door de onzekere fase, auditieve lawaai in de buurt, of doorkoppeling van de tabel van de lucht aan nabijgelegen statische objecten (bijvoorbeeld een stoel). Het lawaai kan ook afkomstig zijn van de elektronische controlerende systeem van de AFM (bijvoorbeeld onstabiele verbinding in het elektronische systeem).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de National Science Foundation subsidies MCB-1244297 en MCB-1517245 naar PEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM Specimen Discs, 15mm diameter Ted Pella, Inc. 16218 Serve as base for glass substrate
Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick Ted Pella, Inc. 26024 serve as glass substrate and base for gold coating
Adhesive Tabs Ted Pella, Inc. 16079 Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips
STD Multimode head assembly Bruker Nano Inc. 1B75C AFM head
Glass probe holder Bruker Nano Inc. MTFML-V2 Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  
Microlever AFM probes Bruker Nano Inc. MLCT Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes
AFM probes with Au coated tips Bruker Nano Inc. OBL-10 Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force
Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs National Instruments PCI-6259 Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators
LISA Linear Piezo Stage Actuators Physik Instrumente LP P-753.11C Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements
XY Piezo Stage Physik Instrumente LP P-541.2CD Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. The study of protein mechanics with the atomic force microscope. Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).
  3. Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM). Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).
  4. Rico, F., Chu, C., Moy, V. T. Methods in Molecular Biology. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. 331-353 (2011).
  5. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).
  6. Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
  7. Kim, M., et al. Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials. Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).
  8. Gonzalez, M. A., et al. Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins. Advanced Materials. , (2017).
  9. Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).
  10. Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes. Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).
  11. Davis, L. Basic methods in molecular biology. , Elsevier. (2012).
  12. Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. , (2016).
  13. Scholl, Z. N. The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , Duke University. (2016).
  14. Pawlak, K., Strzelecki, J. Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments. Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).
  15. Nanopuller. , https://sourceforge.net/projects/nanopuller/ (2018).
  16. Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions. Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).
  17. Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).
  18. Su, T., Purohit, P. K. Mechanics of forced unfolding of proteins. Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).
  19. Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy. Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).
  20. Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).
  21. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of β-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).
  22. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
  23. Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level. Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).
  24. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  25. Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations. Science. 342 (6159), 741-743 (2013).
  26. He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy. ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).
  27. Fotiadis, D., Scheuring, S., Müller, S. A., Engel, A., Müller, D. J. Imaging and manipulation of biological structures with the AFM. Micron. 33 (4), 385-397 (2002).
  28. Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
  29. Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins. Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).
  30. Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a βγ-Crystallin Protein. Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).

Tags

Biochemie kwestie 144 Atomic force microscope polyprotein eiwit vouwen single-molecuul kracht spectroscopie EiwitReiniging
Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E.,… More

Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. J. Vis. Exp. (144), e55989, doi:10.3791/55989 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter