Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Published: February 28, 2019 doi: 10.3791/55989
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University

Summary

אנו מתארים את הליכים מפורטים על מנת למדוד את תכונות מכניות מסלולים מכני התגלגלות של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. אנו גם מראים תוצאות נציג כנקודת התייחסות הבחירה ואת ההצדקה של הקלטות מולקולת חלבון אחד טוב.

Abstract

הקביעה של תהליך קיפול חלבונים מרצף חומצות אמיניות שלהם למבנה תלת-ממד מקורי שלהם היא בעיה חשוב בביולוגיה. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ניתן לפתור בעיה זו על-ידי הפעלת מתיחה והרפיה של מולקולות חלבון יחיד, אשר נותן עדות ישירה של התגלגלות, refolding מאפיינים ספציפיים. מבוסס AFM מולקולה בודדת כוח-ספקטרוסקופיה (AFM-SMFS) מספק אמצעים למדוד באופן עקבי הייצורים החיים אנרגיה גבוהה בחלבונים אשר אינן אפשריות במדידות (ביוכימית) בצובר מסורתי. למרות מספר רב של מאמרים פורסמו כדי להציג את העקרונות של AFM-SMFS, זה לא קל לערוך ניסויים SMFS בשל העדר פרוטוקול ומגובה מלאה. במחקר זה, אנו להמחיש בקצרה את העקרונות של AFM, פירוט בהרחבה את הפרוטוקולים, נהלים, ניתוח נתונים כקו מנחה כדי להשיג תוצאות טובות מן הניסויים SMFS. נדגים נציג SMFS תוצאות מדידות התגלגלות מכני חלבון יחיד, אנו מספקים פתרון בעיות אסטרטגיות עבור כמה נפוץ נתקל בבעיות.

Introduction

ההתקדמות ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת (SMFS) על ידי AFM אפשרו במחרוזות מכני, אפיון מדויק של מולקולות חלבון יחיד. אפיון זה הפיק הרומן תובנות על חלבון מכניקה1,2, קיפול3, אינטראקציות חלבון-ליגנד4, אינטראקציות חלבון-חלבון5, החלבון ומתוכננים מבוססי חלבונים חומרים6,7,8. SMFS שימושית במיוחד עבור לימוד חלבון התגלגלות, כמו מתיחה על ידי AFM מאפשרת את הקשר הכימי והפיזי בתוך מולקולת חלבון להרחיב בהדרגה על פי שלהם נוקשות, אשר נותן לעלות באורך מתאר גדל ללא הרף. זו מתיחת של מולקולה חלבון יכול לייצר מעבר פתאומי בתוך עקומת כוח-סיומת וכתוצאה אירוע קרע (או לאלץ את שיא). הפסגה כוח נותן מידע ישיר על השינוי כוח מבניים התגלגלות של החלבון במהלך התגלגלות תהליך מכני. אחד המחקרים הראשונים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי נמדד titin1 ומצאו היבטים חדשניים של חלבון התגלגלות, refolding בתנאים פיזיולוגיים ללא שימוש denaturants לא טבעיים כמו כימיקלים מרוכזים או טמפרטורות קיצוניות.

SMFS הניסויים נערכים על מגוון מכשירים, אך כאן אנו רואים רק AFM. AFM מורכב ארבעה מרכיבים עיקריים: החללית, הגלאי, המחזיק לדוגמה, הסורק פיזואלקטריים. המכשיר הוא קצה חד על קצה זיז שמתנדנדת חופשי. לאחר כיול, כיפוף הזיז בזמן מתיחות של מולקולה המצורפת נמדד באמצעות קרן לייזר זה משתקף מעל גבי הזיז במדויק לקבוע כוחות באמצעות חוק הוק. הפרויקטים קרן לייזר משתקף לתוך גלאי פוטודיודה רביע אשר מייצר מתח בפרופורציה העקירה של קרן הלייזר מהמרכז דיודה. המצע עם הדגימה החלבון בנוזל נטענה על שלב פיזואלקטריים 3D יכול להיות נשלט עם דיוק תת ננומטר. מחשב קורא את המתח מתוך גלאי פוטודיודה ופקדים השלב 3D דרך ספק מתח מבוקר-מחשב. אלה שלבים למפעיל piezo מצוידים בדרך כלל עם קיבולי או זן-מד חיישני מיקום בדיוק המידה piezo הזחה וכדי היסטרזיס הנכון באמצעות מערכת בקרת הזנה-בחזרה. הפלט אות חיישן של הבקר piezo מומר מרחק באמצעות מתח קבוע piezo זה לבצע כיול במפעל. מעגל הרחבת כוח דוגמה של ניסוי מושך מוצג באיור2.

ישנם שני סוגים של AFM-SMFS ניסויים: מהירות קבועה וכוח קבוע משיכת מדידות. מדידות SMFS כוח קבוע מתוארים Oberhauser. et al. 9, ואילו כאן נתמקד מדידות מהירות קבועה. טיפוסי AFM מהירות קבועה מושך ניסוי נעשית על-ידי אספקת מתח piezo להעביר בעדינות מצע ביחס טיפ זיז. ניסוי טיפוסי כולל הטיפ בהתחלה לוחצת כנגד פני השטח. המדידה מושך הוא התחיל על ידי הזזת את המצע מן העצה להביא איתו קשר. אם חלבון בא במגע עם הטיפ בתחילה, זה ששולפים, נמדד המעקב התגלגלות בכוח נגד העקירה. המצע ואז מובאת בחזרה במגע עם הטיפ, עקבות מרגיעה נמדד איפה קיפול חלבונים יכול להיקבע מתוך העקירה כוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. חלבון הכנה

  1. שכפול ה-DNA.
    1. לסנתז רצף ה-DNA של עניין, לדוגמה, רצף ה-DNA של10ג ני10, או לבודד באמצעות PCR של האורגניזם המארח באמצעות שיטות בביולוגיה מולקולרית סטנדרטי11. לאגף את הגן עניין באתרים מגבלת במהלך סינתזה או על-ידי הצבת אתרים בסוף 5'-תחל PCR כדי שיתאימו: מודול pEMI91 פלסמיד (Addgene #74888)12.
    2. בנפרד לעכל את פלסמיד pEMI9112 והן את רצף ה-DNA של עניין עם זוג באתרים מגבלת כך הרצף של עניין יותקף על ידי טנדם ש-i91 חוזר (ראה איור 1). בצע את הפרוטוקול הסטנדרטי עבור האתרים ההגבלה.
    3. לטהר את המוצר מתעכל שימוש בג'ל, ואז מאתרים ומפסיקים את המוצרים באמצעות T4 DNA ליגאז, בעקבות פרוטוקול תקני. לאחר מצדו, להפוך את פלסמיד לתאים e. coli לטיהור פלסמיד, ולטהר את פלסמיד באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. רצף באמצעות תחל T7 או תחל פנימי pEMI91 כדי לוודא כי הרצף הפך בהצלחה.
  2. טרנספורמציה.
    1. להסיר תאים ביטוי חלבון, כמו C41 תאים pLysS (DE3), מקפיא-80 ° C, להפשיר לחלוטין על קרח.
    2. להוסיף 1 µL של פלסמיד ה-DNA בתאי ומערבבים בקצרה; pipetting למעלה ולמטה אינה מומלצת, גם היא להציג את בועות האוויר, לחמם את התאים.
    3. דגירה הצינור התרבות התאים המכיל את פלסמיד על קרח למשך 30 דקות.
    4. חום לזעזע את התאים באמבט מים בטמפרטורה 42 ° C עבור 45 s.
    5. להחזיר את הצינור קרח למשך 2 דקות.
    6. מקום µL 950 ק ג מרק בתאים וללחוץ על 250 סל"ד עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.
    7. במקום כ- 200 µL של הטרנספורמציה על גבי לוחות LB המכיל 100 µg/mL אמפיצילין. אם באמצעות פלסמיד חוץ pEMI91, השתמש האנטיביוטיקה המתאימה עבור פלסמיד הזה. מניחים צלחת בן לילה באינקובטור ב 37 º C. למחרת, הצלחת להסיר חממה, עוטפים עם מצלמות-מיקרוסקופים, חנות בקירור עד חודש.
  3. ביטוי חלבון.
    1. לחסן 15 מ"ל של מדיום מרק ליברות עם אמפיצילין µg/mL 100 צינור 50 מ ל- 37 מעלות צלזיוס לצמיחה לילה על ידי נגיעה טיפ פיפטה סטרילי למושבת חיידקים בודד בצלחת pipetting למעלה ולמטה בגדה.
    2. להעביר את התרבות 15 מ"ל L 1 LB בינוני מרק עם אמפיצילין µg/mL 100 וללחוץ על 4-12 h ב 37 מעלות צלזיוס (עד כמנת600 > 0.8).
    3. לאסוף 10 מ"ל של התרבות להכנה פלסמיד.
    4. להוסיף 1-0.2 מ מ איזופרופיל-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), להנמיך את הטמפרטורה לטמפרטורת החדר לביטוי בין לילה.
    5. לקצור את התאים למחרת על ידי מתחלקים לקבוצות של 4 שפופרות צריך שתוציאו ב × 4,000 g למשך 40 דקות ולאחר מכן להקפיא בגדר ב-80 מעלות צלזיוס למשך מספר שעות.
    6. שלח את פלסמידים שחולצו מן התאים עבור רצף עם תחל התואם הקלטת שנוספו חלבון12 , ולאמת את אמינות של ה-DNA שנוספו.
  4. חלבון-טיהור.
    1. הפשרת שפופרת אחת של תאים קפוא במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. להשעות את התאים המופשרים במאגר פירוק (38 מ"ל של מים, 2 מ של גליצרול, 50 מ מ טריס-HCl pH 7.6, 150 מ מ NaCl, 1 מ"מ CaCl2, 10 µg/mL DNase, 1 מ PMSF, 1 מ TCEP, 500 ליזוזים µg/mL) וללחוץ על קרח לשעה.
    3. להקפיא את התאים lysed ב-80 מעלות צלזיוס למשך מספר שעות, לאחר מכן מחדש להפשיר בטמפרטורת החדר.
    4. לסובב את lysate למטה ב × 13,100 g למשך 30 דקות ב 4 º C.
    5. להפעיל את תגובת שיקוע דרך העמודה זרימת הכבידה לתג מסוים (כגון: דלקת-תג או תג שלו).
    6. לבצע החלפת המאגר באמצעות צנטריפוגלי מסנן באמצעות המאגר המתאים עבור דלקת-תג או שלו-tag ושל חנות ב 4 ° C לפני השימוש.

2. שקופיות לקראת הכנת הדוגמא

  1. להכין שקופיות זכוכית באמצעות פתרון Piranha.
    1. מקום 10-30 חתיכות עגול מזכוכית שער גולשת (רדיוס של 7.5 מ"מ) לתוך גביע זכוכית 40 מ.
      הערה: לבצע שלב זה והשלבים הבאים בשכונה. בצע את נהלי להתמודדות עם כימיקלים מסוכנים במהלך שלב זה.
    2. להוסיף 30 מ ל חומצה גופרתית מרוכזת (18.4 ז).
    3. להוסיף 10 מ של 30% מימן על-חמצני.
    4. מחממים את התערובת למשך 10-30 דקות עד 95 מעלות צלזיוס.
    5. בזהירות decant הפתרון פיראניה לתוך מיכל פסולת נפרד (ל ניתן לעשות שימוש חוזר או שנמחקו).
    6. יש לשטוף את השקופיות עם מים יונים כדי להסיר פיראניה פתרון.
    7. להשעות את השקופיות ב- 40 מ של אצטון.
    8. Decant אצטון לתוך מיכל פסולת, מחדש להשעות שקופיות ב- 40 מ"ל אתנול.
    9. להשתמש מלקחיים נקי כדי לחלץ שקופית אחת בכל פעם ובזהירות יבש עם ארגון או אוויר מטוהר.
    10. המקום נקי, יבש שקופיות תחת ואקום עד אידוי זהב, או תחת ארגון לאחסון לטווח ארוך.
  2. להכין שקופיות מצופה זהב (אופציונלי).
    הערה: שלב זה מחייב שימוש מפזר אבק (e-קרן), אשר זמינה במתקני חדר נקי רבים באוניברסיטאות הגדולות.
    1. לחצי חמש שקופיות מיקרוסקופ (צורה מלבנית 25 מ"מ x 75 מ"מ) באמצעות של glasscutter.
    2. החלת דבק דו צדדי, באמצע של כל אחד 10 שקופיות מיקרוסקופ חצי.
    3. לחתוך את הצד הדביק של פתק נדבק ולהחיל בקלטת דו צדדית כך הצד הדביק של הפתק, פנים כלפי מעלה. הפתק הנדבק דבק בדרך כלל פחות, אבל עדיין בחוזקה מייחסת שקופיות כדי למנוע פריצה בעתיד. אז אלה שקופיות מיקרוסקופ חצי יכול לעבוד עכשיו כמחזיק שקופיות זכוכית.
    4. בזהירות הקש ארבע שקופיות זכוכית נקי (מתוך סעיף 2.1.10) בכל פינה של הצד הדביק של בעל.
    5. להעביר את השקופיות זכוכית המאייד e-קרן. בצע את המפרטים של המאייד כדי להחיל 70 nm של כרום ו- 300 ננומטר זהב אל פני השטח.
    6. אחסן את השקופיות מצופה זהב תחת ארגון.

3. הכנת הדוגמא

  1. להכין שקופיות.
    1. בחר בדיסק ברזל נקי (15 מ מ קוטר) ולאחר לצרף הוא טאב דבק.
    2. ביטול צירוף היצירה הכיסוי של הכרטיסיה דבק.
    3. בחר פיסת זכוכית נקי (מתוך סעיף 2.1.10) או זהב (מתוך בסעיף 2.2.7) בחוזקה למקם אותו על הצד הדביק של הדיסק ברזל, זה יהיה השקופית הדגימה.
  2. להפקיד מחלבון שקופיות.
    1. Dialyze את polyprotein לתוך המאגר עבור הניסוי (25 מ מ טריס-HCl, pH 7.6 עם 150 מ מ NaCl) באמצעות מאגר exchange עמודה כגון מסנן צנטריפוגלי 0.5-mL. ספין החלבון של העמודה עבור 10 דקות-13,000 סל ד ואז להפוך את העמודה, elute החלבון לתוך מאגר חדש מאת ספינינג-1000 סל"ד למשך 2 דקות.
    2. לקבוע ריכוז חלבון המשוער על ידי מדידת את ספיגת ב 280 ננומטר, שימוש ספקטרופוטומטרים.
    3. לדלל את החלבון ל 10-100 µg/mL באמצעי אחסון הסופי של 100 µL.
    4. להחיל את µL 60 של חלבון פתרון במרכז השקופית. להיזהר בשלב זה לא לתת כל נוזל נכנסים מתחת הפער בין הזכוכית השקופית ברזל, כמו זה יכול לגרום לנפיחות של הדבק במהלך הניסוי ואת תנועות מדגם. לא מבוקרת.
      הערה: שקופיות זהב הן הידרופוביות, טיפונת כדורית יהוו, ואילו זכוכית המגלשות הידרופילית יותר הפתרון חלבון עלול להתפשט.
    5. תן את הדגימה לשבת בטמפרטורת החדר למשך 10-60 דקות. במהלך תקופה זו, המשך לשלב הבא כדי להתחיל בהגדרת מיקרוסקופ כוח אטומי.

4. הגדרת מיקרוסקופ (AFM) כוח אטומי

הערה: להלן תיאור כללי להגדרת AFM, כמה פרטים ספציפיים עשויות להשתנות בהתאם במכשור ספציפי בשימוש. המכשור המשמש היא חלקית בבית שנבנה המתוארת בפירוט שול13.

  1. הר שלוחה לתוך תא AFM.
    1. בחר שלוחה עם המאפיינים המתאימים עבור היישום. שימוש cantilevers עם האביב קבועים 4-10 pN/nm לכוחות התגלגלות נמוך (~ 10-50 pN), בזמן שימוש cantilevers עם האביב קבועים 15-100 pN/nm לכוחות התגלגלות גבוהה.
    2. בזהירות לאסוף הזיז מהקצה ולמקם אותו לתוך החללית בתא מעצר.
    3. ודא שבתא המעצר מחזיקה בחוזקה הזיז במקום לפני שתמשיך.
    4. מקום בתא המעצר לראש AFM ליישור הלייזר.
  2. יישר את הלייזר בראש AFM.
    1. שים את ראשך על גבי מיקרוסקופ הפוכה וחבר חבילת סוללות בראש AFM להפעלת הלייזר בראש.
    2. צרף מצלמה הגלאי מיקרוסקופ כך אור הלייזר, ניתן לאבחן על גבי מסך הטלוויזיה או מסך.
    3. מקם את הלייזר כך הוא ממוקם על הקצה של שלוחה
  3. הר הראש עם הדוגמה.
    1. פלאש µL 10 מאגר לתוך כל אחד הנמלים של המכשיר בתא מעצר.
    2. קח את השקופית מדגם אשר יש כבר המקננת, decant µL 40 של נוזל מן הפתרון incubated. להוסיף 40 µL של המאגר בשקופית. המקום השקופית מדגם על המגנט מעל אלמנט פייזו.
    3. ודא כי השלב AFM נמצא במצב מוגבה. ואז המקום בראש AFM לבמה כך הזיז AFM הינה מעל מדגם ה-droplet.
  4. מרכז קרן הלייזר משתקף על גבי פוטודיודה.
    1. חותכים פיסת נייר קטנה, הניחו פוטודיודה AFM.
    2. מיקום מחדש של הלייזר AFM שימוש בידית כך נקודת לייזר על הנייר הופך להיות ממוקד ובהיר.
    3. להתאים את המראה ראש של מיקרוסקופ כוח אטומי כך הלייזר מכה את פוטודיודה כדי למקסם את האות הכולל בכל התדרים (A + B + C + D), גורמת האות ההבדל בין שני העליונים והתחתונים הגזרות שני יהיה אפס (A + B-C-D).

5. כיול מיקרוסקופ כוח אטומי

  1. למדוד את ספקטרום ההספק.
    1. על המסנן מחובר AFM, להפוך את הגדרת מסנן עבור האות AFM ראש מלא פס רחב.
    2. ב AFM עצמו, ודא כי אלמנט פייזו כבויה כמו זה הרעש יוסיף האות.
    3. להשתמש את תוכנה של AFM14 כדי למדוד את הממוצע של 512 חישובים של הספקטרום כוח של נקודות נתונים 1,024 לפי חישוב.
    4. להשתמש ה AFM תוכנה15 כדי לשלב את צפיפות ספקטרלי של כוח מעבר השיא הראשון, המתאים מצב ראשי של רטט על הזיז.
  2. לחשב פוטודיודה רגישות.
    1. ב AFM עצמה, להפעיל את הבקר piezo ושנה את הגדרת מסנן עד 500 הרץ (מסנן נמוך לעבור).
    2. נטר את האות ההבדל אשר צריכים להיות יציבים סביב אפס בתוכנה AFM. במהירות להזיז את הראש AFM למטה כמה מאות מיקרומטר באמצעות micropositioners. חזור על הזזת הראש ונטר את האות ההבדל למעברים עקבית. השטח הוא מאוד קרוב כאשר האות קופץ להתחיל הגדלת גובה.
    3. ברגע האות סטיה הרוויות על קשר עם פני המים, להזיז את הראש מהמשטח מעט.
    4. בתוכנה AFM, השתמש בפקדי קלט כדי לווסת את המתח piezo למצוא את פני השטח, על-ידי הזזת למעלה או למטה-5,000 100 ננומטר. אם פני השטח הוא עדיין לא להגיע, להמשיך להקטין את המרחק בין הראש לבין המדגם באופן ידני.
    5. בתוכנה AFM, לערוך ניסוי מושך עם גודל סריקה של בערך 500 ננומטר כך הטיפ בא במגע כ-100 nm של אלמנט פייזו נסיעות.
    6. למדוד את השיפוע של האזור הליניארי של האות פוטודיודה לעומת עקומת הזחה piezo איפה קצה AFM נותר במגע עם המשטח המצע.
    7. לחשב את קבוע הקפיץ ורגישות באמצעות השיפוע וחיתוך הספקטרום הכוח המשולב (Equation 1).

6. חדרי קירור והקפאה

  1. הכנה.
    1. על מסנני מחובר AFM, קבע את הגדרת מסנן כך בתדירות הדגימה היא לפחות פעמיים רוחב הפס (קריטריון נייקוויסט), אשר ייתן חסם עליון על החיתוך נמוך לעבור.
  2. מדידות.
    1. להגדיר את גודל הסריקה לגודל תיאורטי הכולל של התגלגלות polyprotein (מספר חומצות אמינו × 0.365) בתוספת כ 40% כדי לאפשר לחיצה נגד המצע. לדוגמה, משיכת בונה x I91 9 יהיה באורך פרש תיאורטי של בערך 300 ננומטר, כך גודל הסריקה צריך להיות בערך 420 ננומטר.
    2. בתוכנה AFM, מקם הזיז כך 80 אחוזים של גודל הסריקה מהמשטח (במקרה זה, על 340 nm מהמשטח).
    3. AFM תוכנה, הגדר את מהירות סריקה nm 300/s בתחילה.
      הערה: ניתן לשנות מהירות זו להיות איטי או מהיר, בהתאם ליישום.
    4. לבצע ניסוי מושך ולמדוד את המיקום המתקבל של piezo את האות פוטודיודה. להשתמש בתוכנה AFM כדי ליזום את הסריקה.
    5. התוכנה AFM, ממשיכים לבצע מדידות עד ישנם כ-10,000 הקלטות.
      הערה: באופן כללי, שיעור האיסוף של מולקולה שבשליטת חיובי הוא סביב 0.5%16, אז 10,000 נחוצים להיות מסוגל לאסוף לנתח את הנתונים.

7. ניתוח נתונים

  1. לנרמל את הנתונים.
    1. עבור כל הקלטה, לחשב את הסיומת שימוש בסיומת = העקירה - F/kc (kc הוא מן 5.2.7).
    2. לקבוע את רמת כוח בסיסית על ידי לקיחת הממוצע של התחלה או סוף המעקב אריכות-כוח, היכן פסגות כוח לא נמצאים והיכן לא הקשה על הזיז מפני השטח. אז יכול להיות מוזז עקומת הכוח כולו-הרחבה על-ידי זה הערך הממוצע.
    3. לתרגם את הנתונים כך הסיומת מיושר לאורך ציר y אפס. הסיבה לכך היא מולקולת צריך להיות מוגדר כאפס סיומת בתחילת שנות מעקב.
  2. זיהוי חלבונים עניין.
    1. לזהות הקלטות עם פחות ארבעה אירועים I91 המספקים טביעת אצבע מולקולה בודדת. הקלטות אלה ללכוד אמיתי "מולקולה בודדת מדידות".
    2. שמור באירועים זה מסומן מולקולה בודדת אירועים לניתוח נוסף.
  3. לקבוע את אורך-גובה תוספת קבועה.
    1. עבור כל הקלטה, מתאים מודל תולעת שרשרת האירועים התגלגלות, Equation 2 בו Equation 3 בטמפרטורת החדר, p מייצג אורך ההתמדה (בדרך כלל 0.4 ל- 1 ננומטר) x הוא הסיומת מופיע ננומטר, L הוא האורך מתאר ב ננומטר.
      הערה: טופס של הרשת תולעת הוא פתרון עם אינטרפולציה בדיוק, פתרון מספריים מדויקים יותר מצוי Bouchiat. et al. 17. ניתן למצוא מודלים חלופיים התאמה סו. et al. 18.
    2. חישוב ההפרש בין הערכים עבור L שנקבע שני האירועים התגלגלות רצופים, הבדל זה טבע "תוספת אורך-קונטור".
  4. לקבוע כוח קרע.
    1. לחשב את הכוח קרע לאירוע התגלגלות נתון על ידי לקיחת הנקודה הגבוהה ביותר לפני השחרור הגדול ביותר בתוך עקומת התגלגלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות נציג של פרוטוקול זה מוצגים באיור2. שני לוחות הצג נציג חיל-סיומת עקומות של חלבונים. העליון מציג תוצאות polyprotein I91, בעוד החלק התחתון מציג את החלבון I91 איגוף חלבון-של-עניין, מולקולת10ג ני. הקלטות אלו הראו את כוחם אופייני של I91 (200 pN) מתאר תוספת אורך (28 ננומטר) אשר מציין יישור וכיול של AFM היה מוצלח. עקומות אלה הרחבת כוח ניתן לנתח אז תולעת רשתות (קו מקווקו) אשר עוזרים לקבוע את האורך תלוי-כוח של המולקולה, לקבוע את המספר של שאריות פרש. לאחר ניתוח, את ההפרשים הקבועים מתאר באורך (ההפרש בין הבאים מתאר-אורכי) הכוח התגלגלות יכול לשמש כדי לקבוע את היציבות חלבון, התגלגלות קצב, התגלגלות ש"השביל19.

Figure 1
איור 1: מפת פלסמיד polyprotein. זה polyprotein פלסמיד מפה רצף DNA פיזי זמין דרך המאגר Addgene (www.addgene.org/74888). זה מראה את העיצוב polyprotein הטיפוסי של AFM, איפה polyprotein מורכבת מ 8 חזרה זהה של חלבון I91 (תיבות אפור) אשר לאגף חלבון עניין (אדום). כל מודול מכיל אתר ההגבלה ייחודי המאפשר התאמה אישית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: נציג SMFS תוצאות. א עקומת כוח נציג-סיומת עבור פוליפוני I91 חלבון. אורך מתאר רווח בין פסגות היא ~ 28 ננומטר, התגלגלות כוחות הם בין 100-200 pN. B. עקומת כוח נציג-סיומת עבור (I91)3-ני10C-(I91)3 חלבונים. כלומר אורך מתאר וההקטנה ankyrin אני חוזר הוא ~10.5 ננומטר, ועל כוחות התגלגלות הם בין 8-25 pN. התבנית שיני המסור רגיל עבור ankyrin חזרה ואחריו פסגות התגלגלות I91. מהירות עבור שניהם מושך (א) ו (ב) הם nm 0.02 נקודות/גב' אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שלב קריטי בפרוטוקול הוא השימוש polyprotein, שמתואר בשלב 1.1.2, אשר משמש פקד חיובי כדי "טביעות אצבע" אירועים מולקולה בודדת. באופן כללי, יש חייב להיות התגלגלות אירועים של החלבונים polyprotein (עבור I91, המשמעות היא כוח התגלגלות כ-200 pN, מתאר אורך קבועה של 28 ננומטר) למסקנה חד משמעית כי החלבון עניין כבר פרש. לדוגמה, כאשר החלבון עניין משני צדדיה שלושה תחומים I91 מכל צדדיו, אז חייב להיות לפחות ארבעה אירועים I91 להסיק כי הוא בהחלט אירוע יחיד מולקולה. אם לא פקד חיובית דרך של polyprotein, או אמצעים אחרים, אז כל הנתונים הם עלולים פירוש מוטעה.

האסטרטגיה שיבוט פלסמיד תלוי ג'ין ואת פלסמיד עניין. עשינו הזמינים של פלסמיד polyprotein אשר יכול לשמש בשילוב עם פרוטוקול זה12. יש פלסמידים זמינים בשלב זה מכילים אתרי הגבלת ייחודי עבור פשוט שיבוט20,21. פלסמידים אלה דורשים רק מערך ייחודי של הגבלת אתרים בקלות לשכפל חלבון עניין לתוך פלסמיד. ישנן גם שיטות כדי ליצור הזה פלסמיד באמצעות הרכבה גיבסון22 אשר יש את היתרון של שינוי בקלות את החלבונים מתקלף תוך הוספת החלבון עניין. ישנם גם פלסמידים עם polyproteins מודולרית עם תחומים codon גרר מספק דרך פשוטה ביעילות רצף החלבון כל עניין, מסייע להבטיח את אמינות21.

הבחירה של זהב או זכוכית תלוי אם החלבון יש מצורפים מסוים זמין. מצעים זהב מאפשרים להרכיב Au-Cys קשרים בין polyprotein את פני השטח. אם Cys מצורפת בסוף polyprotein, ואז זה יכול לשמש כדרך במיוחד לצרף את החלבון על פני השטח. מצעים זכוכית ניתן להשתמש בכוחות עצמם, אשר שימושיים עבור חלבונים מסוימים אשר לא לספוח טוב לזהב, גם הן פשוטות יותר ליצור. שקופיות זכוכית יכול לשמש גם כמבשר כדי באמצעות מצורפים מסוים עשוי במיוחד polyproteins23. נציץ סובסטרטים יכול לשמש גם, אשר עשוי להיות שימושי עבור כמה חלבונים שיש להם אתרי תשלום מסוים ניתן לאגד השטח טעונים שלילית.

AFM ספקטרוסקופיה על חלבונים יש מספר מגבלות חשובות. הכנת הדוגמא עלולה להיכשל אם החלבון לא יכול להיות משולבים לתוך polyprotein. חלבונים הם קטנים מדי כדי לייצר במרווחים מתאר באורך מדיד או חלש מדי מכדי להתנגד בכוח גם לא יוכלו להיפתר על ידי AFM. רזולוציה טיפוסי בניסויים AFM מאפשר רק פתרון כוחות נמוך כמו 10-15 pN עקב רעש RMS טיפוסי ב AFM cantilevers, למרות ההתקדמות האחרונה הפכו הרזולוציות הזמינות טוב יותר עם מכשור מתקדם24. המהירות לניסויים מהירות קבועה גם הוא מוגבל ל- nm/s 425, הפתרון הטוב ביותר מושגת בדרך כלל ניתן לזהות את הברית קצר יותר מאשר 10 µs24. אם חלבונים הם פחות יציב באופן מכני, הם יותר מאופיינים באמצעות מלקחיים אופטיים ובו מגוון כוח התחתון, בדרך כלל רזולוציה טמפורלית גבוהה יותר. ישנם עדיין שיפורים בעתיד לרשות AFM, כמו שילוב עם סריג26, באמצעות הדמיה כדי לקבוע עמדות חלבון27 ופתרון הגוברת cantilevers שתוכנן במיוחד28AFM.

הטכניקה AFM היא משמעותית ביחס שיטות קיימות כי זה מאפשר חילוץ פרמטרים קינטי, כמו התגלגלות קצב ומרחק מצב המעבר על רמה מולקולה בודדת29. בעוד שיטות הביוכימי מסורתיות אחרות (NMR, דנטורציה כימיים, קרינה פלואורסצנטית זרימה עצר) ניתן גם להשיג מידע על פרמטרים קינטי, התוצאות של שיטות אלה הם פונקציות של אנסמבל של חלבון, לא מולקולה בודדת. זה עושה את ההבדל החשוב במקרים שבו יש הרכבים שונים ומובחנת של חלבון יחיד. AFM הוכיחו להיות מסוגל להבחין את subpopulations, במקום בממוצע אותם יחד30.

הסבר מפורט של הניסוי SMFS על מולקולות חלבון מעל עדיין לא צופים בעיות אפשריות הניתנות עם ניסיון. בקישורים הבאים נדון בעיות נפוצות, פתרון בעיות הקשורות עם ההפעלה של AFM לניסויים מהירות קבועה.

בסיסית כוח בצורת הרמוניים וסינוסיים. הצורה sinusoidal היא מזיקה כדי לקבוע ערך שיא כוח הנכונה מאז שקשה לחשב הבסיס. הבעיה נגרמת על ידי הפרעה של הלייזר שמשתקף הזיז. כדי להקל על בעיה זו, המיקום של הנקודה לייזר על הזיז יכול להיות מעט מוזז ככל המיקום החדש עדיין שומרת על אות סכום טוב מתוך פוטודיודה. אם הבעיה עדיין נמשכת, לשקול שינוי מיקום הזיז את הגשוש בתא מעצר.

פוטודיודה אות לא עיתוני ב בשלב אחד כאשר לגעת במשטח בפעם הראשונה. כאשר לגעת במשטח, האות פוטודיודה קופץ במספר שלבים עד שהוא מגיע הערך רוויים. משמעות הדבר היא כי הטיפ הוא לא שהנקודה הנמוכה ביותר בראש AFM, מקום אחר על השבב בדיקה יכולה לגעת השטח מדגם לפני קצה שלוחה. בעיה זו יש צורך לתקן על מנת להמשיך את המידות SMFS ולקבל עקומת כוח-השלוחה הנכון. כדי לפתור את הבעיה, נסה להעביר את המיקום של הזיז את הגשוש בתא מעצר הלוך ולהתאים ההידוק של הקרס אשר אוחז הזיז במקום. אם זה לא עוזר, לנסות לעבור זיז שונים על השבב אותו או אפילו שינוי שבב זיז חדש.

אירועים רבים על נסיגה, או אירועים בכלל. זה קשור מציאת ריכוז החלבון המתאים לניסוי. אם יש תמיד יחיד גדול כוח שיא (> 500 pN) המופיעים על הסימן מתיחה, אין פסגות אחרות מוצגים תוך ביצוע ניסויים על משטח מצופה זהב, הזיז הוא למעשה מדידת אינטראקציה זהב זהב מאז מולקולות מדגם על פני השטח הם דלילה מדי. במקרה זה, הריכוז של המדגם חלבון שהופקדו על משטח זהב צריך להיות מוגברת. עם זאת, אם קיימות מספר פסגות חריגה להופיע על כל סימן מתיחה בכל מחזור מושך, הוא מציין כי יש גם הרבה מולקולות נספג אל פני השטח שיצרו שכבה או רשת מורכב על פני השטח. במקרה זה, המדגם צריך לרחוץ על-ידי המאגר המשמש להסרת מולקולות חלבון עודף. לפעמים הכנת מדגם חדש עם ריכוז נמוך יותר של חלבון יש צורך להיפטר בעיה זו. אם הדוגמה החדשה גם לא יכול לפתור את הבעיה, בדוק את החריץ טבעתי עמומה AFM בתא מעצר כדי לראות אם כל נוזל חודר לתוכו. החריץ צריך להישאר יבש במהלך הניסוי מאז כל נוזל ב- groove זוג את הרטט של המדגם לתוך בתא המעצר ולגרום האות פוטודיודה לשנות באופן חריג כאשר שלוחה של פני השטח הם בקשר.

אפנון כדין סימן פוטודיודה, בין רמפות. . זה מעיד על זרימת יכול לדחוף הזיז אחורה וקדימה, אשר נגרמת בדרך כלל על ידי בועה קטנה כי זה הם מגיעים דרך הערוצים נוזלים. סוג זה של בעיה ישבש מדידות עם האות ענק עליות או ירידות. כדי לפתור בעיה זו, מרימים את הראש מן המצע, כך הנוזל סביב הזיז כבר לא נוגע הנוזל סביב המצע. ואז להחזיר אותם יחד, להזיז את הראש בחזרה אל פני השטח. הרפורמציה של העמודה נוזל התא מיקרוסקופ כוח אטומי הוא בדרך כלל מספיק כדי לשבש את הבועה הערוצים נוזלים, אבל אם לא, חוזר הכרחי.

שיטתית לעליה או ירידה בפוטודיודה האות. נסחף היא תופעה קיימת לאורך כל הניסוי, איפה את cantilevers ועל הטיפ תמיד תיסחף מהר מאוד ביצירת מגע נוזלי יתרון על פני מדגם. הסחף יכולה להיגרם על ידי טמפרטורה equilibration, שבו הטמפרטורה-induced התפשטות או התכווצות של הזיז גורמת רעידות בתוך האות. מחכה יותר מ 10 דקות לפני ביצוע הניסוי הראשון יקטן באופן משמעותי מהירות נסחף. כאשר עורכים ניסויים מושך, אם האיתור מתיחה ומרגיעה אינם מתנגשים אחד עם השני, ואז יש היסטרזיס בין שני החצאים של מחזור מושך, אשר תואם את קצב נסחף מהר, דרוש זמן נוסף כדי להגיע שיווי משקל. אם הבסיס כוח נוטה כלפי מעלה עם זווית קטנה, מהירות נסחף היא מעל למהירות מושך, עדיף להשעות את הניסוי להמתין פחות רטט של הקצה.

חיל-סיומת עקומת אזור הראשונית אינה אנכי. מומלץ להסתכל על העלילה כוח-סיומת של הקלטות לאחר שרכשו מהגדרת לאחרונה מכוילת. אם הקלטות אלה אינם מראים אזור אנכי כאשר הזיז מקיש נגד פני השטח, ואז הכיול יכול להיות בעיה, יש לחזור עליה משלב 5.

פוטודיודה האות נעלם לאחר זמן מה. זה יכול להיות בגלל האידוי של המאגר בתא נוזלים. חשוב לשתות התא על-ידי החלת יותר מאגר כל שעה או אז, על מנת למנוע את הדגימה מתייבשת ו עושה שמיש עבור עוד ניסויים.

רעש פנימי הוא גבוה (> 30 pN). כמות גדולה של רעש (הנמדדת של RMS של תנודות פוטודיודה מכוילת) היא מעידה על רעש חיצוני. AFM ניסויים צריך להיעשות על טבלת אוויר כדי להפחית את כמות צימוד לבניין, אבל רעש חיצוני יכול להיגרם גם על ידי שלב חסר ביטחון, השמיעה רעש הסמוך, או צימוד של הטבלה אוויר הסמוכים אובייקטים סטטיים (למשל כיסא). הרעש עשוי לבוא גם מן המערכת שליטה אלקטרונית של AFM (למשל, חיבור לא יציב במערכת אלקטרונית).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית מענקים MCB-1244297 MCB-1517245 כדי PEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM Specimen Discs, 15mm diameter Ted Pella, Inc. 16218 Serve as base for glass substrate
Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick Ted Pella, Inc. 26024 serve as glass substrate and base for gold coating
Adhesive Tabs Ted Pella, Inc. 16079 Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips
STD Multimode head assembly Bruker Nano Inc. 1B75C AFM head
Glass probe holder Bruker Nano Inc. MTFML-V2 Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  
Microlever AFM probes Bruker Nano Inc. MLCT Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes
AFM probes with Au coated tips Bruker Nano Inc. OBL-10 Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force
Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs National Instruments PCI-6259 Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators
LISA Linear Piezo Stage Actuators Physik Instrumente LP P-753.11C Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements
XY Piezo Stage Physik Instrumente LP P-541.2CD Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. The study of protein mechanics with the atomic force microscope. Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).
  3. Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM). Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).
  4. Rico, F., Chu, C., Moy, V. T. Methods in Molecular Biology. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. 331-353 (2011).
  5. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).
  6. Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
  7. Kim, M., et al. Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials. Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).
  8. Gonzalez, M. A., et al. Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins. Advanced Materials. , (2017).
  9. Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).
  10. Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes. Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).
  11. Davis, L. Basic methods in molecular biology. , Elsevier. (2012).
  12. Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. , (2016).
  13. Scholl, Z. N. The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , Duke University. (2016).
  14. Pawlak, K., Strzelecki, J. Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments. Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).
  15. Nanopuller. , https://sourceforge.net/projects/nanopuller/ (2018).
  16. Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions. Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).
  17. Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).
  18. Su, T., Purohit, P. K. Mechanics of forced unfolding of proteins. Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).
  19. Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy. Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).
  20. Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).
  21. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of β-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).
  22. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
  23. Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level. Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).
  24. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  25. Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations. Science. 342 (6159), 741-743 (2013).
  26. He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy. ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).
  27. Fotiadis, D., Scheuring, S., Müller, S. A., Engel, A., Müller, D. J. Imaging and manipulation of biological structures with the AFM. Micron. 33 (4), 385-397 (2002).
  28. Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
  29. Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins. Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).
  30. Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a βγ-Crystallin Protein. Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).

Tags

ביוכימיה גיליון 144 מיקרוסקופ כוח אטומי polyprotein ספקטרוסקופיה כוח מתקפלים מולקולה בודדת חלבונים חלבונים טיהור
כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E.,… More

Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. J. Vis. Exp. (144), e55989, doi:10.3791/55989 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter