Summary
우리는 상세한 절차 및 전략 기계적 특성 및 기계적 전개 경로 원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자의 측정을 설명 합니다. 우리는 또한 선택과 좋은 단일 단백질 분자 기록의 정당성에 대 한 참조로 대표적인 결과 보여줍니다.
Abstract
그들의 네이티브 3D 구조에 그들의 아미노산 시퀀스 로부터 단백질의 접히는 과정의 결정은 생물학에 있는 중요 한 문제 이다. 원자 힘 현미경 (AFM) 스트레칭과 휴식 단일 단백질 분자의 특정 전개 및 refolding 특성의 직접 증거를 제공 함으로써이 문제를 해결할 수 있습니다. AFM 기반 단일-분자 힘-분광학 AFM-SMF () 일관 되 게 에너지 conformations 전통적인 대량 (생화학) 측정에 가능 하지 않은 단백질을 측정 하는 수단을 제공 합니다. 수많은 논문 AFM SMF의 원리를 보여주는에 게시 된, 하지만 그것은 철저 하 게 완전 한 프로토콜의 부족 때문에 SMF 실험을 실시 쉽지 않다. 이 연구에서 우리는 AFM의 원리를 간단히 설명 하 고 광범위 하 게 세부 프로토콜, 절차, 및 데이터 분석 SMF 실험에서 좋은 결과 달성 하는 지침. 단일 단백질 기계 펼쳐진 측정의 대표적인 SMF 결과 설명 하 고 우리가 제공 하는 문제가 발생 하는 일반적으로 몇 가지 문제 해결 전략.
Introduction
AFM에 의해 단일 분자 힘 분광학 (SMF)에 발전 기계 조작 및 단일 단백질 분자의 정확한 특성화를 활성화 했습니다. 이 특성화 단백질 기계1,2,3, 단백질-리간드 상호작용4, 단백질 단백질 상호 작용5, 접히는 단백질에 대 한 새로운 통찰력을 생산 하고있다 및 단백질 기반 설계 재료6,,78. SMF는 단백질을 공부 하는 데 특히 유용 수 있습니다 제공 하는 지속적으로 증가 윤곽선 길이를 상승 그들의 강성에 따라 점차적으로 확장 하는 단백질 분자 내의 화학 및 물리적 채권 AFM에 의해 기지개로 전개. 단백질 분자의이 잡아당기고 수 파열 이벤트의 결과로 힘 확장 곡선에서 갑작스러운 변환을 (또는 강제로 피크). 강제로 피크 기계적 전개 과정에서 단백질의 펼쳐 힘 및 구조 변화에 직접 정보를 제공합니다. AFM을 사용 하 여 첫 번째 연구 중 하나 titin1 을 측정 하 고 전개 하 고 집중된 화학 물질 또는 극단적인 온도 같은 부자연 스러운 denaturants의 사용 없이 생리 적인 조건 하에서 refolding 단백질의 새로운 측면을 발견.
여기 우리가 고려만 AFM SMF 실험 다양 한 악기에 수행 됩니다. AFM은 4 개의 주요 요소로 구성: 프로브, 검출기, 샘플 홀더 및 압 전 스캐너. 프로브는 캔틸레버의 중세 끝에 날카로운 끝 이다. 교정, 후 연결 된 분자의 스트레칭 하는 동안 캔틸레버의 휨 측정 된다 Hooke의 법률을 사용 하 여 힘을 정확 하 게 결정 하는 캔틸레버의 뒤쪽에서 반영 되는 레이저 빔을 사용 하 여. 레이저 빔 다이오드 센터에서의 변위에 비례하여 전압을 생성 하는 사분면 포토 다이오드 검출기에 반사 된 레이저 빔 프로젝트. 액체에 단백질 샘플 기판 하위 나노미터 정밀도로 제어할 수 있는 3 차원 압 전 단계에 거치 된다. 컴퓨터 포토 다이오드 감지기에서 전압을 읽는다 고 컴퓨터 제어 전압 공급을 통해 3D 단계를 제어 합니다. 이러한 압 전 액추에이터 단계는 일반적으로 장착 용량 성 또는 스트레인 게이지 위치 센서 정확 하 게 측정 압 전 변위 및 피드 백 제어 시스템을 통해 정확한 히스테리시스. 압 전 컨트롤러에서 센서 신호 출력은 공장에서 캘리브레이션 된 압 전 전압 상수를 사용 하 여 거리 변환 됩니다. 당기는 실험에서 예 힘 확장 곡선 그림 2에 표시 됩니다.
AFM SMF 실험의 두 가지 유형이 있다: 일정 한 속도 지속적인 힘 측정을 당기. 지속적인 힘 SMF 측정 Oberhauser 외 에 설명 되어 있습니다. 9, 여기 우리가 일정 속도 측정에 집중 하는 동안. 전형적인 AFM 상수 속도 당기 실험 기판 캔틸레버 끝에 상대적으로 부드럽게 이동 하는 압 전 전압을 제공 하 여 수행 됩니다. 전형적인 실험 표면에 대해 처음 누르면 팁이 있다. 당기 측정 접촉에서가지고 팁에서 기판으로 이동 하 여 시작 됩니다. 단백질 처음 팁의 접촉으로 온다, 당겨 질 것 이다 하 고 변위에 대 한 힘의 펼쳐진 추적 측정 됩니다. 기판은 다음 팁 접촉 돌아온 것 고 편안한 추적 어디 단백질 접기 결정 될 수 있다 힘 변위에서 측정 된다.
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Protocol
1. 단백질 준비
- DNA 복제입니다.
- 관심, NI10C10, 예를 들어 DNA 시퀀스의 DNA 순서를 합성 하거나 통해 PCR 표준 분자 생물학 기법11를 사용 하 여 호스트 유기 체에서 분리 합니다. 합성 또는 5'-끝 (Addgene #74888)12에 플라스 미드 pEMI91 모듈에 해당 하는 PCR 뇌관의에 사이트를 배치 하 여 금지 사이트와 관심사의 유전자를 측면.
- 별도로 소화 플라스 미드 pEMI9112 와 제한 사이트의 쌍으로 관심사의 DNA 순서는 관심사의 순서는 I91 ( 그림 1참조)을 반복 하는 협동에 의해 형벌 것입니다. 금지 사이트에 대 한 표준 프로토콜을 따릅니다.
- 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 소화 제품을 정화 하 고 T4 DNA 리가, 다음과 같은 표준 프로토콜을 사용 하 여 제품을 선. 결 찰, 후 플라스 미드 플라스 미드 정화에 대 한 대장균 세포로 변환 하 고 표준 프로토콜을 사용 하 여 플라스 미드 정화. 시퀀스는 시퀀스 성공적으로 변형 되었다 확인 T7 뇌관 또는 내부 pEMI91 뇌관을 사용 하 여.
- 변환입니다.
- C41 같은 단백질 식 세포 제거 (DE3) pLysS 셀-80 ° C 냉동 고 얼음에 완전히 해 동에서.
- 셀에 플라스 미드 DNA의 1 µ L을 추가 하 고 볶음 짧게; 공기 방울을 소개 하 고 온난 한 셀 아래로 pipetting 권장 하지 않습니다.
- 세포와 30 분 동안 얼음에 플라스 미드를 포함 하는 문화 관을 품 어.
- 열 충격 45 42 ° C에서 물 욕조에 셀 s.
- 2 분 동안 얼음에 튜브를 반환 합니다.
- 셀에 파운드 국물의 950 µ L를 배치 하 고 37 ° c.에 1 시간에 250 rpm에서 흔들
- 약 200 µ L 파운드 접시 포함 하는 100 µ g/mL 암 피 실린에 변환의 장소. PEMI91 다른 플라스 미드를 사용 하는 경우 다음 그 플라스 미드에 대 한 적절 한 항생제를 사용 합니다. 37 ° c.에 인큐베이터에 접시를 하룻밤 장소 다음 날, 인큐베이터에서 제거 접시 parafilm, 포장 하 고 저장소 냉장 1 달까지.
- 단백질 식입니다.
- 접시에 단일 세균성 식민지로 살 균 피 펫 팁을 감동 하 고 아래로 파운드에 pipetting으로 하룻밤 성장 위한 37 ° C에서 50 mL 튜브에서 100 µ g/mL 암 피 실린과 파운드 국물 매체의 15 mL를 접종.
- 100 µ g/mL 암 피 실린과 파운드 국물 매체의 1 리터에 15 mL 문화를 전송 하 고 37 ° C에서 4-12 h에 대 한 동요 (까지 명이600 > 0.8).
- 10 mL 플라스 미드 준비에 대 한 문화를 수집 합니다.
- 0.2-1 m m 이소프로필-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 추가 하 고 하룻밤 표현 위한 실내 온도에 온도 낮춘 다.
- 4 개의 튜브로 분할 하 고 40 분 4000 × g 에서 centrifuging 여 다음날 세포를 수확 하 고 몇 시간 동안-80 ° C에서 펠 릿을 동결.
- 시퀀싱에 대 한 셀에서 해당 단백질12 의 삽입된 카세트 하 뇌관으로 추출 하는 플라스 미드를 보내고 삽입된 DNA의 충실도 확인 하십시오.
- 단백질 정화입니다.
- 실 온에서 30 분 동안 냉동된 세포의 1 개의 관 동
- 해 동된 세포 세포의 용 해 버퍼 (38 mL 물, 글리세롤, 50 mM Tris HCl pH 7.6, 150 m m NaCl, 1 mM CaCl2, 10 µ g/mL DNase, 1 밀리미터 PMSF, 1mm TCEP, 500 µ g/mL lysozyme의 2 개 mL)를 일시 중단 하 고 1 시간에 대 한 얼음에 흔들.
- 몇 시간 동안-80 ° C에서 lysed 세포를 고정 하 고 다시 실 온에서 해 동.
- 4 ° c.에 30 분 13100 × g 에서 lysate 아래로 회전
- 특정 태그 (예: Strep 태그 또는 그의 태그)에 대 한 중력 흐름 열 통해는 상쾌한을 실행 합니다.
- 버퍼 교환 Strep 태그 또는 그의 태그 사용 하기 전에 4 ° C에서 저장소에 대 한 적절 한 버퍼를 사용 하 여 원심 필터를 사용 하 여 수행 합니다.
2. 슬라이드 샘플 준비를 위한 준비
- 피 라 솔루션을 사용 하 여 유리 슬라이드를 준비 합니다.
- 장소 10-30 조각 40 mL 유리 비 커에 유리 커버 전표 (7.5 m m의 반지름) 라운드.
참고: 후드에이 단계와 다음 단계를 수행 합니다. 이 단계 동안 위험한 화학 물질 처리에 대 한 표준 절차를 따릅니다. - 집중된 (18.4 M) 황산 30 mL를 추가 합니다.
- 30%의 과산화 수소의 10 mL를 추가 합니다.
- 95 ° c 10-30 분을 위한 혼합물이 열
- 신중 하 게는 별도 폐기물 컨테이너 (재사용 또는 폐기)으로 피 솔루션을 가만히 따르다.
- 슬라이드 피 솔루션을 제거 하는 이온된 수와 린스.
- 아세톤의 40 mL에 슬라이드를 일시 중단 합니다.
- 폐기물 용기에 아세톤을 가만히 따르다와 에탄올 40 mL에 슬라이드를 다시 일시.
- 깨끗 한 집게를 사용 하 여 신중 하 게 한 번에 한 슬라이드를 추출 하 고 건조 한 아르곤 또는 공기를 정화.
- 장소 깨끗 하 고 건조 슬라이드까지 골드 증발, 진공 또는 아르곤 장기 보관을 위해.
- 장소 10-30 조각 40 mL 유리 비 커에 유리 커버 전표 (7.5 m m의 반지름) 라운드.
- (선택 사항) 골드 코팅된 슬라이드를 준비 합니다.
참고: 이 단계는 주요 대학에서 많은 클린 룸 시설에서 사용할 수 있는 진공 (전자 빔) 증발 기를 사용 하 여를 필요 합니다.- 5 현미경 슬라이드 (25 x 75 mm 직사각형 모양)는 산울타리를 사용 하 여 반으로 잘라.
- 양면 접착 테이프는 10의 각각의 중간에 걸쳐 적용 반 현미경 슬라이드.
- 스티커 메모의 끈 적 한 면을 잘라 고 메모의 끈 적 한 면이 면 업 이중 면 테이프에 적용 합니다. 스티커 메모는 일반적으로 덜 접착제, 하지만 아직도 단단히 미래의 침입을 방지 하기 위해 슬라이드에 부착. 다음 그 절반 현미경 슬라이드 유리 슬라이드 소유자 지금 사용할 수 있습니다.
- 신중 하 게 4 개의 깨끗 한 유리 슬라이드 (섹션 2.1.10) 소유자의 끈 적 한 면의 각 모서리를 누릅니다.
- 전자 빔 증발 기를 유리 슬라이드를 이동 합니다. 70을 적용 하는 증발 기의 사양에 따라 크롬 및 300의 nm 금 표면에 nm.
- 아르곤 골드 코팅 슬라이드를 저장 합니다.
3. 샘플 준비
-
슬라이드를 준비 합니다.
- 깨끗 한 철 디스크 (15 m m 직경)를 선택 하 고 그것에 연결할는 접착제 탭.
- 접착제 탭의 커버 조각 unattach
- (섹션 2.1.10)에서 깨끗 한 유리 또는 금 (2.2.7 섹션)에서 일부를 선택 하 고 단단히 철 디스크의 끈 적 한 면에 배치,이 샘플 슬라이드 됩니다.
- 슬라이드에 예금 단백질입니다.
- 실험 (25mm Tris HCl, pH 7.6 150 mm NaCl)에 대 한 버퍼는 polyprotein dialyze 0.5 mL 원심 필터 같은 버퍼 교환 열을 사용 하 여. 13000 rpm에서 10 분 동안 열에 단백질 회전 다음 열을 반전 하 고 2 분 1000 rpm에 회전에 의해 새로운 버퍼에 단백질을 elute.
- 280에서 흡 광도 측정 하 여 대략적인 단백질 농도 결정 nm는 분 광 광도 계를 사용 하 여.
- 10-100 µ g/mL에서 100 µ L의 최종 볼륨을 단백질을 희석.
- 슬라이드의 중심에 단백질 해결책의 60 µ L를 적용 합니다. 하도록 하지 어떤 액체 유리와 철 슬라이드 사이의 간격으로 아래 입력이 실험 및 통제 샘플 움직임 동안 접착제의 붓기가 발생할 수 있습니다이 단계에서 주의 해야 합니다.
참고: 골드 슬라이드는 소수 성, 그리고 구형 물방울 형태로 유리 슬라이드는 더 친수성 단백질 솔루션 확산 수 있습니다 하는 동안. - 샘플 10-60 분 동안 실내 온도에 앉아 보자. 이 시간 동안, 원자 힘 현미경 설정을 시작 하려면 다음 단계를 진행 합니다.
4. 원자 힘 현미경 (AFM) 설치
참고: 다음은 AFM, 설정에 대 한 일반적인 설명 그리고 일부 특정 내용을 특정 계측 사용에 따라 다를 수 있습니다. 사용 계측 이며 부분적으로 집에서 만든 숄13에서 자세히 설명 합니다.
- AFM 셀에 캔틸레버를 탑재 합니다.
- 응용 프로그램에 대 한 적절 한 속성을 가진 캔틸레버를 선택 합니다. 사용 cantilevers 스프링 상수와 낮은 전개 세력에 대 한 4-10 pN/nm (10 ~ 50 pN), 사용 cantilevers 스프링 상수와 높은 전개 세력에 대 한 15-100 pN/nm.
- 신중 하 게 끝에서 캔틸레버를 선택 하 고 셀을 잡고 프로브에 배치.
- 지주 셀 단단히 보유 캔틸레버 자리에 계속 하기 전에 다는 것을 확인 하십시오.
- 레이저의 정렬에 대 한 AFM 머리에 지주 셀을 놓습니다.
- AFM 머리에서 레이저를 맞춥니다.
- 머리는 거꾸로 한 현미경에 놓고 머리에 레이저 전원 공급을 위한 AFM 머리에 배터리 팩을 연결 합니다.
- 레이저 빛은 TV 나 모니터에 구상 될 수 있다 그래야 현미경 검출기에 카메라를 연결 합니다.
- 레이저를 위치 하는 캔틸레버의 끝에 위치
- 샘플으로 머리를 탑재 합니다.
- 각 셀을 잡고 프로브 포트의 버퍼의 10 µ L를 플러시.
- 배양 된 샘플 슬라이드를 incubated 솔루션에서 액체의 40 µ L을 가만히 따르다. 슬라이드에는 버퍼의 40 µ L를 추가 합니다. 장소는 압 전 위의 자석에 샘플 슬라이드.
- AFM 단계 높은 위치에 있는지 확인 합니다. AFM 캔틸레버 샘플 방울 위에 되도록 다음 스테이지로 AFM 머리를 놓습니다.
- 센터는 광다이오드에 반사 된 레이저 빔입니다.
- 종이의 작은 조각을 잘라내어 AFM 포토 다이오드 앞에서 그것을 배치.
- AFM 레이저 레이저 자리는 종이에 집중 하 고 밝은 되도록 손잡이 사용 하 여 위치를 변경할.
- 레이저 모든 사분면 (A + B + C + D)에 총 신호를 최대화 하기 위해 포토 다이오드를 안타와 상위 2 사이의 차이 신호 발생 및 0 (A + B-C-d)를 두 개의 사분면 아래쪽 AFM 헤드 미러를 조정 한다.
5. 원자 힘 현미경 교정
- 파워 스펙트럼을 측정 합니다.
- AFM에 연결 된 필터에 전체 대역폭을 AFM 머리 신호에 대 한 필터 설정을 설정 합니다.
- AFM 자체에 피는 떨어져 잡음 신호에 추가 됩니다 확인 하십시오.
- AFM 소프트웨어14 를 사용 하 여 1, 024 데이터 포인트를 계산에서 파워 스펙트럼의 512 계산의 평균을 측정.
- AFM 소프트웨어15 를 사용 하 여 해당 주 모드의 캔틸레버에 대 한 진동 하는 첫 번째 피크에 걸쳐 전력 스펙트럼 밀도 통합.
- 포토 다이오드 감도 계산 합니다.
- AFM 자체에서 압 전 컨트롤러 설정 하 고 500 Hz (로우-패스 필터) 필터 설정을 변경.
- 0은 AFM 소프트웨어에 주위 변동 한다 차이 신호를 모니터링 합니다. 신속 하 게 micropositioners를 사용 하 여 몇 백 마이크로미터 아래로 AFM 머리를 이동 합니다. 머리를 아래로 이동을 반복 하 고 일관 된 점프에 대 한 차이 신호 모니터링. 표면은 매우 때 신호 점프 근처 시작 높이 증가 합니다.
- 최대한 빨리 편향 신호 포화 표면, 접촉 시 표면에서 머리를 약간 이동 합니다.
- AFM 소프트웨어에 입력된 컨트롤을 사용 하 여 표면, 100-5000 nm를 위아래로 이동 하 여 찾을 수 전 전압을 조절. 없으면 표면 여전히 도달에, 수동으로 머리와 샘플 사이의 거리를 줄이기 위해 계속.
- AFM 소프트웨어에서 약 500의 스캔 크기와 당기 실험 실시 nm는 약 100 접촉 들어온다 팁 피 여행의 nm.
- AFM 팁 기판 표면 접촉 유지는 포토 다이오드 신호 대 압 전 변위 곡선의 선형 지역의 경사를 측정 합니다.
- 감도 기울기와 통합된 파워 스펙트럼을 사용 하 여 스프링 상수를 계산 (
).
).6. 데이터 수집
- 준비입니다.
- AFM에 연결 된 필터, 샘플링 주파수가 두 번 이상 대역폭 (Nyquist 조건) 저역 컷오프에 대 한 상한이 줄 것 이다 필터 설정을 설정 합니다.
- 측량입니다.
- 스캔 크기 펼쳐진 polyprotein (아미노산 × 0.365 수) 플러스 눌러 기판에 대 한 수 있도록 약 40%의 총 이론적인 크기를 설정. 예를 들어 약 300의 이론적인 펼친된 길이 있을 것 이다 당기는 9 x I91 구문 nm, 스캔 크기 약 420 이어야 한다 그래서 nm.
- AFM 소프트웨어의 위치는 캔틸레버 표면에서 스캔 크기의 80%를 (340에 대 한이 경우에, 표면에서 nm).
- AFM 소프트웨어에서 설정 스캔 속도 300 nm/s 처음.
참고: 이 속도 느린, 또는 응용 프로그램에 따라 빠르게 수정할 수 있습니다. - 당기는 실험을 수행 하 고는 압 전 및 포토 다이오드 신호의 결과 위치를 측정 한다. AFM 소프트웨어를 사용 하 여 스캔을 시작 하려면.
- AFM 소프트웨어에서 측정을 수행 약 10000 녹음 때까지 계속 합니다.
참고: 일반적으로, 긍정적인 통제 분자의 픽업 속도 0.516, 그래서 10000은 분석에 충분 한 데이터를 수집할 수 있을 하는 데 필요한 주위입니다.
7. 데이터 분석
- 데이터 표준화
- 각 레코딩에 대 한 계산 사용 하 여 확장 확장 변위-F/kc = (kc 5.2.7에서 이다).
- 아무 힘 봉우리는 현재 시작 또는 힘-확장 추적의 끝의 평균을 취 함으로써 초기 힘 수준을 결정 하 고 캔틸레버 표면에 대하여 누르는 하지. 전체 힘 확장 곡선 다음이 평균 값으로 이동 수 있습니다.
- 되도록 확장 제로 y 축을 따라 데이터를 변환. 이 때문에 분자 확장 추적의 시작 부분에서 0으로 설정 해야 합니다.
- 관심사의 단백질을 식별합니다.
- 단일 분자 지문 제공 하는 적어도 4 개의 I91 이벤트와 함께 녹음을 식별 합니다. 이러한 녹음 캡처 진정한 "단일 분자 측정".
- 추가 분석에 대 한 단일 분자 이벤트를 표시 하는 이벤트를 저장 합니다.
- 윤곽선 길이 증가 결정 합니다.
- 각 레코딩에 대 한 맞게 펼쳐지는 이벤트, 벌레 모양의 체인 모델
어디 
실내 온도에, p 속성 길이 (일반적으로 0.4 ~ 1 nm), x 는 나노미터의 확장 이며 L 에 윤곽선 길이 나노미터입니다.
참고: 벌레 같은 체인의 형태는 정확한 보정된 솔루션, 더 정확한 숫자 솔루션 Bouchiat 그 외 여러분 에서 발견 된다 17. 대체 피팅 모델 수 외 에서 찾을 수 있습니다 18. - L 2 연속 펼쳐지는 이벤트, 결정 그리고이 차이가 만들어낸 값 사이의 차이 계산 "윤곽선 길이 증가".
- 각 레코딩에 대 한 맞게 펼쳐지는 이벤트, 벌레 모양의 체인 모델
- 파열 힘을 결정 합니다.
- 펼쳐진 곡선에서 큰 하락 전에 높은 포인트를 취 함으로써 주어진된 펼쳐진 이벤트에 대 한 파열 힘을 계산 합니다.
어디 
실내 온도에, p 속성 길이 (일반적으로 0.4 ~ 1 nm), x 는 나노미터의 확장 이며 L 에 윤곽선 길이 나노미터입니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 프로토콜에서 대표적인 결과 그림 2에 표시 됩니다. 두 패널 단백질에서 대표적인 힘 확장 곡선을 표시합니다. 상단 하단 표시는 단백질--관심, NI10C 분자 측면 I91 단백질 I91 polyprotein에서 결과 표시 합니다. 이러한 녹음 표시 I91의 특성 힘 (200 pN) 윤곽선 길이 증가 (28 nm) 정렬 및 AFM의 교정 되었는지 나타냅니다. 이러한 힘 확장 곡선 다음 웜 같은 체인 (파선) 분자의 힘-독립적인 길이 결정 하 고 펼친된 잔류물의 수를 결정 하는 데 도움이 하 여 분석할 수 있습니다. 일단 분석, 윤곽선 길이 증가 (후속 윤곽선 길이 차이) 펼쳐진 힘 단백질 안정성, 속도, 전개 및 전개 통로19를 결정 하기 위해 사용 될 수 있다.
그림 1: polyprotein의 플라스 미드 맵. 이 polyprotein 플라스 미드 맵 순서 및 물리적 DNA Addgene 저장소 (www.addgene.org/74888)를 통해 제공 됩니다. 그것은 한 polyprotein 관심사 (빨간색)의 단백질을 측면 I91 단백질 (회색 상자)의 8 동일 반복의 구성은 AFM에 대 한 원형 polyprotein 디자인을 보여줍니다. 각 모듈에는 사용자 지정을 허용 하는 고유한 제한 사이트를 포함 되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대표 SMF 결과. A. 많은 I91 단백질에 대 한 대표적인 힘 확장 곡선. 봉우리 사이 윤곽선 길이 증가 ~ 28 의미, 및 힘을 전개는 100-200 pN 사이. B. 대표 힘 확장 곡선 (I91)3-10C-(I91)3 단백질에 대 한. Ankyrin 반복에 대 한 윤곽선 길이 증가 ~10.5 nm, 그리고 전개 세력 8-25 pN 사이 의미 합니다. Ankyrin 반복에 대 한 일반 톱니 패턴 뒤에 I91 펼쳐진 봉우리. 당기 속도 둘 다를 위해 (A)와 (B)는 0.02 nm/양 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
프로토콜에 중요 한 단계는 "지문" 단일 분자 이벤트를 긍정적인 통제 역할 단계 1.1.2에서에서 설명 하는 polyprotein의 사용 이다. 일반적으로, 거기 한다 밝혀지고 있을 polyprotein 단백질의 이벤트 (I91, 즉 약 28의 약 200 pN 및 윤곽선 길이 증가의 펼쳐진 힘 nm) 관심사의 단백질의 접힌 되었습니다는 명확 하 게 결론. 예를 들어 때 관심사의 단백질은 양쪽에서 3 개의 I91 도메인에 의해 형벌 이다, 다음 있어야 합니다 그것은 긍정적으로 단일 분자 이벤트 결론 적어도 4 개의 I91 이벤트. Polyprotein, 또는 다른 수단을 통해 긍정적인 통제 없는 경우, 모든 데이터는 오해에 책임.
플라스 미드에 대 한 복제 전략 유전자와 플라스 미드의 관심에 따라 달라 집니다. 우리가 사용할 수 사용 될 수 있는 polyprotein 플라스 미드를에 만들었습니다이 프로토콜12와 함께. 간단한20,21복제에 대 한 고유 금지 사이트를 포함 하는이 단계에 사용할 수 있는 플라스 미드 있다. 이 플라스 미드는 쉽게 플라스 미드에 관심사의 단백질에 복제 제한 사이트의 고유한 집합이 필요 합니다. 또한 쉽게 벗겨짐 단백질 관심사의 단백질을 삽입 하는 동안 수정의 장점이 깁슨 어셈블리22 를 사용 하 여 처음부터이 플라스 미드를 만드는 데 사용할 수 있는 방법 있다. Codon 단행 도메인21충실도 보장에 은닉 자의 전체 단백질 시퀀스 효율적으로 하는 간단한 방법을 제공 하는 모듈형 polyproteins와 플라스 미드도 있다.
금 또는 유리의 선택 여부는 단백질은 사용할 수 있는 특정 첨부 파일에 따라 다릅니다. 금 기판은 polyprotein와 표면 사이 Au Cys 채권을 형성 하실 수 있습니다. 경우는 Cys는 polyprotein의 끝에 추가 됩니다,이 특히 표면에 단백질을 연결 하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 유리 기판 사용할 수 있습니다, 스스로 골드에 잘 흡착 되지 않는 또한 생성 하는 간단 하 게 몇 가지 단백질에 대 한 유용한. 유리 슬라이드는 또한 특별히 만든된 polyproteins23특정 첨부 파일을 사용 하는 전조로 사용할 수 있습니다. 운 모 기판도 사용할 수 있습니다, 어떤 특정 요금 사이트를 부정적으로 위탁 된 표면에 바인딩할 수 있는 일부 단백질을 위해 유용할 수 있습니다.
AFM 분광학 단백질에는 몇 가지 중요 한 제한이 있습니다. 샘플 준비 단백질은 polyprotein으로 접합 될 수 없는 경우 실패할 수 있습니다. 측정 가능한 윤곽선 길이 증가 생산을 너무 작거나 너무 약한 힘을 저항 하는 단백질도 되지 않습니다 AFM에 의해 결심 될 수 없습니다. 최근 발전 고급 계측24사용할 수 더 나은 해상도 만들었습니다 비록 AFM 실험에서 일반적인 해상도 세력 AFM 캔틸레버에 전형적인 RMS 잡음으로 인해 10-15 pN 낮은 해결, 수 있습니다. 일정 속도 실험에 대 한 속도 또한 약 4 nm/s25, 제한 하 고 달성 하는 최고의 해상도 일반적으로 10 µs24보다 짧은 상태를 검색할 수 있습니다. 단백질은 적은 경우 기계적으로 안정 하 고, 그들은 더 나은 특징 이다 낮은 힘 범위, 일반적으로 더 높은 시간 해상도 광학 핀셋을 사용 하 여. 지금도 개선 미래에 AFM, 수 마세요26, 단백질 위치27 와 특별히 설계 된 캔틸레버28증가 해상도 확인 하려면 이미징 AFM을 사용 하 여 결합 처럼.
AFM 기술은 전개 속도 단일 분자 레벨29에 전환 상태 거리 같은 운동 매개 변수 추출 허용 하기 때문에 기존의 방법에 관하여 중요 하다. 다른 전통적인 생 화 확 적인 방법 (NMR, 화학 변성 중지 흐름 형광)도 운동 매개 변수에 대 한 정보를 얻을 수 있습니다, 하는 동안이 메서드의 결과 단백질 앙상블 및 아니라 단일 분자의 기능입니다. 이 경우에는 중요 한 차이가 있는 단일 단백질의 다른 프로세스와 다른 앙상블. AFM 그들 함께30평균 하는 대신 부분 모집단을 구별할 수 있을 것으로 나타났습니다.
위의 단백질 분자에 SMF 실험의 자세한 설명을 아직도 경험으로 해결 될 수 있는 가능한 문제를 예상 하지 않습니다. 다음에 우리는 일반적인 문제를 논의 하 고 상수 속도 실험에 대 한 AFM을 작동과 관련 된 문제 해결.
사인 모양의 힘 기준선. 정현파 형태는 기준선을 계산 하기가 어렵습니다 이후 올바른 힘 피크 값 결정에 해로운. 문제는 캔틸레버에서 반사 레이저의 간섭에 의해 발생 합니다. 이 문제를 완화 하는 캔틸레버에 레이저 스팟의 위치 수 약간 이동으로 새로운 위치는 여전히 좋은 합 신호는 포토 다이오드에서 유지. 문제가 계속 발생 하는 경우 셀을 잡고 프로브에 캔틸레버를 재배치 하는 것이 좋습니다.
포토 다이오드 신호 단계에서 표면 처음 만질 때 포화 하지 않습니다. 표면, 만질 때 포토 다이오드 신호 포화 값에 도달할 때까지 여러 단계에서 이동 합니다. 즉, 팁은 AFM 머리와 프로브 칩에 다른 곳에서 가장 낮은 지점 캔틸레버의 끝 전에 샘플 표면 터치 수 있습니다. 이 문제는 SMF 측정을 계속 하 고 올바른 힘 확장 곡선을 얻기 위해서 고정 해야 있다. 문제를 해결 하려면 셀을 앞뒤로 들고 프로브에 캔틸레버의 위치 이동 시도 하 고 장소에 캔틸레버를 장악 하는 걸이의 견고를 조정 합니다. 이 도움이 되지 않습니다, 만약 동일한 칩에 다른 캔틸레버로 전환 하십시오 하거나 심지어 새로운 외팔보 칩을 변경 합니다.
철회, 시 많은 이벤트 또는 모든 이벤트가 없습니다. 이것은 실험에 대 한 올바른 단백질 농도 찾는 관련이 있습니다. 경우 항상 큰 단일 피크 (> 500 pN) 스트레칭 추적에 게재 하 고 다른 봉우리 금 코팅된 표면에 대 한 실험을 수행 하는 동안 표시 됩니다, 캔틸레버는 실제로 측정 샘플 분자 이후 금 금 상호 작용 표면 너무 스파스 있습니다. 이 경우에, 금 표면에 단백질 샘플의 농도 증가 한다. 그러나, 거기에 각 당기 사이클의 모든 스트레칭 흔적에의 불규칙 모양의 봉우리 여러 개 있다면, 거기는 너무 많은 분자 표면에는 레이어 또는 복잡 한 네트워크를 형성 하는 표면에 흡수 나타냅니다. 이 경우에, 샘플 과잉 단백질 분자를 제거 하는 데 사용 하는 버퍼에 의해 세척 될 필요가 있다. 때로는 단백질의 더 낮은 농도 가진 새로운 샘플을 준비 하는 것은이 문제를 제거 해야 합니다. 새로운 샘플도 문제를 해결할 수 없습니다, 어떤 액체 그것에 침투 하는 경우 참조 셀을 잡고 AFM에 두르고 고리 모양의 홈을 확인 합니다. 홈 유지 한다 건조 실험 기간 동안 홈에 어떤 액체 것 지주 셀에 샘플의 진동 커플 고 캔틸레버와 표면 터치에는 비정상적으로 변화를 광다이오드 신호를 발생.
경사로 사이 포토 다이오드 신호의 스 퓨 리 어스 변조. 이것은 외팔보 앞뒤로, 일반적으로 유체 채널을 통해 전송 되는 작은 거품에 의해 발생을 밀 수 있는 흐름의 지표 이다. 이러한 종류의 문제 거 대 한 신호 증가 또는 감소 측정을 중단 것입니다. 이 문제를 해결 하려면 캔틸레버 주위 액체 이상 기판 주위 액체를 접촉 하는 기판에서 머리를 올립니다. 그리고 다시 함께, 그들을 표면 아래 다시 머리를 이동 합니다. 개혁 AFM 셀에 유동성 란의 일반적으로 경우 하지 하지만 유체 채널에서 거품을 방해 하기에 충분 한 반복이 필요.
체계적인 증가 또는 포토 다이오드 신호 감소. 표류 하는 것은 존재 하는 각 실험에 걸쳐 어디는 캔틸레버와 팁 항상 샘플 표면에 액체 방울을 만지고 시 매우 빠른 드리프트 것입니다 현상. 드리프트 있는 온도 유도 확장 또는 수축 캔틸레버의 진동 신호에서 발생 하는 온도 평형에 의해 발생할 수 있습니다. 크게 표류 속도 줄일 것 이다 첫 번째 실험을 실시 하기 전에 10 분 이상 기다리고 있습니다. 할 때 당기 실험, 스트레칭 그리고 편안한 추적 서로와 일치 하지 않는 경우, 다음 있다 히스테리시스는 당기 주기, 빠른 표류 속도에 해당 도달 하는 데 추가 시간이 필요의 두 반쪽 사이의 평형입니다. 힘 기준선 위쪽으로 작은 각도와 다리, 표류 속도 당기는 속도 보다 더 빠르게 하 고 팁의 적은 진동 기다려야 실험을 중단 하는.
힘 확장 곡선 초기 지역 수직 아니다. 그들은 새로 보정된 설정에서 획득 후 녹음의 힘 확장 줄거리 보고 유용 합니다. 이러한 녹음 캔틸레버 표면에 대하여 누르는 때 수직 영역을 표시 하지 않습니다, 다음 보정 문제가 있을 수 있습니다 하 고 5단계를 반복 해야 합니다.
포토 다이오드 신호 몇 시간 후 사라집니다. 이 유체 셀에 버퍼의 증발으로 인해 수 있습니다. 그것은 중요 rehydrate 하 적용 하 여 셀을 더 매 시간 마다 버퍼 또는 그래서, 밖으로 건조 및 제작 샘플을 유지 하기 위해서는 그것에 대 한 사용할 수 없는 추가 실험.
내장 잡음은 높은 (> 30 pN). 많은 양의 잡음 (보정된 포토 다이오드 동요의 RMS로 측정 되는) 외부 잡음의 나타내는 것입니다. AFM 실험 건물, 커플링의 양을 줄이기 위해 공기 테이블에서 할 수 있지만 외부 잡음 불안 단계, 청각 소음 근처, 또는 가까운 정적 개체 (예를 들어, 의 자)에 어 테이블의 커플링에 의해 발생할 수 있습니다. 소음 또한 AFM (예를 들어, 전자 시스템에 불안정 한 연결)의 전자 제어 시스템에서 올 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 과학 재단 교부 금 인 m c B-1244297 및 MCB-1517245 PEM에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM Specimen Discs, 15mm diameter | Ted Pella, Inc. | 16218 | Serve as base for glass substrate |
| Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick | Ted Pella, Inc. | 26024 | serve as glass substrate and base for gold coating |
| Adhesive Tabs | Ted Pella, Inc. | 16079 | Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips |
| STD Multimode head assembly | Bruker Nano Inc. | 1B75C | AFM head |
| Glass probe holder | Bruker Nano Inc. | MTFML-V2 | Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM. |
| Microlever AFM probes | Bruker Nano Inc. | MLCT | Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes |
| AFM probes with Au coated tips | Bruker Nano Inc. | OBL-10 | Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force |
| Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs | National Instruments | PCI-6259 | Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators |
| LISA Linear Piezo Stage Actuators | Physik Instrumente LP | P-753.11C | Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements |
| XY Piezo Stage | Physik Instrumente LP | P-541.2CD | Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface |
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