Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kraft spektroskopi av enda proteinmolekyler genom en Atomic Force Mikroskop

Published: February 28, 2019 doi: 10.3791/55989
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University

Summary

Vi beskriver detaljerade förfaranden och strategier att mäta mekaniska egenskaper och mekaniska utspelas vägar av enda proteinmolekyler genom en atomic force Mikroskop. Vi visar också representativa resultat som en referens för urval och motivering av bra enda protein molekyl inspelningar.

Abstract

Bestämning av fällbara processen av proteiner från deras aminosyrasekvens till deras infödda 3D-strukturen är ett viktigt problem i biologi. Atomic force microscopy (AFM) kan lösa problemet genom att aktivera stretching och avslappning av enda proteinmolekyler, som ger direkta bevis för specifika utspelar sig och vika egenskaper. AFM-baserade single-molekyl kraft-spektroskopi (AFM-SMFS) tillhandahåller ett sätt att mäta konsekvent high-energy konformationer i proteiner som inte är möjligt i traditionell bulk (biokemiska) mätningar. Även om många papper publicerades för att visa principer för AFM-SMFS, är det inte lätt att genomföra SMFS experiment på grund av ett uttömmande komplett protokoll. I denna studie vi kortfattat illustrera principerna för AFM och detalj omfattande om protokoll, förfaranden och dataanalys som riktlinje att uppnå goda resultat från SMFS experiment. Vi visar representativa SMFS resultat av enda protein mekaniska pågående mätningar och vi tillhandahåller felsökningsstrategier för vissa ofta stött på problem.

Introduction

Framsteg inom enda molekyl kraft spektroskopi (SMFS) av AFM har aktiverat mekanisk manipulation och exakt karakterisering av enda proteinmolekyler. Denna karakterisering har producerat nya insikter om protein mekanik1,2, protein fällbara3, protein-ligand interaktioner4, protein-protein interaktioner5, och protein-baserade konstruerad material6,7,8. SMFS är särskilt användbart för att studera protein utspelar sig, som stretching av AFM tillåter de kemiska och fysiska obligationerna inom proteinmolekyl att gradvis utvidga enligt deras stelhet, som ger upphov till en ständigt ökande kontur längd. Detta översträckning av en proteinmolekyl kan producera en abrupt övergång i kraft-extension kurvan vilket resulterar i en bristning-händelse (eller tvinga peak). Kraft toppen ger direkt information om utspelas kraft och strukturella förändringen av protein under processen mekaniska utspelas. En av de första studierna använder AFM mätt titin1 och hittade nya aspekter av protein utspelar sig och vika under fysiologiska betingelser utan användning av onaturliga denatureringsmedel som koncentrerade kemikalier eller extrema temperaturer.

SMFS experiment utförs på olika instrument, även här anser vi bara AFM. AFM består av fyra huvuddelar: sonden, detektorn, provhållaren och piezoelektriska skannern. Sonden är en vass spets domkyrkoklockan ände en fribärande. Efter kalibrering mäts böjning av uthänget under stretching av en bifogade molekyl med hjälp av en laserstråle som återspeglas på baksidan av uthänget att exakt bestämma styrkor med Hookes lag. Återspeglas laser beam projekt i en kvadrant fotodiod detektor som producerar en spänning i proportion till förskjutningen av laserstrålen från stadens diod. Underlaget med protein provet i vätska är monterad på en 3D piezoelektriska scenen som kan styras med sub nanometer precision. En dator läser spänningen från fotodiod detektorerna och styr 3D scenen genom en datorstyrd spänningstillförsel. Dessa piezo actuator stadier är vanligtvis utrustade med kapacitiv eller stam-gauge ståndpunkt sensorer att exakt mäta piezo förskjutning och rätt hysteres genom återkoppling styrsystem. Sensor signal utdata från piezo handkontrollen omvandlas till avstånd med konstanten spänning av den piezo som är fabriken-kalibrerad. En exempel kraft-extension kurva från en dragande experiment visas i figur 2.

Det finns två typer av AFM-SMFS experiment: konstant hastighet och konstant kraft dra mätningar. Konstant kraft SMFS mätningar beskrivs i Oberhauser o.a. 9, medan här fokuserar vi på konstant hastighet mätningar. En typisk AFM konstant hastighet dragkraft experiment görs genom att ge spänning till en piezo att försiktigt flytta ett substrat i förhållande till en fribärande spets. En typisk experiment har spetsen först trycka mot ytan. Dra mätningen påbörjas genom att flytta substratet från spetsen att föra ut ur kontakten. Om ett protein som kommer i kontakt med spets från början, det kommer att dras och utspelas tracen av kraft mot förskjutning kommer att mätas. Substratet förs sedan tillbaka i kontakt med spets och en avkopplande trace mäts där proteinveckning kan fastställas från kraft förskjutningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. protein förberedelse

  1. DNA kloning.
    1. Syntetisera en DNA-sekvens av intresse, exempelvis DNA-sekvensen om NI10C10, eller isolera via PCR från värd organismen använder standard molekylärbiologiska tekniker11. Flankera gen av intresse med begränsning platser under syntes eller genom att placera platser i 5'-ände PCR primers ska motsvara en modul i Den plasmiden pEMI91 (Addgene #74888)12.
    2. Separat smälta både de plasmid pEMI9112 och DNA-sekvensen av intresse med ett par av begränsning platser så att sekvensen av intresse kommer att åtföljas av den tandem I91 upprepas (se figur 1). Följ standardprotokollet för begränsning webbplatser.
    3. Rena smält produkten med hjälp av gelelektrofores och sedan ligera produkter T4 DNA-ligase, efter ett standardprotokoll. Efter ligering, förvandla plasmiden till E. coli celler för plasmid rening och rena plasmiden använder standardprotokoll. Sekvens med T7 grundfärger eller inre pEMI91 primer för att verifiera att sekvensen förvandlades framgångsrikt.
  2. Omvandling.
    1. Ta bort protein uttryck celler, såsom C41 (DE3) pLysS celler, från en-80 ° C frys och Tina helt på is.
    2. Tillsätt 1 µL av plasmid DNA i cellerna och rör kort; Pipettera upp och ner är inte tillrådligt eftersom det kommer att införa luftbubblor och värma cellerna.
    3. Inkubera kultur röret som innehåller cellerna och plasmiden på is i 30 min.
    4. Värme chock cellerna i ett vattenbad vid 42 ° C för 45 s.
    5. Tillbaka röret till is i 2 min.
    6. Placera 950 µL av LB buljong i cellerna och skaka vid 250 rpm för 1 h vid 37 ° C.
    7. Placera ca 200 µL av omvandlingen till LB plattor som innehåller 100 µg/mL Ampicillin. Om du använder en plasmid än pEMI91, sedan använda anslåantibiotikummen för denna plasmid. Placera plattan över natten i en inkubator vid 37 ° C. Nästa dag, ta bort plattan från inkubator, wrap med parafilm, och butiken i kylskåp upp till 1 månad.
  3. Proteinuttryck.
    1. Inokulera 15 mL LB buljong medium med 100 µg/mL ampicillin i en 50 mL tub vid 37 ° C för övernattning tillväxt genom att vidröra en steril pipettspetsen till en enda bakterie koloni på plattan och pipettering upp och ner i LB.
    2. Överför den 15 mL kulturen till 1 L LB buljong medium med 100 µg/mL ampicillin och skaka för 4-12 h vid 37 ° C (tills OD600 > 0,8).
    3. Samla 10 mL av kulturen plasmid förberedelse.
    4. Tillsätt 0,2-1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) och sänka temperaturen till rumstemperatur för övernattning uttryck.
    5. Skörda celler nästa dag genom att dela upp i fyra rör och centrifugering vid 4000 × g i 40 min och sedan frysa pelleten vid-80 ° C i flera timmar.
    6. Skicka de plasmider som utvinns ur cellerna för sekvensering med primers motsvarar insatt kassett av protein12 och kontrollera det infogade DNA.
  4. Protein rening.
    1. Tina en tub frusna celler i 30 min i rumstemperatur.
    2. Avbryta upptinade celler i lyseringsbuffert (38 mL vatten, 2 mL glycerol, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 10 µg/mL DNase, 1 mM PMSF, 1 mM TCEP, 500 µg/mL lysozym) och skaka på is för 1 h.
    3. Frysa lyserat cellerna vid-80 ° C i flera timmar och sedan åter Tina i rumstemperatur.
    4. Snurra den lysate ner vid 13100 × g i 30 minuter vid 4 ° C.
    5. Kör supernatanten genom en gravitation flöde kolumn för specifika taggen (t.ex. Strep-tag eller His-tag).
    6. Utföra en buffert exchange med en centrifugal filter använder lämpliga bufferten för Strep-tag eller His-tag och förvaras vid 4 ° C före användning.

2. rutschbanor förberedelse för provberedning

  1. Förbereda glasskivor med Piranha lösning.
    1. Plats 10-30 bitar av runda glas täckglas (radie på 7,5 mm) in i en 40 mL glasbägare.
      Obs: Utföra detta steg och följande steg i en huva. Följ standardiserade förfaranden för att hantera farliga kemikalier under detta steg.
    2. Tillsätt 30 mL koncentrerad svavelsyra (18,4 M).
    3. Tillsätt 10 mL 30% väteperoxid.
    4. Värm blandningen för 10-30 min till 95 ° C.
    5. Dekantera försiktigt Piranha lösningen i en separat papperskorg (för att återanvändas eller kasseras).
    6. Skölj glasen med avjoniserat vatten för att avlägsna Piranha lösning.
    7. Avbryta bilderna i 40 mL aceton.
    8. Häll upp aceton i en avfallsbehållare och slamma diabilder i 40 mL etanol.
    9. Använd ren pincett för att försiktigt extrahera en bild i taget och torka med argon eller renad luft.
    10. Plats ren och torkade bilder under vakuum tills guld avdunstning, eller under argon för långsiktig lagring.
  2. Förbereda guld belagda bilder (valfritt).
    Obs: Detta steg kräver användning av ett vakuum (e-beam) förångaren, som finns i många rena rumsfaciliteter på stora universitet.
    1. Halvera fem objektglas (25 x 75 mm rektangulär form) med hjälp av en glasscutter.
    2. Tillämpa dubbelsidig tejp över mitten av varje av 10 halv objektglas.
    3. Skär den klibbiga sidan av en fästis och gälla den dubbelhäftande tejpen så att den klibbiga sidan av anteckningen är uppåtvänt. Klibbig anteckningen är generellt mindre lim, men fortfarande fast binder till diabilder att förhindra framtida bryta. Sedan kan dessa halv objektglas nu fungera som glashållare diabilder.
    4. Tryck försiktigt fyra rent objektglas (från avsnittet 2.1.10) till varje hörn av den klibbiga sidan av innehavaren.
    5. Flytta glasskivor till e-beam förångare. Följ specifikationerna i förångaren gälla 70 nm av krom och 300 nm guld till ytan.
    6. Lagra guld-belagd bilderna under argon.

3. provberedning

  1. Förbereda bilden.
    1. Välj en ren järn disk (15 mm diameter) och bifoga en självhäftande flik till den.
    2. Unattach täcka lappa av den självhäftande fliken.
    3. Välj en bit rent glas (från avsnittet 2.1.10) eller guld (från avsnitt 2.2.7) och fäst den ordentligt på den klibbiga sidan av järn disken, kommer detta vara prov bilden.
  2. Deponera protein på objektglas.
    1. Dialyze polyprotein in i bufferten för experimentet (25 mM Tris-HCl, pH 7,6 med 150 mM NaCl) med hjälp av en buffert Jonbytarkolonnen såsom ett 0,5 mL centrifugal filter. Snurra proteinet i kolumnen för 10 min på 13.000 rpm och sedan vända kolumnen och eluera proteinet in i en ny buffert av snurrande vid 1000 rpm i 2 min.
    2. Bestämma den ungefärliga protein koncentrationen genom att mäta absorbansen vid 280 nm med en spektrofotometer.
    3. Späd proteinet till 10-100 µg/mL i en slutlig volym av 100 µL.
    4. Applicera den 60 µL protein lösning på mitten av bilden. Var försiktig i detta skede inte att låta någon vätska in under i gapet mellan glaset och järn bilden, eftersom detta kan orsaka svullnad av limmet under experimentet och okontrollerad prov rörelser.
      Obs: Guld diabilder är hydrofoba och en sfärisk droplet att bilda, medan glasskivor är mer hydrofil och protein lösningen kan spridas.
    5. Låt provet stå i rumstemperatur i 10-60 min. Under denna tid, gå vidare till nästa steg att börja ställa upp mikroskopet atomic force.

4. atomic Force Mikroskop (AFM) Setup

Obs: Följande är en allmän beskrivning för att ställa in AFM, och några specifika detaljer kan variera beroende på de specifika instrument som används. De instrument som används är delvis hembyggda och beskrivs i detalj i Scholl13.

  1. Montera av uthänget på en AFM cell.
    1. Välja av uthänget med lämpliga egenskaper för programmet. Använd cantilevers med fjäder konstanter 4-10 pN/nm för låg utspelas styrkor (~ 10-50 pN), medan användning cantilevers med fjäder konstanter 15-100 pN/nm för höga utspelas krafter.
    2. Försiktigt plocka upp av uthänget från slutet och placera det i sonden håller cellen.
    3. Kontrollera att cellen innehav fast håller uthänget på plats innan du fortsätter.
    4. Placera den anläggning cellen i AFM huvudet för uppriktning av lasern.
  2. Rikta in lasern i AFM huvudet.
    1. Placera huvudet på ett inverterat Mikroskop och Anslut ett batteripaket i AFM-huvudet för att driva lasern i huvudet.
    2. Bifoga en kamera till Mikroskop detektorn så att laserljuset kan visualiseras på en TV eller bildskärm.
    3. Positionera lasern så att det ligger på spetsen av uthänget
  3. Montera huvud med provet.
    1. Spola 10 µL buffert i var och en av hamnarna i sonden håller cellen.
    2. Ta prov bilden som har ruvning och Dekantera 40 µL av vätska från ruvade lösningen. Tillsätt 40 µL buffert i bilden. Placera provet bilden på magneten över piezo.
    3. Kontrollera att AFM scenen är i upphöjd position. Placera sedan AFM huvudet på scenen så att AFM uthänget är ovanför prov droplet-programmet.
  4. Center återspeglas laserstrålen på fotodioden.
    1. Skär en liten bit papper och placera den framför den AFM fotodioden.
    2. Flytta AFM lasern med vreden så att laser plats på papperet blir fokuserad och ljusa.
    3. Justera AFM huvud spegeln så att lasern träffar fotodioden för att maximera den totala signalen i alla kvadranter (A + B + C + D) och orsakar skillnaden signalen mellan två och botten två kvadranter för att vara noll (A + B-C-D).

5. atomic Force Mikroskop kalibrering

  1. Mät strömmen spektrumet.
    1. På filtret ansluten till AFM, aktiverar du filtret inställningen för AFM huvud signalen att full bandbredd.
    2. På AFM själv, se till att piezo är avstängd eftersom detta kommer att lägga till brus i signalen.
    3. Använd den AFM programvara14 att mäta genomsnittet av 512 beräkningar av power spektrumet från 1.024 datapunkter per beräkning.
    4. Använda de AFM programvara15 för att integrera den spektrala effekttätheten mellan den första toppen, vilket motsvarar huvudläget vibrationer för uthänget.
  2. Beräkna fotodiod känslighet.
    1. Aktivera piezo handkontrollen på AFM själv, och ändra filterinställningen till 500 Hz (lågpassfilter).
    2. Övervaka signalen skillnaden, vilken bör fluktuerande runt noll i programvaran AFM. Snabbt flytta AFM huvudet ner några hundra mikrometrar med micropositioners. Upprepa flyttar huvudet nedåt och övervaka signalen skillnaden för konsekvent hopp. Ytan är mycket i närheten när signalen hoppar börja öka i höjd.
    3. Så snart signalen nedböjning mättat fett vid kontakt med ytan, flytta huvudet bort från ytan något.
    4. I AFM mjukvaran, Använd ingående kontrollerna för att reglera piezo spänningen för att hitta ytan, genom att flytta upp eller ned 100-5000 nm. Om ytan inte är fortfarande i reach, fortsätta att minska avståndet mellan huvudet och provet manuellt.
    5. I AFM programvaran, genomföra ett dragande experiment med en skanningsstorlek på ca 500 nm så att spetsen kommer i kontakt för omkring 100 nm piezo resor.
    6. Mäta lutningen på den linjära regionen fotodiod signal kontra piezo deplacement kurvan där AFM spetsen förblir i kontakt med substratet ytan.
    7. Beräkna våren konstant och känslighet med lutningen och integrerad makt spektrum (Equation 1).

6. data Acquisition

  1. Beredning.
    1. Filtren ansluten till AFM, ange inställningen i filtret så att samplingsfrekvensen är minst två gånger den bandbredd (Nyquistkriteriet), vilket ger en övre gräns för lågpass cutoff.
  2. Mätningar.
    1. Ange skanningsstorlek totala teoretiska storlek som utspelas polyprotein (antal aminosyror × 0.365) plus ca 40% för att trycka mot underlaget. Exempelvis drar en 9 x I91 konstruktion har en teoretisk Övik längd ca 300 nm, så skanningsstorlek bör vara omkring 420 nm.
    2. Placera av uthänget i AFM programvaran, så att det är 80 procent av scan-storleken från ytan (i detta fall om 340 nm bort från ytan).
    3. I AFM ställa programvaran spolningshastighet till 300 nm/s initialt.
      Obs: Denna hastighet kan ändras för att vara långsammare eller snabbare, beroende på applikation.
    4. Utföra en dragande experiment och mäta piezo och fotodiod signalen resulterande ställning. Använda programvaran AFM för att initiera sökningen.
    5. I AFM-programvaran fortsätta att utföra mätningar tills det finns cirka 10 000 inspelningar.
      Obs: Generellt är andelen pickup en kontrollerad molekyl runt 0,5%16, så 10.000 är nödvändiga för att kunna samla tillräckligt med data att analysera.

7. dataanalys

  1. Normalisera data.
    1. För varje inspelning, beräkna tillägget använder förlängning = deplacement - F/kc (kc är från 5.2.7).
    2. Fastställa utgångsläget kraft genom att ta medelvärdet av antingen i början eller slutet av kraft-extension tracen, där ingen kraft toppar är närvarande och där av uthänget inte trycka mot ytan. Hela kraft-extension kurvan kan sedan flyttas med detta medelvärde.
    3. Översätta data så att förlängningen justeras längs noll y-axeln. Detta beror på att molekylen ska sättas till noll förlängning i början av ett spår.
  2. Att identifiera protein av intresse.
    1. Identifiera inspelningar med minst fyra I91 evenemang som ger ett enda-molekyl fingeravtryck. Dessa inspelningar fånga sant ”singel-molekyl mätningar”.
    2. Spara händelser som betecknas singel-molekyl händelser för ytterligare analys.
  3. Bestämma kontur-längd increment.
    1. För varje inspelning, passar en maskliknande kedja modell till pågående händelse, Equation 2 där Equation 3 vid rumstemperatur, p är envishet längden (normalt 0,4 till 1 nm), x är tillägget i nanometer och L är längden kontur i nanometer.
      Obs: Form av maskliknande kedjan är en interpolerade lösning exakt, en mer exakt numerisk lösning i Bouchiat o.a. 17. alternativa passande modeller kan hittas i Su o.a. 18.
    2. Beräkna skillnaden mellan värdena för L fastställts för två på varandra följande utspelas händelser, och denna skillnad är myntade ”contour-längd ökningsvärdet”.
  4. Bestämma brista kraft.
    1. Beräkna brista kraft för en viss utspelas genom att den högsta punkten innan den största minskningen i utspelas kurvan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representativa resultat från detta protokoll visas i figur 2. Båda panelerna visar representativa kraft-extension kurvor från proteiner. Överst visar resultat från en I91 polyprotein, medan nederkant visar I91 proteinet flankerar en protein-of-intresse, NI10C molekylen. Dessa inspelningar visar I91 karakteristiska kraft (200 pN) och contour längd increment (28 nm) som anger att justering och kalibrering av AFM lyckades. Dessa kraft-extension kurvor kan sedan analyseras av maskliknande kedjor (streckad linje) som hjälper till att bestämma längden kraft-oberoende av molekylen och bestämma antalet Övik rester. När analyseras, de kontur-längd steg (skillnaden mellan efterföljande kontur-längder) och den utspelas kraften kan användas för att bestämma protein stabilitet, utspelas rate och utspelas väg19.

Figure 1
Figur 1: Plasmid karta över polyprotein. Detta polyprotein plasmid karta sekvens och fysiska DNA är tillgängligt via databasen Addgene (www.addgene.org/74888). Det visar den prototypiska polyprotein designen för AFM, där ett polyprotein består av 8 identiska upprepningar av I91 protein (grå rutor) som flankerar ett protein av intresse (röd). Varje modul innehåller en unik begränsning webbplats som tillåter anpassning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representant SMFS resultat. A. representativ kraft-extension kurva för poly I91 protein. Menar kontur längd ökning mellan topparna är ~ 28 nm och utspelas krafter är mellan 100-200 pN. B. representativ kraft-extension kurva för (I91)3-NI10C-(I91)3 protein. Menar kontur längd ökning för ankyrin upprepa är ~10.5 nm, och utspelas krafter är mellan 8-25 pN. Regelbundna saw-tand mönstret för ankyrin repetitioner följs av I91 utspelas toppar. Den dragande hastighet för både a och B är 0,02 nm/ms. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ett avgörande steg i protokollet är att utnyttja ett polyprotein, beskrivs i steg 1.1.2, som fungerar som en positiv kontroll till ”fingeravtryck” singel-molekyl händelser. Generellt, det måste utspelas händelser av polyprotein proteiner (I91, innebär detta en utspelas styrka av ca 200 pN och kontur längd ökning av ca 28 nm) entydigt dra slutsatsen att proteinet av intresse har varit Övik. Till exempel när proteinet av intresse ligger flankerad av tre I91 domäner från endera sidan, måste då man minst fyra I91 evenemang dra slutsatsen att det positivt är en singel-molekyl händelse. Om det inte finns en positiv kontroll genom ett polyprotein eller på andra sätt, då alla data är ansvarig för feltolkning.

Kloning strategin för plasmiden beror på genen och plasmid sevärdheter. Vi har gjort tillgängliga ett polyprotein plasmiden som kan användas i samband med detta protokoll12. Plasmider finns tillgängliga för det här steget som innehåller unik begränsning platser för enkel kloning20,21. Dessa plasmider kräver bara en unik uppsättning begränsning platser att enkelt klona i proteinet sevärdheter i Plasmiden. Det finns också metoder för att skapa denna plasmid från grunden med Gibson församling22 , som har fördelen att enkelt ändra de fjällning proteinerna medan du för in proteinet av intresse. Det finns också plasmider med modulära polyproteins med kodon blandade domäner som tillhandahåller ett enkelt sätt att effektivt sekvens hela proteinet av intresse, medhjälp i att säkerställa den trohet21.

Valet av guld eller glas beror på om proteinet har specifika tillbehör som är tillgängligt. Guld substrat möjliggör bildar Au-Cys obligationer mellan polyprotein och yta. Om en Cys läggs till i slutet av polyprotein, kan då detta tjäna som ett sätt att fästa speciellt proteinet till ytan. Glas substrat kan användas av själva, som är användbar för vissa proteiner som inte adsorbera väl till guld och är också enklare att skapa. Glasskivor kan även användas som en föregångare till använda bestämd koppling med specialtillverkade polyproteins23. Mica substrat kan också användas, som kan vara användbara för vissa proteiner som har särskild avgift webbplatser som kan binda till negativt laddade ytan.

AFM spektroskopi på proteiner har flera viktiga begränsningar. Provberedning kan misslyckas om proteinet inte kan skarvas i ett polyprotein. Proteiner som är för liten för att producera mätbara kontur-längd steg eller för svag att stå emot kraft kommer inte heller kunna lösas genom AFM. Typisk resolution i AFM experiment kan endast lösa krafter så låg som 10-15 pN på grund av det typiska RMS bullret i AFM Utliggare, även om senaste framstegen har gjort tillgängliga bättre upplösningar med avancerad instrumentation24. Hastigheten för konstant hastighet experiment är också begränsad till ca 4 nm/s25, och den bästa upplösningen som uppnåtts kan vanligtvis upptäcka staterna kortare än 10 µs24. Om proteiner är mindre mekaniskt stabila, de kännetecknas bättre använda optisk pincett som har en lägre kraft räckvidd och vanligtvis en högre temporal upplösning. Det finns fortfarande förbättringar i framtiden att AFM, som att kombinera med bandet26, använda AFM imaging för att bestämma protein positioner27 och ökande upplösning med specialdesignade Utliggare28.

AFM tekniken är betydelse med avseende på befintliga metoder eftersom det gör att extrahera kinetiska parametrar, som utspelas rate och övergången staten avstånd på en enda molekyl nivå29. Medan andra traditionella biokemiska metoder (NMR, kemiska denaturering, stoppas flöde fluorescens) kan också få information om kinetiska parametrar, är resultaten av dessa metoder funktioner av ett protein-ensemble och inte en enda molekyl. Detta gör en viktig skillnad i fall där det finns olika och skilda ensembler av ett enda protein. AFM har visat sig kunna skilja mellan subpopulationer, istället för i genomsnitt dem grupp30.

En detaljerad förklaring av SMFS experiment på proteinmolekylerna ovan fortfarande räknar inte med eventuella problem som kan lösas med erfarenhet. I det följande diskuterar vi vanliga problem och felsökningsaktiviteter löpande en AFM för konstant hastighet experiment.

Sinus-formade kraft baslinjen. Sinusformad formen är skadligt att avgöra rätt kraft peak värde eftersom det är svårt att beräkna baslinjen. Problemet orsakas av störningar av laser reflekteras från uthänget. För att lindra detta problem, kan positionen för laser plats på uthänget skiftas något så länge den nya positionen behåller en bra summa signal från fotodioden. Om problemet kvarstår, överväga ompositionering av uthänget i sonden håller cellen.

Fotodiod signal inte mätta i one-step när vidröra ytan första gången. När vidröra ytan, hoppar fotodiod signalen i flera steg tills den når värdet mättade. Detta innebär att spetsen inte är den lägsta punkten i AFM huvudet och någon annan plats på sonden chip kan röra vid prov ytan före spetsen av uthänget. Detta problem måste fastställas för att fortsätta SMFS mätningarna och få rätt kraft-filtillägg kurva. Åtgärda problemet, prova att flytta position av uthänget i sonden håller cellen och tillbaka och justera tätheten av den krok vilken griper av uthänget på plats. Om detta inte hjälper, prova att byta till en annan fribärande på samma chip eller jämn ändra till ett nytt fribärande chip.

Många händelser vid indragning eller inga spelningar alls. Detta är relaterat till att hitta rätt protein koncentrationen för experimentet. Om det finns alltid en enda stor kraft peak (> 500 pN) som förekommer på stretching tracen och inga andra toppar visas samtidigt utför experiment på guld belagda ytan, mäter uthänget faktiskt guld-guld interaktion sedan provet molekyler på ytan är alltför gles. I detta fall bör koncentrationen av protein provet deponeras på guld ytan ökas. Dock om det finns flera oregelbundet formade toppar som visas på varje stretching spår av varje dragande cykel, visar att det finns alltför många molekyler absorberas till ytan som ett lager eller ett komplicerat nätverk som bildats på ytan. I det här fallet måste provet tvättas av det buffert som används för att avlägsna överflödigt proteinmolekyler. Ibland förbereder ett nytt stickprov med lägre koncentration av protein är nödvändigt för att bli av med problemet. Om det nya provet också inte kan lösa problemet, kontrollera frostat ringformade spåret på AFM håller cellen att se om vätska trängt in i den. Spåret bör bo torr under experimentet eftersom någon vätska i spåret skulle par vibrationen av provet i den anläggning cellen och orsaka fotodiod signalen ändra onormalt när uthänget och ytan är i touch.

Falska modulering av fotodiod signalen, mellan ramper. Detta är vägledande av flödet som kan driva av uthänget och tillbaka, som oftast orsakas av en liten bubbla som transiteras genom vätska kanaler. Denna typ av problem kommer att störa mätningar med enorma signal ökar eller minskar. För att lösa detta problem, höja huvudet från underlaget, så att vätskan runt uthänget vidrör inte längre vätskan runt substratet. Sedan sammanföra dem tillbaka och flytta huvudet tillbaka ner till ytan. Reformationen i kolumnen vätska i cellen AFM är oftast tillräckligt för att störa bubblan från vätska kanaler, men om inte, upprepa är nödvändigt.

Systematiska ökning eller minskning i fotodiod signalen. Drifting är ett fenomen som är närvarande under hela varje experiment där Utliggare och spetsen kommer alltid glida mycket snabbt vid att röra den flytande droppe på prov ytan. Drift kan orsakas av temperatur Jämviktstiden, där den temperatur-inducerad expansion eller kontraktion av uthänget orsakar vibrationer i signalen. Väntar på mer än 10 min innan genomför den första experimenten kommer att signifikant sänka drivande fart. När genomföra dragande experiment, om stretching och avkopplande spårningen inte sammanfaller med varandra, då finns en hysteres mellan de två halvorna av dragande cykeln, vilket motsvarar en snabb drivande takt och kräver ytterligare tid för att nå jämvikt. Om kraft baslinjen lutar uppåt med en liten vinkel, drivande hastighet är snabbare än dragande hastighet och det är bättre att avbryta experimentet vänta mindre vibrationer av spetsen.

Kraft-extension kurva ursprungliga regionen är inte vertikala. Det är användbart att se på kraft-extension handlingen i inspelningar efter de har förvärvats från en nyligen kalibrerad setup. Om dessa inspelningar inte visar en vertikal region när uthänget pressar mot ytan, då kalibreringen kan vara ett problem och det bör upprepas från steg 5.

Fotodiod signalen försvinner efter en tid. Detta kan bero på avdunstning av bufferten i cellen vätska. Det är viktigt för att rehydrera cellen genom att tillämpa mer buffert varje timme eller så, för att hålla provet från uttorkning och gör det oanvändbart för ytterligare experiment.

Inneboende brus är hög (> 30 pN). En stor mängd buller (mätt som RMS av kalibrerad fotodiod fluktuationer) är vägledande av externt buller. AFM experiment bör göras på ett luft-tabell för att minska mängden koppling till byggnaden, men yttre buller kan också orsakas av osäkra steg, auditiv buller i närheten, eller kopplingen av tabellen luft till närliggande statiska objekt (t.ex. en stol). Buller kan också komma från elektroniska kontrollsystemet av AFM (t.ex. instabil anslutning i det elektroniska systemet).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av National Science Foundation bidrag MCB-1244297 och MCB-1517245 till PEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM Specimen Discs, 15mm diameter Ted Pella, Inc. 16218 Serve as base for glass substrate
Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick Ted Pella, Inc. 26024 serve as glass substrate and base for gold coating
Adhesive Tabs Ted Pella, Inc. 16079 Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips
STD Multimode head assembly Bruker Nano Inc. 1B75C AFM head
Glass probe holder Bruker Nano Inc. MTFML-V2 Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  
Microlever AFM probes Bruker Nano Inc. MLCT Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes
AFM probes with Au coated tips Bruker Nano Inc. OBL-10 Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force
Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs National Instruments PCI-6259 Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators
LISA Linear Piezo Stage Actuators Physik Instrumente LP P-753.11C Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements
XY Piezo Stage Physik Instrumente LP P-541.2CD Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. The study of protein mechanics with the atomic force microscope. Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).
  3. Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM). Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).
  4. Rico, F., Chu, C., Moy, V. T. Methods in Molecular Biology. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. 331-353 (2011).
  5. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).
  6. Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
  7. Kim, M., et al. Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials. Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).
  8. Gonzalez, M. A., et al. Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins. Advanced Materials. , (2017).
  9. Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).
  10. Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes. Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).
  11. Davis, L. Basic methods in molecular biology. , Elsevier. (2012).
  12. Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. , (2016).
  13. Scholl, Z. N. The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , Duke University. (2016).
  14. Pawlak, K., Strzelecki, J. Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments. Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).
  15. Nanopuller. , https://sourceforge.net/projects/nanopuller/ (2018).
  16. Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions. Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).
  17. Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).
  18. Su, T., Purohit, P. K. Mechanics of forced unfolding of proteins. Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).
  19. Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy. Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).
  20. Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).
  21. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of β-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).
  22. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
  23. Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level. Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).
  24. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  25. Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations. Science. 342 (6159), 741-743 (2013).
  26. He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy. ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).
  27. Fotiadis, D., Scheuring, S., Müller, S. A., Engel, A., Müller, D. J. Imaging and manipulation of biological structures with the AFM. Micron. 33 (4), 385-397 (2002).
  28. Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
  29. Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins. Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).
  30. Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a βγ-Crystallin Protein. Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).

Tags

Biokemi fråga 144 Atomic force Mikroskop polyprotein protein fällbara singel-molekyl kraft spektroskopi protein rening
Kraft spektroskopi av enda proteinmolekyler genom en Atomic Force Mikroskop
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E.,… More

Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. J. Vis. Exp. (144), e55989, doi:10.3791/55989 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter