Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

Published: February 28, 2019 doi: 10.3791/55989
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University

Summary

Biz ayrıntılı yordamlar ve mekanik özellikleri ve mekanik unfolding yollar tek protein moleküllerinin bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmek için stratejileri açıklar. Ayrıca seçim ve bloklama iyi tek protein molekülü kayıtları için bir başvuru olarak temsilcisi sonuçları göster.

Abstract

Katlama işlemi yerel 3D yapıları için onların amino asit dizisi üzerinden proteinlerin tayini Biyolojide önemli bir sorundur. Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) germe ve belirli unfolding ve özellikleri refolding doğrudan kanıt veren gevşeme tek protein moleküllerinin sağlayarak bu sorunu ele alabilir. AFM tabanlı tek molekül kuvvet-spektroskopisi (AFM-SMFS) sürekli olarak geleneksel toplu (biyokimyasal) ölçümlerde mümkün olmayan proteinler yüksek enerjili biçimler ölçmek için bir yol sağlar. AFM-SMFS prensipleri göstermek için pek çok makalesi yayımlandı rağmen etraflıca bir iletişim eksikliği nedeniyle SMFS deney kolay değildir. Bu çalışmada kısaca AFM prensipleri göstermek ve kapsamlı detay iletişim kuralları, yordamlar ve veri analizi SMFS deneyler iyi sonuçlar elde etmek için bir kılavuz olarak. Biz tek protein mekanik unfolding ölçümleri temsilcisi SMFS sonuçlarını göstermek ve stratejileri için bazı yaygın karşılaşılan sorun giderme sorunları sağlar.

Introduction

Tek molekül kuvvet spektroskopisi (SMFS) tarafından AFM gelişmeler tek protein molekülleri malzemelerin mekanik manipülasyon ve hassas etkinleştirdiniz. Bu karakterizasyonu protein mekaniği1,2,3, protein-ligand etkileşimleri4, protein-protein etkileşimleri5, katlama protein hakkında yeni anlayışlar üretti ve protein bazlı mühendislik malzemeler6,7,8. SMFS protein eğitimi için özellikle yararlı unfolding, yavaş yavaş kendi sertlik verir rise için sürekli artan bir kontur uzunluğu göre genişletmek için protein molekül içinde kimyasal ve fiziksel Tahvil sağlar AFM tarafından germe olarak. Bu bir protein molekülünün esneme ani geçişe rüptürü olayında ortaya çıkan kuvvet-uzantısı eğri üretmek (veya tepe zorla). Gücü en yüksek mekanik açılım sürecinde protein unfolding kuvvet ve yapısal değişikliği doğrudan bilgi verir. AFM kullanarak ilk çalışmalar titin1 ölçülen ve roman yönlerini unfolding ve yoğun kimyasal madde veya aşırı sıcaklıklara gibi doğal olmayan denatüranlar kullanmaya gerek kalmadan fizyolojik koşullar altında refolding protein bulundu.

Burada sadece AFM dikkate da SMFS deneyler aletleri, çeşitli üzerinde yapılmaktadır. AFM dört ana öğelerden oluşur: sonda, Dedektör, örnek sahibi ve piezoelektrik inceden inceye gözden geçirmek. Sonda bir konsol free-swinging ucunda keskin bir yolgösterendir. Kalibrasyon sonra konsol ekli bir molekülünün germe sırasında bükme tam Kuvvetleri Hooke'un Kanunu kullanarak belirlemek için konsol rahat yansıyan lazer ışını kullanılarak ölçülür. Bir lazer ışını diyot Merkezi'nden çıkarılması ile orantılı olarak Sinus bir çeyreği fotodiyot dedektörü yansıyan lazer ışını projelere. Substrat sıvı protein örneği ile alt nanometre hassasiyetle kontrol edilebilir bir 3D piezoelektrik sahne üzerine monte edilmiştir. Bir bilgisayar gerilim fotodiyot dedektörleri okur ve bilgisayar kontrollü voltaj kaynağı 3D adımında denetler. Bu piezo aktüatör aşamalar genellikle kapasitif ile donatılmıştır veya germe-pozisyon sensörleri tam ölçü piezo deplasman ve geri besleme kontrol sistemi aracılığıyla doğru histeresis detektörler. Sensör sinyal çıkış piezo denetleyicisinden fabrika kalibre piezo gerilim sabiti kullanılarak mesafe içine dönüştürülür. Çekerek bir deneme bir örnek kuvvet-uzantısı eğrisi Şekil 2' de gösterilmiştir.

AFM-SMFS deneyler iki türü vardır: sabit hız ve sürekli kuvvet ölçümleri çekerek. Sürekli kuvvet SMFS ölçümleri Oberhauser vd. açıklanan Burada sabit hız ölçümleri üzerinde ele iken 9. Tipik bir AFM sabit hızda çekme deneyi yavaşça bir substrat prensibine göre bahşiş göre taşımak için bir piezo gerilim sağlayarak yapılır. Tipik bir deney başlangıçta yüzeyine karşı basarak ucu vardır. Çekerek ölçü belgili tanımlık substrate temasımız getirmek için belgili tanımlık uç uzak hareket ettirerek başladı. Bir protein ile temas ipucu başlangıçta gelirse çekilmiş olacak ve deplasman karşı kuvvet unfolding izleme ölçülecektir. Belgili tanımlık substrate ipucu ile temas geri getirilir ve rahatlatıcı bir izleme nerede protein katlanması kuvvet uzaklığı belirlenebilir ölçülür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. protein hazırlık

  1. DNA klonlama.
    1. Faiz, NI10C10, örneğin, DNA dizisi DNA dizisi sentez veya üzerinden PCR standart moleküler biyoloji teknikleri11kullanarak ana bilgisayar organizmadan yalıtmak. Kısıtlama sitelerle ilgi gen sentezi sırasında veya 5'-sonu plazmid pEMI91 modülünde (Addgene #74888)12karşılık gelecek şekilde PCR astar siteleri yerleştirerek kuşatın.
    2. Böylece faiz dizisi (bkz. şekil 1) I91 tekrarlar tandem tarafından çevrili ayrı olarak plazmid pEMI9112 ve ilgi kısıtlama sitelerin bir çift ile DNA dizisi sindirmek. Kısıtlama siteleri için standart iletişim kuralı izleyin.
    3. Jel Elektroforez kullanılarak sindirilir ürün arındırmak ve T4 DNA ligaz, standart bir protokol sonrası kullanarak ürün ligate. Tüp ligasyonu sonra E. coli hücreleri plazmid arıtma plazmid dönüştürün ve standart protokolleri kullanarak plazmid arındırmak. Sıra başarıyla dönüştü doğrulamak için T7 astar veya iç pEMI91 primerler kullanılarak sırası.
  2. Dönüştürme.
    1. C41 gibi protein ifade hücre kaldırma (DE3) pLysS hücrelerden-80 ° C dondurucu ve tezcan tamamen buz üzerinde.
    2. Plazmid DNA 1 µL hücrelere ekleyin ve kısa bir süre karıştırın; yukarı ve aşağı pipetting o hava kabarcıkları tanıtmak ve hücreleri sıcak tavsiye edilmez.
    3. Hücreleri ve 30 dk için buzda plazmid içeren kültür tüp kuluçkaya.
    4. Isı şok bir su banyosunda 45 için 42 ° C'de hücreler s.
    5. 2 min için buz için tüp dönün.
    6. 950 µL LB suyu hücrelere yerleştirmek ve 37 ° C'de 1 h için 250 rpm'de sallamak
    7. Yaklaşık 200 µL dönüştürme 100 µg/mL Ampisilin içeren LB plakalar üzerine yerleştirin. PEMI91 dışında bir plazmid kullanarak, uygun antibiyotik o plazmid için kullanın. Plaka gecede bir kuluçka 37 ° C'de yer. Ertesi gün, İnkübatör, tabaktan Kaldır parafilm ile sarın ve mağaza 1 ay kadar buzdolabında.
  3. Protein ifadesi.
    1. LB suyu orta gece büyüme için 37 ° C'de bir 50 mL tüp 100 µg/mL Ampisilin ile 15 mL steril pipet bahşiş plaka üzerinde bakteriyel bir koloni dokunmaktan ve yukarı ve aşağı içinde LB pipetting tarafından aşılamak.
    2. 15 mL kültür LB suyu orta 100 µg/mL Ampisilin ile 1 L içine transfer ve 4-12 h 37 ° C'de için sallamak (kadar OD600 > 0,8).
    3. Plazmid hazırlık için kültürünün 10 mL toplamak.
    4. 0,2-1 mM izopropil-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) ekleyin ve daha düşük sıcaklık oda sıcaklığına gecede ifade için.
    5. Dört tüpler içine bölme ve 4.000 × g 40 min için de centrifuging tarafından ertesi gün hücre hasat ve birkaç saat için Pelet-80 ° C'de dondurmak.
    6. Protein12 eklenen kaset için karşılık gelen astar ile sıralama için hücreleri elde plazmid göndermek ve eklenen DNA kalitesini doğrulayın.
  4. Protein saflaştırma.
    1. Oda sıcaklığında 30 dakika donmuş hücrelerinin bir tüp çözülme.
    2. Çözdürülen hücrelerinde lizis arabellek (38 mL su, 2 mL gliserol, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 10 µg/mL Dnaz, 1 mM PMSF, 1 mM TCEP, 500 µg/mL lizozim) askıya alma ve 1 h için buz sallamak.
    3. Birkaç saat lysed hücre-80 ° C'de dondurmak ve oda sıcaklığında yeniden çözülme.
    4. Lysate aşağı 13,100 × g 4 ° C'de 30 dk için de spin
    5. Süpernatant üzerinden yerçekimi akışı sütun belirli etiketi (Örneğin, Strep-etiket veya etiket onun) için çalıştırın.
    6. Strep etiketi veya O'nun etiketi ve mağaza kullanmadan önce 4 ° C'de uygun arabellek kullanarak bir santrifüj filtresini kullanan bir arabellek alışverişi gerçekleştirin.

2. slayt hazırlama için numune hazırlama

  1. Piranha çözüm kullanarak cam slaytlar hazırlayın.
    1. Yer 10-30 adet cam kapak paket fişi (7,5 mm yarıçapında) 40 mL cam kabı yuvarlak.
      Not: Bir mahallede bu adım ve aşağıdaki adımları gerçekleştirin. Bu adımı sırasında tehlikeli kimyasallar ile başa çıkmak için standart yordamları izleyin.
    2. 30 mL (18,4 M) sülfürik asit ekleyin.
    3. 10 mL % 30 hidrojen peroksit ekleyin.
    4. Isı karışımı 10-30 dakika ile 95 ° c
    5. Dikkatle Piranha çözüm (yeniden atılır veya) için ayrı bir atık konteyner içine dikkatle boşaltmak.
    6. Slaytlar Piranha çözümü kaldırmak için deiyonize suyla durulayın.
    7. Slaytları 40 mL aseton askıya alma.
    8. Aseton atık konteyner içine dikkatle boşaltmak ve slaytlar 40 mL etanol yeniden askıya alma.
    9. Dikkatli bir slayt teker teker ayıklamak ve argon veya saflaştırılmış hava kuru temiz forseps kullanın.
    10. Yer temiz ve kuru slaytlar altın buharlaşma kadar vakum altında veya argon uzun süreli depolama için altında.
  2. Altın kaplamalı slaytlar (isteğe bağlı) hazırlayın.
    Not: Bu adım büyük üniversitelerde çok temiz Oda imkanları mevcuttur bir vakum (e-beam) Evaporatör kullanımını gerektirir.
    1. Beş mikroskop slaytlar (25 x 75 mm dikdörtgen şeklinde) bir glasscutter kullanarak yarıya.
    2. Çift taraflı yapışkan bant her 10 Orta geçerli yarım mikroskop slaytlar.
    3. Yapışkan Not yapışkan tarafı kesme ve yapışkan notu yukarı doğru tarafı için çift taraflı bant uygulamak. Yapışkan notu genel olarak daha az yapışkan, ama hala sıkıca slaytlara gelecekteki kırma önlemek için ekler. O zaman bu yarım mikroskop slaytları artık cam slaytlar sahibi olarak çalışabilirsiniz.
    4. Dikkatle dört temiz cam slaytlara (2.1.10 bölümünden) sahibinin yapışkan tarafı her köşesinde tuşuna basın.
    5. Cam slaytlar bir e-beam Evaporatör hareket. 70 uygulamak için Evaporatör özellikleri izleyin krom ve 300 nm nm altın yüzeye.
    6. Altın kaplı slaytları argon altında depolama.

3. numune hazırlama

  1. Slayt hazırlamak.
    1. Bir temiz demir disk (15 mm çap) seçin ve bir yapışkanlı etiket ekleyebilir.
    2. Yapışkanlı etiket kapak parça çıkarmak.
    3. (2.1.10 bölümünden) temiz cam veya altın (2.2.7 bölümünden) bir parça seçin ve sıkıca demir disk yapışkan tarafı yerleştirin, bu örnek slayt olacaktır.
  2. Protein bir slayda Kasası.
    1. Deney (25 mM Tris-HCl, pH 7,6 ile 150 mM NaCl) için arabellek içine polyprotein diyaliz 0.5 mL santrifüj filtresi gibi bir arabellek Satım sütun kullanarak. Sütun 10 dk 13000 RPM için protein spin ve sütun ters ve iplik için 2 dk 1000 devirde tarafından yeni bir arabelleğe protein elute.
    2. 280 Absorbans ölçerek yaklaşık protein konsantrasyonu belirlemek nm, bir Spektrofotometre kullanarak.
    3. 10-100 µg/ml 100 µL son bir hacim içinde protein sulandırmak.
    4. Protein çözüm merkezi slaydın üzerine 60 µL uygulanır. Bu aşamada bu yapışkan şişmesi deney ve kontrolsüz örnek hareketleri sırasında neden olabilir gibi altında cam ve demir slayt boşluğu girin herhangi bir sıvı bırakmamaya dikkat edin.
      Not: Altın slaytlar hidrofobik ve iken cam slaytlar daha hidrofilik ve protein çözüm yayılabilir küresel bir damlacık oluşturacak.
    5. Oda sıcaklığında 10-60 dakika için oturup örnek ver. Bu süre boyunca, Atomik kuvvet mikroskobu ayarlamadan sonraki adıma geçin.

4. Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) Kurulum

Not: AFM ayarlamak için genel bir açıklama aşağıdadır ve bazı belirli ayrıntıları belirli araçları kullanılan bağlı olarak farklı olabilir. Kullanılan araçları kısmen ev yapımı ve Scholl13' te ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

  1. Konsol bir AFM hücre üzerine monte.
    1. Konsol uygulama için uygun özelliklere sahip seçin. Kullanım cantilevers bahar sabitleriyle 4-10 pN/nm düşük unfolding kuvvetleri için (~ 10-50 pN), kullanım bahar sabitleriyle 15-100 pN/nm yüksek unfolding kuvvetleri için cantilevers süre.
    2. Dikkatle sonundan itibaren konsol almak ve hücre tutarak soruşturma yerleştirin.
    3. Hücre sıkıca devam etmeden önce yerde konsol tutar emin olun.
    4. AFM başından lazer hizalama için hücreye yerleştirin.
  2. AFM başından lazer hizalayın.
    1. Başından ters bir mikroskop üzerine yerleştirin ve bir pil AFM kafasına kafasına lazer güç bağlayın.
    2. Bir kamera lazer ışık bir TV veya monitör görselleştirildiği belgili tanımlık mikroskop bulmak için ekleyin.
    3. Konsol ucu bulunduğu lazer konumlandırın
  3. Kafa örnek ile bağlayın.
    1. 10 µL arabelleği her hücre tutarak soruşturma bağlantı noktaları içine sifonu çek.
    2. Kuluçka örnek slayt al ve sıvı inkübe çözümden 40 µL dikkatle boşaltmak. Arabellek 40 µL slaytta ekleyin. Örnek slayt piezo yukarıda mıknatıs üzerine yerleştirin.
    3. AFM sahne yükseltilmiş konumda olduğundan emin olun. Böylece AFM prensibine göre örnek damlacık sonra AFM kafası Sahne Alanı'na yer.
  4. Merkezi fotodiyot üzerine yansıyan lazer ışını.
    1. Küçük bir parça kağıda keser ve AFM fotodiyot önüne yerleştirir.
    2. AFM lazer lazer nokta kağıt üzerinde odaklanmış ve parlak olur, böylece düğmeleri kullanarak yeniden konumlandırın.
    3. Lazer her tarafta (A + B + C + D) toplam sinyalin en üst düzeye çıkarmak için fotodiyot vurur ve üstten iki arasındaki fark sinyal neden olur ve sıfır (A + B-C-D) olarak iki kadranın alt AFM baş ayna ayarlayın.

5. Atomik kuvvet mikroskobu kalibrasyon

  1. Güç spektrumu ölçmek.
    1. AFM için bağlı filtresinde tam bant genişliği için AFM baş sinyal için filtre ayarı açın.
    2. AFM kendisi üzerinde bu sinyal-gürültü ekler gibi piezo kapalı olduğundan emin olun.
    3. AFM yazılım14 ücret hesaplama 1.024 veri noktalarından güç spektrumun 512 hesaplamalar ortalamasını ölçmek için kullanın.
    4. AFM yazılım15 titreşim konsol için ana mod için karşılık gelen ilk zirve boyunca güç spektral yoğunluğu tümleştirmek için kullanın.
  2. Fotodiyot duyarlılık hesaplayın.
    1. AFM kendisi, piezo denetleyicisi açmak ve 500 Hz (alçak geçiren Filtre) için filtre ayarı değiştirmek.
    2. Sıfır AFM yazılım etrafında dalgalanıyor fark sinyal izlemek. Hızla AFM baş birkaç yüz mikrometre micropositioners kullanarak hareket ettirin. Baş aşağı hareket tekrarlayın ve tutarlı atlar için fark sinyal izlemek. Yüzey çok ne zaman sinyal atlar start yüksekliği artan.
    3. En kısa zamanda yüzeyi ile temas üzerine saptırma sinyal doyurur, yüzey uzak baş hafifçe hareket ettirin.
    4. AFM yazılım, 100-5000 nm aşağı ve yukarı hareket ettirerek yüzeyin, bulmak için piezo voltaj düzenleyen giriş denetimleri kullanın. Yüzey hala ulaşmak değilse, el ile baş ve örnek arasındaki uzaklığı azaltmak devam edin.
    5. AFM yazılım tarama boyutu yaklaşık 500 ile çekerek bir deneme yapmak nm ucu yaklaşık 100 için temas halinde gelir böylece nm piezo seyahat.
    6. Nerede AFM ipucu substrat yüzeyi ile temas halinde kalır doğrusal bölge fotodiyot sinyal karşı piezo deplasman eğrinin eğimini ölçmek.
    7. Bahar sabit ve duyarlılık eğimi ve entegre güç spektrumu kullanarak hesaplamak (Equation 1).

6. veri toplama

  1. Hazırlık.
    1. AFM için bağlı, alçak-geçiren kesim için bir üst sınır sağlayacak en az iki kez bant genişliği (Nyquist kriteri), örnekleme frekans olduğunu sağlamak için filtre ayarı ayarlamak.
  2. Ölçümleri.
    1. Toplam teorik boyutu unfolding polyprotein (amino asitler × 0.365 sayısı) artı yaklaşık % 40 substrat karşı acil için izin vermek için tarama boyutu ayarlayın. Örneğin, bir 9 x I91 yapı çekerek yaklaşık 300 teorik gelişeceğini uzunluğu olacaktır yüzden tarama boyutu yaklaşık 420 nm, nm.
    2. Böylece yüzey uzak tarama boyutunu % 80'i AFM yazılım prensibine göre konumlandırın (Bu durumda, hakkında 340 nm yüzey uzak).
    3. AFM yazılım, başlangıçta 300 nm/s için tarama hızını ayarlar.
      Not: Bu hızı daha yavaş ya da hızlı, uygulamaya bağlı olarak değiştirilebilir.
    4. Bir çekme deneyi gerçekleştirmek ve piezo ve fotodiyot sinyal elde edilen konumunu ölçün. AFM yazılım tarama başlatmak için kullanın.
    5. AFM yazılım, yaklaşık 10.000 kayıtları olana ölçümleri gerçekleştirmek devam edin.
      Not: Genellikle, pikap bir pozitif kontrol molekül %0,516, yani 10.000 analiz için yeterli veri toplamak gerekli oranıdır.

7. veri analizi

  1. Verileri normalleştirmek.
    1. Her kayıt için uzantısını uzantısı kullanarak hesaplamak = çıkarma - F/kc (kc olduğunu 5.2.7'den).
    2. Hiçbir kuvvet doruklarına mevcut nerede başlangıcını veya sonunu kuvvet-uzantısı izleme ortalamasını alarak temel kuvvet düzeyi belirlemek ve nerede konsol yüzeyine karşı baskı yapıyor değil. Tüm kuvvet-uzantısı eğrisi sonra bu ortalama değeri tarafından kaymış.
    3. Uzantının sıfır y ekseni hizalanır verileri çevirmek. Bunun nedeni molekül uzantısı bir izleme başında sıfır olarak ayarlanmalıdır.
  2. Protein ilgi belirlenmesi.
    1. Bir tek molekül parmak izi sağlamak en az dört I91 olaylar ile kayıtları belirleyin. Bu kayıtlar doğru "tek molekül ölçülerini" yakalama.
    2. Daha fazla çözümleme için izotopu tek molekül olaylar olayları kaydedin.
  3. Kontur uzunluğu artışı belirlemek.
    1. Her kayıt için unfolding olay, solucan benzeri zincir modeline uygun Equation 2 nerede Equation 3 oda sıcaklığında p sebat uzunluğu (tipik olarak 0.4-1 nm) ise, x nanometre uzantısında ise L kontur uzunluğu nanometre.
      Not: Solucan benzeri zincir şeklinde bir enterpolasyonlu kesin çözümdür, Bouchiat vd. daha kesin bir sayısal çözüm bulundu 17. alternatif uygun modelleri-ebilmek bulunmak içinde Su vd. 18.
    2. L tespit için iki ardışık unfolding olayları ve bu fark icat için değerleri arasındaki farkı hesaplama "kontur uzunluğu artışı".
  4. Rüptürü kuvveti belirlemek.
    1. Belirli bir unfolding olay için rüptürü kuvveti unfolding tonundaki en büyük damla önce en yüksek noktası alarak hesaplar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokolden temsilcisi sonuçları Şekil 2' de gösterilmiştir. Her iki panelleri temsilcisi kuvvet-uzantısı eğrileri proteinler üzerinden göster. Alt protein--ilgi çekici bir, NI10C molekül kanat I91 protein gösterirken üst I91 polyprotein sonuçlarını gösterir. Bu kayıtlar I91 karakteristik gücünü göstermek (200 pN) ve kontur uzunluğu artışı (28 nm) hangi gösterir hizalama ve AFM kalibrasyonu başarılı oldu. Bu kuvvet-uzantısı eğrileri sonra kuvvet bağımsız molekül belirlemek ve gelişeceğini artıkları sayısını belirlemek için yardımcı solucan benzeri zincirleri tarafından (kesik çizgi) analiz edilebilir. Analiz sonra kontur uzunluğu artışlarla (sonraki kontur-uzunlukları arasındaki fark) ve açılım gücü oranı unfolding ve yolu19unfolding protein istikrar belirlemek için kullanılabilir.

Figure 1
Şekil 1: plazmid Haritası polyprotein. Bu polyprotein plazmid harita sıralama ve fiziksel DNA Addgene depo (www.addgene.org/74888) kullanılabilir. Nerede bir polyprotein olan bir protein (kırmızı) ilgi kanattan 8 aynı tekrarlar I91 protein (gri kutu) oluşan AFM için prototip polyprotein tasarım gösterir. Her modül özelleştirme sağlayan bir benzersiz kısıtlama sitesi içeriyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: temsilcisi SMFS sonuçlanır. A. temsilcisi kuvvet-uzantısı eğrisi poly I91 protein için. Demek kontur uzunluğu artışı tepeler arasında ~ 28 nm ve kuvvetler unfolding olan 100-200 pN arasında. B. temsilcisi kuvvet-uzantısı eğrisi (I91)3-NI10C-(I91)3 protein için. Demek ankyrin tekrar için kontur uzunluğu artışı ~10.5 nm ve 8-25 pN arasında unfolding güçler vardır. Ankyrin tekrarlar için düzenli testere-diş deseni I91 unfolding doruklarına tarafından takip edilir. Çekerek hız her ikisi için de (A) ve (B) 0,02 nm/Bayan olan Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokol kritik bir adımda "parmak izi tek molekül olaylar için" olumlu bir denetim olarak hizmet veren 1.1.2, adımda anlatılan bir polyprotein kullanımıdır. Genel olarak, orada polyprotein proteinler olayların unfolding gerekir (I91 için bu yaklaşık 28 yaklaşık 200 pN ve kontur uzunluğu artışı bir açılım güç anlamına gelir nm) belirsizliğe yer bırakmadan faiz protein gelişeceğini olmuştur sonuçlandırmak için. Örneğin, ne zaman faiz protein her iki taraftan üç I91 etki alanı tarafından çevrili olduğunu, sonra olmalı olumlu bir tek molekül olay olduğu sonucuna için en az dört I91 olaylar. Bir polyprotein veya diğer yollarla olumlu denetim değilse, herhangi bir veri yanlış yorumlanmasına yol sorumludur.

Plazmid klonlama stratejisi gen ve plazmid ilgi bağlıdır. Biz hangi-ebilmek var kullanılmış bir polyprotein plazmid bu protokolü12ile birlikte mevcut yaptık. 20,21klonlama basit için benzersiz kısıtlama siteleri içerir bu adım plazmid bulunmaktadır. Bu Plasmid'ler sadece kolayca plazmid faiz protein clone için kısıtlama siteleri benzersiz bir kümesi gerektirir. Ayrıca bu plazmid kolayca dökülüyor proteinler faiz protein eklerken değiştirme avantajı Gibson derleme22 kullanarak sıfırdan oluşturmak kullanılabilir yöntemleri vardır. Ayrıca Plasmid'ler ile verimli bir şekilde sıra için basit bir yol sağlar sadakat21sağlamada yardımcı ilgi tüm protein karıştırılan kodon etki alanlarıyla modüler polyproteins vardır.

Altın veya cam seçimi protein belirli ek kullanılabilir olup olmadığı bağlıdır. Altın yüzeylerde polyprotein ve yüzeyi arasında Au-Cys bağlar kurma izin. Bir Cys polyprotein sonuna eklenir eğer, o zaman bu özellikle protein yüzeye eklemek için bir yol olarak hizmet edebilir. Cam yüzeylerde de altın için absorbe değil ve ayrıca oluşturmak basit bazı proteinler için yararlı olan kendileri tarafından kullanılabilir. Cam slaytlar, belirli ek özellikle-den yapılmış polyproteins23ile kullanarak bir habercisi olarak da kullanılabilir. Mika yüzeylerde de, bu olumsuz ücret yüzeye bağlayabilirsiniz belirli ücret siteleri var bazı proteinler için yararlı olabilir kullanılabilir.

AFM spektroskopisi proteinler üzerinde birkaç önemli sınırlamaları vardır. Protein bir polyprotein spliced numune hazırlama başarısız olabilir. Ölçülebilir kontur uzunluğu artışlarla üretmek için çok küçük veya çok zayıf kuvvet direnmeye proteinler de AFM tarafından çözülmesi mümkün olmayacaktır. Son gelişmeler için daha iyi çözümler sunarak gelişmiş araçları24yapmış, ancak AFM deneyler de tipik çözüm sadece Kuvvetleri gibi 10-15 pN AFM cantilevers, tipik RMS gürültü nedeniyle düşük çözme sağlar. Hızı sabit hız deneyler için de yaklaşık 4 nm/s25için sınırlıdır ve en iyi çözünürlük elde genellikle Birleşik 10 µs24kısa algılayabilir. Proteinler daha az ise mekanik olarak istikrarlı, onlar daha iyi bir düşük güç aralığı ve genellikle daha yüksek bir zamansal çözünürlük olan optik cımbız kullanarak karakterizedir. Hala mevcuttur iyileştirmeler gelecekte AFM için FRET26AFM protein pozisyonlar27 ve özel olarak tasarlanmış cantilevers28ile artan çözünürlük belirlemek için Imaging kullanarak, birleştirme gibi.

Açılım oranı ve geçiş devlet mesafe bir tek molekül düzeyinde29gibi Kinetik parametrelerin ayıklama verdiğinden AFM varolan yöntemleri ile ilgili olarak önemli tekniktir. Diğer geleneksel biyokimyasal yöntemlerle (NMR, kimyasal denatürasyon, durdu-akış floresan) de Kinetik parametreleri ile ilgili bilgi edinebilirsiniz, bu yöntemler sonuçlarını bir protein topluluğu ve tek bir molekül fonksiyonları vardır. Bu durumlarda önemli bir fark olduğu yerlerde farklı ve farklı topluluklar tek bir protein. AFM onları birlikte30ortalama yerine altgrupları, ayırt edebilmek için göstermiştir.

Protein molekülleri SMFS denemeyi ayrıntılı açıklaması hala deneyim ile çözülebilir olası sorunları tahmin. Aşağıda biz sık karşılaşılan sorunları tartışmak ve sabit hız deneyler için bir AFM faaliyet ile ilgili sorun giderme.

Kuvvet Sinusoidal şeklindeki temel. Sinüsoidal şekli temel hesaplamak zordur bu yana doğru kuvvet en yüksek değeri belirlemek için zararlı olduğunu. Sorun konsol yansıyan lazer müdahalesi nedeniyle oluşur. Yeni pozisyon hala fotodiyot iyi toplamı sinyalini tutar olarak bu sorunu hafifletmek için konsol lazer oracıkta konumunu biraz kaydırılır. Sorun hala devam ederse, konsol hücre tutarak soruşturma yeniden konumlandırma göz önünde bulundurun.

Fotodiyot sinyal değil emdirmek tek adımlı içinde ne zaman yüzeye ilk kez dokunmayı. Doymuş değere ulaşıncaya kadar yüzeylere, fotodiyot sinyal birkaç adımda atlar. Bu ucu en alçak noktası AFM baş ve sonda yonga üzerinde başka bir yerde konsol ucu önce örnek yüzeye dokunun değil anlamına gelir. Bu sorun SMFS ölçümler devam etmek ve doğru kuvvet-uzantısı eğrisi almak için düzeltilmesi gerekiyor. Sorunu gidermek için konsol bulunduğu hücre ileri geri tutarak soruşturma taşımayı deneyin ve hangi yerde konsol mezununda kanca gerginlik ayarlayın. Bu yardımcı olmazsa, aynı yonga üzerinde farklı bir konsol geçmeyi deneyin veya yeni bir konsol çip bile değiştirebilirsiniz.

Geri çekilmesi üzerine birçok olay veya hiç olay yok. Bu deney için doğru protein konsantrasyonu bulma ile ilgili. Eğer her zaman tek bir büyük kuvvet en yüksek (> 500 pN) germe izleme üzerinde görünmesini ve diğer doruklarına altın kaplı yüzey üzerinde deneyler sırasında görüntülenir, konsol aslında altın-altın etkileşim örnek molekülleri beri üzerinde ölçmek yüzey çok seyrek. Bu durumda, altın yüzeyinde biriken protein örnek konsantrasyonu artırılmalıdır. Ancak, birden çok düzensiz şekilli doruklarına çekerek her döngüsü germe her izleme üzerinde görünen iseniz, çok fazla molekülleri bir katman veya karmaşık bir ağ yüzeyde oluşan yüzeyine emilir gösterir. Bu durumda, örnek aşırı protein molekülleri kaldırmak için kullanılan arabellek tarafından yıkanması gerekiyor. Bazen düşük yoğunluklu bir protein ile yeni bir örnek hazırlanıyor bu sorunu kurtulmak gereklidir. Yeni örnek de sorunu çözemiyorsanız, buzlu Anüler groove herhangi bir sıvı içine nüfuz görmek için hücre tutan AFM üzerinde kontrol edin. Oluk oluk içinde herhangi bir sıvı örnek titreşim hücre içine çift ve konsol ve yüzey temasta olduğunda normal olmayan bir şekilde değiştirmek fotodiyot sinyal neden beri deneme sırasında kuru kalması gerek.

Sahte modülasyon rampaları arasında fotodiyot sinyalinin. Bu konsol ileri geri, genellikle sıvı kanallardan transit küçük bir kabarcık kaynaklanır itmek akışının göstergesidir. Bu tür bir sorun ölçümleri ile büyük sinyal artar veya azalır bozabilir olacaktır. Bu sorunu çözmek için böylece konsol çevresinde sıvı artık substrat çevresinde sıvı dokunur substrat, başından kaldırın. O zaman onları geri getirmek ve baş geri yüzey aşağı taşıyın. Reformasyon AFM hücre içindeki sıvı sütunun genellikle yeterli değil Eğer, ama sıvı kanallardan kabarcık bozmaya gerekli olduğunu tekrarlıyor.

Sistematik artmak ya da azalmak fotodiyot sinyalinde. Sürüklenen nerede cantilevers ve belgili tanımlık uç her zaman çok hızlı örnek yüzeyinde sıvı damla dokunmadan üzerine sürüklenir her deney boyunca mevcut bir olgudur. Drift sıcaklık denge, neden olan sıcaklık kaynaklı genişleme veya konsol daralma sinyali titreşim neden olabilir. İlk deney sürüklenen hızı önemli ölçüde azalacak önce daha--dan 10 dakikadır bekliyor. Ne zaman bir hızlı sürüklenen hızına karşılık gelen ve ulaşmak için ek saat gerektirir çekerek döngüsü iki yarısı arasında bir histeresis sonra germe ve rahatlatıcı izleme birbirleri ile örtüşüp Eğer çekerek, deneyler denge. Kuvvet taban çizgisi yukarı doğru küçük bir açı ile tilts Eğer sürüklenen hızı çekerek daha hızlı ve ucu daha az titreşim için beklemek için deney askıya almak iyidir.

Kuvvet-uzantısı eğrisi ilk bölge dikey değil. Sonra yeni kalibre edilmiş kurulumundan alınan kayıtları kuvvet-uzantısı arsa bakmak yararlıdır. Konsol yüzeyine karşı bastığında bu kayıtlar dikey bölge gösterme, sonra kalibrasyon bir sorun olabilir ve adım 5yinelenmelidir.

Fotodiyot sinyal kaybolur bir süre sonra. Bu sıvı hücre arabellekte buharlaşma nedeniyle olabilir. Suyla temasa uygulayarak hücre daha arabellek her saat ya da çok, kurumasını ve yapımı örnek tutmak için kullanılamaz için daha fazla deneyler önemlidir.

İç gürültü yüksek (> 30 pN). Gürültü (kalibre edilmiş fotodiyot dalgalanmaları RMS ölçülür) büyük miktarda dış gürültü göstergesidir. AFM deneyler kaplin binaya azaltmak için bir hava tablo yapılmalıdır, ama dış gürültü de güvensiz sahne, yakındaki veya yakındaki statik nesnelere (Örneğin, bir sandalye) hava tablonun rekorlu işitsel gürültü neden olabilir. Gürültü Ayrıca AFM (Örneğin, elektronik sistem kararsız bağlantı) elektronik kontrol sistemi üzerinden gelebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser Ulusal Bilim Vakfı Hibe MCB-1244297 ve MCB-1517245 PEM için tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM Specimen Discs, 15mm diameter Ted Pella, Inc. 16218 Serve as base for glass substrate
Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick Ted Pella, Inc. 26024 serve as glass substrate and base for gold coating
Adhesive Tabs Ted Pella, Inc. 16079 Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips
STD Multimode head assembly Bruker Nano Inc. 1B75C AFM head
Glass probe holder Bruker Nano Inc. MTFML-V2 Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  
Microlever AFM probes Bruker Nano Inc. MLCT Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes
AFM probes with Au coated tips Bruker Nano Inc. OBL-10 Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force
Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs National Instruments PCI-6259 Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators
LISA Linear Piezo Stage Actuators Physik Instrumente LP P-753.11C Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements
XY Piezo Stage Physik Instrumente LP P-541.2CD Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. The study of protein mechanics with the atomic force microscope. Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).
  3. Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM). Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).
  4. Rico, F., Chu, C., Moy, V. T. Methods in Molecular Biology. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. 331-353 (2011).
  5. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).
  6. Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
  7. Kim, M., et al. Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials. Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).
  8. Gonzalez, M. A., et al. Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins. Advanced Materials. , (2017).
  9. Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).
  10. Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes. Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).
  11. Davis, L. Basic methods in molecular biology. , Elsevier. (2012).
  12. Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. , (2016).
  13. Scholl, Z. N. The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , Duke University. (2016).
  14. Pawlak, K., Strzelecki, J. Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments. Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).
  15. Nanopuller. , https://sourceforge.net/projects/nanopuller/ (2018).
  16. Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions. Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).
  17. Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).
  18. Su, T., Purohit, P. K. Mechanics of forced unfolding of proteins. Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).
  19. Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy. Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).
  20. Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).
  21. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of β-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).
  22. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
  23. Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level. Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).
  24. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  25. Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations. Science. 342 (6159), 741-743 (2013).
  26. He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy. ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).
  27. Fotiadis, D., Scheuring, S., Müller, S. A., Engel, A., Müller, D. J. Imaging and manipulation of biological structures with the AFM. Micron. 33 (4), 385-397 (2002).
  28. Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
  29. Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins. Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).
  30. Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a βγ-Crystallin Protein. Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).

Tags

Biyokimya sayı: 144 Atomik kuvvet mikroskobu polyprotein protein katlama tek-molekül kuvvet spektroskopisi protein saflaştırma
Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E.,… More

Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. J. Vis. Exp. (144), e55989, doi:10.3791/55989 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter