Summary
Burada gerçek zamanlı, non-invaziv, kollarındaki Pseudomonas aeruginosabiyofilm yara enfeksiyonları izleme için tüysüz fareler kullanan bir roman diyabetik fare modeli açıklar. Bu yöntem diğer bakteri ve genetiği değiştirilmiş mikroorganizmalar, çoklu türler biyofilmler, dahil olmak üzere enfeksiyon değerlendirmek ve antibiofilm stratejileri etkinliğini test etmek için adapte edilebilir.
Abstract
Bakteri varlığı olarak yapılandırılmış biyofilmler özellikle diyabetik hastalarda kronik yaralarda yara iyileşmesi ve çözünürlük önlemek düşünülmektedir. Kronik fare yaralar modelleri mikroorganizmalar ile ana bilgisayar arasındaki temel etkileşimleri anlamak için kullanılmaktadır. Bugüne kadar geliştirilen modelleri tüylü hayvanlar kullanımı ve uygun bakteri tespiti için yara dokusunun terminal koleksiyonu güveniyor. Bu modellerde önemli anlayış kazanmıştır, bu deneysel bir işlem çok sayıda hayvan gerektirir ve örnekleme zaman alıcıdır. Kronik yaralarda biyofilm ilerlemeyi değerlendirmek için birçok en iyi yenilik içermektedir roman bir fare modeli geliştirdik: bir) tüysüz fareler, epilasyon; ihtiyacını ortadan kaldırarak kullanır b) önceden biçimlendirilmiş biyofilmler sunan sebat hemen değerlendirilmesi ve bu toplulukların ana bilgisayar üzerindeki etkisini yaralar için geçerlidir; c) biyofilm ilerleme Pseudomonas aeruginosaböylece hayvan çalışma gerekli sayısını azaltarak enfeksiyon gerçek zamanlı izleme sağlayan, bir genetik kollarındaki suşu tarafından ışık üretim miktarının tarafından izler. Bu modelde, tek bir tam-derinlik yara STZ-indüklenen diyabetik tüysüz fareler arkasında üretilen ve P. aeruginosa kollarındaki yük Xen 41 biyofilmler ile aşılanmış. Yaraları hafif çıktı günlük görüntüleme sistemi, in vivo ve in situ hızlı biyofilm görselleştirme ve yerelleştirme biyofilm bakteri içinde yaralar için izin bir vivo kaydedilir. Diğer mikroorganizmaların genetik türler ve çoklu türler biyofilmler, dahil olmak üzere, çalışma için kullanılan ve test anti-biyofilm stratejileri antimikrobiyal tıkayıcı sosları da dahil olmak üzere özel değeri olabilir roman bu yöntem esnektir.
Introduction
Biyofilmler kronik yaralar1zavallı çözümlenmesi için bir faktör olarak vurgulanmış polimer maddelerin bir matris gömülü mikroorganizmaların karmaşık toplulukları bulunmaktadır. Bu son derece organize, kalıcı mikrobiyal nüfus özellikle bacaklarda ve değiştirilmiş çevresel duyusal mekanizmalar zayıf kan dolaşımı undetected lezyonlar2' ye nereye Diyabetik hastalar için önemli bir çalışmadır. Amerika Birleşik Devletleri'nde bu diyabetik hastaların % 15 hayatları boyunca en az bir ülser gelişecektir tahmin edilmektedir. Bu tedavi3,4, 28 milyar dolar civarında bir ekonomik harcama immensurable duygusal ve sosyal yükünü saymıyorum çevirir. Mikrobiyal topluluklar yara yatak ve şifa olaylarda bu biyofilmler etkisi kalıcı olması izin faktörleri anlamak daha iyi bakımı etkilenen hastalar için sürücü ve yeni tedavi yaklaşımları gelişimi itmek için zorunludur. Bu nedenle, bakteriyel konak etkileşimleri keşfetmek için tekrarlanabilir ve çevrilebilir vivo içinde modeller kurulması her şeyden önemlidir.
Fare modelleri başarıyla biyofilmler kronik yaralarda etkisini incelemek için geliştirilmiştir. Bu modeller ancak, sık sık saçlı tür kullanmak ve bakteriyel hücrelerin onları zaman alıcı ve pahalı hale kurban hayvanlardan çıkarılan doku için plaka sayar tarafından biyofilm izni değerlendirmek.
Bitiş noktası örnekleme enfeksiyon değerlendirilmesinde hayvanların bir biophotonic alternatif ilk Contag ve arktarafından önerilmiş. (1995) 5 , kim ışıldama antibiyotik tedavisi etkinliği ölçmek için yapısal kollarındaki Salmonella typhimurium sayfasından yakalamak için bir yöntem geliştirdi. Bioluminescence verilirken bakteri yararlanarak diğer çalışmalar izledi. Örneğin, Rochetta ve ark. (2001) 6 doğrulanmış yoğun bir şarj kuplajlı cihaz kullanarak ışıldama ölçerek Escherichia coli uyluk enfeksiyonlar farelerde çalışmaya bir enfeksiyon modeli ve daha sonra Kadurugamuwa ve ark. (2003) 7 farelerde bir kateter yara modelinde çeşitli antibiyotiklerin etkinliğini araştırmak için Staphylococcus aureus mühendislik bir tür özelliklerini yayan foton kullandı.
Burada karakterize yöntemini diyabet tüysüz farelerde ikna etmek, üretmek ve P. aeruginosa, önceden biçimlendirilmiş kollarındaki biyofilmler yaralarıyla aşılamak ve biophotonic enfeksiyon kontrolü yapmak için basit bir protokol sunar görüntüleme sistemi bir vivo içinde kullanma. O teklif etmek yolu tarif etmek, hızlı, in situ, biyofilmler kronik yaralarda değerlendirmek için non-invaziv ve nicel süreç ve yara iyileşme mikroskobik görüntüleme gibi aralıklı kan toplama için buna ek olarak, ek analiz için sağlar sitokin ölçümleri ve Histoloji terminal dokusu toplamalarında.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Michigan State University tarafından onaylanmış.
1. hazırlık tıkayıcı sosları ve silikon çubukları
- şeffaf tıkayıcı soyunma kesmek yapmak için yaklaşık 1 cm x 1 cm makasla kareler.
- Kes 10 mm daire bir 10 mm biyopsi yumruk. 5 mm biyopsi Merkezi'yle 0,5 mm kalın silikon sayfadaki yumruk 10 mm çemberin ortasında ve sıkıca forma bir delik oluşturmak için basın bir " poğaça "-alçıya kullanılacak disk gibi.
2. deneysel hayvan
- kullanımı (22-26 g) 8 hafta eski erkek SKH-1 fare--dan bir ticari doğurmak. Fareler yiyecek ve su için 21 ° C ve 12 h koyu döngüsü ücretsiz erişim ile standart koşullar unutmayın.
- Diyabet ikna etmek için fare intraperitonially bir 13 mg/ml streptozotocin (STZ) solutionand % 25 ile enjekte glikoz (başına 250 µl / fare) üzerinde 5 gün üst üste.
- Tarafından 100 mm sitrik asit, pH 4.5 5 µL 65 µg sulandrarak STZ, STZ çözüm olun.
- Her fare fare vücut ağırlığı 1 kg başına 65 mg STZ son bir kitle için enjekte ses düzeyini ayarlamak. Denetim fare 100 mM sitrik asit çözüm pH 4.5 ile aynı günlerde enjekte.
- Kan şekeri Şeker Ölçüm ile 14 gün sonra son STZ enjeksiyon izleyerek hiperglisemi onaylayın. Diyabetik farelerin polyuria olabilir ve bu yüzden onların yatak ıslaklık ortadan kaldırmak için daha sık değiştirilmesi gerekebilir ve onların ağırlık haftada 3 kez izlenmelidir.
3. Biyofilmler
- biyofilm hazırlık
- yara aşılamak için Grow koloni biyofilmler 8. İki gün önce ameliyat başlangıç kollarındaki bir gecede kültür P. aeruginosa Xen tryptic soya suyu (TSB) 41 37 ° C'de inkübe ve 200 devir / dakikada sallayarak ve UV maruz polikarbonat membran filtreleri 0.2 µm gözenek boyutu ile sterilize biyolojik Emanet başlıklı yan başına 15 dakika ışık.
- Bir gün ameliyat öncesi santrifüj kapasitesi 20.000 x g 2 min için de gecede kültür ve yıkama Dulbelcco ile 3 kez 1 mL ' s fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) tarafından yukarı ve aşağı pipetting.
- Seyreltik DPBS süspansiyon için bir Absorbans 0,05 600 nm.
- Pipet 10 µL seyreltilmiş kültür tryptic soya agar (TSA) tabağa dinlenme her membran üzerinde. Kurumaya bırakmak sonra taze TSA tabakaları bana her 24 h aktarma biyofilmler büyümeye 72 h için 35 ° C'de membranlar kuluçkaya
- Standart eğri
- deneme başlamadan önce bioluminescence ve bakteriyel sayar ilişkilendirmek için standart bir eğri olun.
- Biyofilmler 3,1 açıklandığı şekilde hazırlayın.
- Görsel olarak homojen bir çözüm üretilir kadar biyofilm DPBS ve vortexing ile karıştırarak 1/24 için ½ değişen biyofilmler seri dilutions olun. Pipet 200µL bir siyah 96-şey plaka ve resim görüntüleme sistemi içinde vivo ile seyreltilmiş çözüm.
- Plaka dilutions TSA levha üzerine yayıldı ve 35 ° c 24 h için kuluçkaya
- Birimleri (CFU) oluşturan colony tabakalarına kadar sayıp bioluminescence ve bakteriyel sayar ilişkilendirmek için standart bir eğri oluşturmak.
4. Ameliyat yarası
- 1 L/dak Debi genel anestezi (ketoasidoz ölüm önlemek için) % 95 oxygen/5% CO 2 ' isoflurane kullanarak teşvik ve % 1-3 isoflurane kullanarak anestezi korumak. Hayvanlar üzerinde ısı paspaslar ameliyat sırasında korumak.
- Fare derin pedal refleksleri cımbız ile ayak pinching tarafından bastırılır ve yüzükoyun sígara fareyi getirin olun.
- Ağrı yönetimi için alt Kutanöz enjeksiyon (30 μl) üzerinden Meloksikam (0.2 mg/kg) yönetmek.
- % 10 povidone-iyot üç kez arka ve bir isopropanol paneli deri silin.
- Dairesel model fare bir tarafta yara için anahat için bir steril 4 mm biyopsi yumruk kullanın ' s orta hat omuzlar düzeyinde. Desen ile kalıcı bir kalem anahat.
- Panniculus carnosus de dahil olmak üzere subkutan doku ile uzanan bir tam-kalınlık yara oluşturmak ve doku dairesel parça tüketim için anahat ve Iris makas ortasında deri kaldırmak için tırtıklı forseps kullanın.
- Tıbbi su geçirmez deri yapıştırıcı tutkal fareler kaplamasına uygulamak ve hafif basınç uygulayarak silikon tahta getirin. Şeffaf bir tıkayıcı soyunma yarayla kapsar. Ameliyattan sonra tek tek hayvanlar kafese.
5. Ameliyat sonrası yönetim
- Meloksikam (0.2 mg/kg) günde bir kez alt Kutanöz enjeksiyon yoluyla önümüzdeki 2 gün için ameliyat sonrası ağrı yönetmek.
- Monitör hayvanlar günlük ağrı ve kilo kaybı belirtileri için. Diyabetik hayvan lüzum insülin iğneleri ne zaman % 15 veya daha fazla vücut ağırlığının kaybettiler.
6. Biyofilm Inoculum hazırlanması ve enfeksiyon
- fareler 48 h ameliyattan sonra aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi aşılamak.
- Kazımak 72 h biyofilmler steril bir spatula kullanarak membranlar üzerinden bir microcentrifuge tüpü yerleştirin ve 1:2 DPBS'sulandırmak. Kısa bir süre yukarı ve aşağı pipetting tarafından Mix. Toplam CFU hesaplamak için TSA plakalar üzerine
- yayılan plaka inoculum. Sayıları doğru olduğundan emin olmak için bir dizi iki 1 dk vortexing adım adım bir 2 dk sonication 40 kHz ultrasonik bir süpürge ara biyofilm inoculum daha fazla kır.
- Yara ve silikon sabitleyecek ve başvuru için bir cetvel kullanarak ekli fotoğraf makinesi ile mikroskop yarayla bir test almak soyunma kaplama kaldırmak.
- 200 µL pipet ipuçları ipuçları kesmek ve biyofilm inoculum her yaranın üzerine 10 µL pipet.
- Görüntüleme sistemi otomatik ayarlarla vivo içinde kullanarak görüntü fare: Pozlama süresi 5-300 s, orta binning, 1 f/stop ve açık filtre ve görüş alanı C ile (12.9 cm x 12,9 cm).
- Kapak yara ile taze soyunma.
7. Yara ölçüm ve görüntüleme
- hayvanlar günlük 9 klinik belirtileri değerlendirmek.
- Yiyecek, su ve kafesleri gerektiği gibi değiştirin. Her gün pansuman
- onay bütünlüğünü. Soyunma olmadığı durumlarda, sadece bioluminescence yara tıkanıklığı nedeniyle ölçülebilir. Gün 8, sosları kaldırılır ve yara kapatma izin ölçüm yerine değil.
- Her gün hayvanlar tartmak.
- Tüm gün için fareler tek tek bir tecrit odasında yeri görüntü görüntüleme sistemi günlük veya arka plan seviyenin ışıldama değerleri düşmek kadar her gün içinde vivo kullanarak bir HEPA filtre ile donatılmıştır.
- Gün 8 sonra genel anestezi teşvik ve filmler bir mikroskop ile yara yara iyileşene kadar her gün başvuru için bir cetvel kullanarak ekli kamerayla çekebilir.
8. Histolojik analizi
- 2 l/min CO 2 bir ötenazi bir akışı ile fareler odası ışıldama arka plan düzeyin altına düşer ve yaralar tamamen iyile_melerinin sonra Euthanize. Ölüm ötenazi ikinci bir yöntem olarak servikal çıkığı tarafından onaylayın.
- Geniş, tam eksizyon çevresinde ve yara alan (yaklaşık 1 cm çapında) altındaki oluşturmak ve histolojik analizler için %4 paraformaldehyde dokusunda korumak için Iris makas kullanın.
- Diğer analiz: sitokin algılama
- toplamak kan retro-orbitally kılcal cam tüp kullanarak anestezi altında hayvanlardan ve EDTA tedavi tüpler için transfer.
- Santrifüj kapasitesi 4 ° C'de 20 dk için 2.000 devirde kan ve plazma sitokin hafiye için kımıldama.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yeni modeli geliştirirken, biz geçmişte kullanmış C57BL/6J fareler üzerinde tüysüz SKH-1 kullanarak pek çok avantajı gözlenen. Hayvanlar STZ enjeksiyonlar için normalde tabi yavaş yavaş kilo kaybı diyabet başlangıcı ile deneyim; Ancak, yarada deneyler şifa daha önce laboratuarlarımızda Dunn ve arktarafından sunulan modeli üreten tarafından yürütülen. (2012) 9 -C57BL/6J, şiddetli kilo kaybı kullanımı (şekil 1) gözlenmiştir. Buna ek olarak, ne zaman istimal bu yara istatistiksel olarak anlamlı bir alt kilo kaybı gözlenen SKH-1 fareler ile modeli (P < 0.0001, Mann-Whitney U testi). Ayrıca, ölüm yok iken % 40 ölüm oranı önceki deneyler (Şekil 2) farelerde C57BL/6J bulaştırmak için gözlendi P. aeruginosa Xen 41 biyofilmler ile enfekte diyabetik SKH-1 fareler kohort oluştu.
Burada sunulan modeline başka bir avantajı saç kaldırma adımı C57BL/6J fareler için zorunlu için deneysel bir işlem SKH-1 fareler için gereksiz olmasıdır. Her ne kadar bizim önceki deneylerde saçlı fareler ile özel dikkat cilt tahriş en aza indirmek için verildi, bazı hasar kaçınılmaz olarak (şekil 3) oluştu. Özellikle, ancak, tüysüz fareler bu modelde kullanan en büyük avantajı saç yeniden büyüme çalışmalar şifa uzun vadeli yarada gözlenen problemini ortadan kaldırılması olduğunu. Bizim deneyim C57BL/6J fareler ile saç yeniden büyüme hayvan hayvan çeşitli ama çalışmalar uzun vadeli doğası göz önüne alındığında, her zaman oluştu ve yara alan ölçümleri ile müdahale ya da çıkık yara Atel ve/veya karşılamak için kullanılan soslarda enfekte yaralar, potansiyel olarak yara (şekil 4) kurutma sonucu.
Diyabet onaylandıktan sonra SKH-1 yara iyileşme modelinde cerrahi kolayca hayvan sırtında yara dairesel bir tam kalınlıkta oluşturmak için çalıştırılabilir. Silikon ateli yerinde tıbbi su geçirmez deri yapıştırıcı tarafından tutulur ve tıkayıcı soyunma yeni oluşturulan yara Oda (şekil 5) üzerinden doğrudan temas önler.
P. aeruginosa Xen 41 kollarındaki biyofilmler polikarbonat membranlar (şekil 6) yetiştirilen kolayca ve aseptik'dır yaralar için hazırlanacak bir şırınga aktarılır ve inoculated fareler her gün için izlenir klinik belirtisi enfeksiyon (Şekil 7). Bu model için biz iki ayrı aşamada hayata. İlk aşamada biyofilm aşı sonra şeffaf bir tıkayıcı sos ile kaplı bir tahta yara çevriliydi. Bu yara tıkandı irin birikimi olur. Biyofilm içeren yaralar günlük görüntüleme sistemi enfeksiyon geliştirme izlemek ve biyofilm evrim (şekil 8 ve Şekil 9) değerlendirmek için in vivo ile görüntüsü. Toplam akı (p/s) kaydedilen bioluminescence, standart eğri (şekil 10) kullanarak bakteri yoğunluğu ile ilişkili olabilir.
Gün 8, tahta ve soyunma görselleştirme yara iyileşme sağlamak için çıkarıldı. Bioluminescence daha sonra yara çevreleyen irin kaybı nedeniyle düşer; Ancak, bakteri Histoloji tarafından belirlenen yara ile ilişkili kaldı. Bu yaklaşım yara iyileşmesi ölçmek için soyunma kaldırma çalışmaları (REFs) şifa diğer kronik yaralarda kullanıldığında vardır. İlerleme şifa yara bir mikroskop (Şekil 11) bağlı bir kamera ile Filmler alarak belirlenebilir.
Şekil 1: karşılaştırmalı yüzde kilo kaybı SKH-1 ve C57BL/6J diyabetik farelerin. Gün sıfır ağırlık-e doğru son (5inci) gününde STZ enjeksiyon karşılık gelir. n = 10 fareler SKH-1 ve n için C57BL/6J için 12 fare =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: yüzde sağkalım oranları P. aeruginosa Xen 41 biyofilm uygulama (gün 1) sonra diyabetik farelerin SKH-1 ve C57BL/6J. n = 5 fareler SKH-1 ve n için C57BL/6J için 10 fare =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Deri kesikler gelecekte sonra tıraş ve depilatory krem C57BL/6J fareler üzerinde kullanarak alan yaralı. (A): gün yordam; (B): 4 gün sonra yordamı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: (A) C57BL/6J fare ile kısmen kaldırıldı yara alçıya. (B) kaldırma ateli, tam olarak yeniden gelişmiş saç tarafından çevrili bir iyileşmiş yara saptandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: SKH-1 fareler yaralama için cerrahi müdahale. (A)sınır biyopsi yumruk ile; (B) anahat sınır; (C) tamamlandı yaralama; (D) uygulama tıbbi su geçirmez deri yapıştırıcı; (E) yapıştırma ateli; (F) yara tıkayıcı sos ile kaplı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: biyofilm inoculum hazırlanması. Pseudomonas aeruginosa Xen polikarbonat membranlar üzerinde yetiştirilen 41 (A) 72 h koloni biyofilmler; Bir syrin kullanarak biyofilm ölçümü (B)Ge. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: SKH-1 diyabetik fare 6 gün sonra yara ile P. aeruginosa Xen 41 biyofilm aşılandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: Diyabetik SKH-1 farelerde zamanla bioluminescence evrim izleyerek biyofilm enfeksiyon kontrolü. Biyofilm uygulamasının(a)gün; (B) 5 gün mesaj-biyofilm; (C) 8 gün sonrası-biyofilm; (D) 12 gün sonrası-biyofilm; (E) 16 gün sonrası-biyofilm; (F) 20 gün sonrası-biyofilm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9: Toplam akı yaraları SKH-1 diyabetik farelerde deney süresince P. aeruginosa Xen 41 biyofilmler ile enfekte. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 10: CFU bioluminescence CFU başına standart bir eğri üretilen P. aeruginosa Xen 41 biyofilmler ile yara kullanarak başına tahmini. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 11: test zaman çizelgesi yaraların enfekte P. aeruginosa Xen ile diyabetik SKH-1 Mouse şifa ilerleme gösterilen 41 biyofilmler. Biyofilm enfeksiyon sonra gün her resmin sol alt köşesinde gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada bir tekrarlanabilir, çevrilebilir ve esnek model oluşturmak için pek çok avantajı vardır biyofilmler diyabetik kronik yaralarda çalışma için yeni bir fare modeli açıklar.
İlk yenilik tüysüz fareler kullanmaktır. Diğer fare modelleri10,11şifa diyabetik kronik yara incelemek için geliştirilmiştir, ama tüm ağda veya saç kırpma ile birlikte ilgili işlemler tarafından kürk kaldırılmasını gerektiren saçlı fare kullanımı dayanıyordu depilatory kremler. Bu adım sadece zaman alıcı ve karmaşık ancak potansiyel olarak yara yerleştirildiği alan hayvanlarda deri kişi yaralandı. Alında saç çizgisi fareler karsinojenezis çalışmalar12,13bir dizi kullanmış iken, bu fareler biyofilm sebat kronik yaralarda değerlendirmek için kullanılmamış. Başka bir ortak sorun çözüldü uzun süreli çalışmalarda özellikle tüysüz hayvan kullanımı tarafından değerlendirilmesi yara iyileşmesi tehlikeye ve bandaj bozabilir yara bölgesinde saç yeniden büyüme var.
SKH-1 hayvanlar da STZ kaynaklı için mükellef kanıtladı tip ı diyabet ve C57BL/6J fare ile karşılaştırıldığında, insülin ile gereksiz dozaj yapma deney süresince istatistiksel olarak anlamlı düşük kilo kaybı vardı. Tedavi insülin ile potansiyel Watters ve ark. tarafından açıklanan diyabetik hayvanlar insülin tedavi ile enfekte bakteriyel sayıları artış (2014)14 kanıtlandığı enfeksiyon sonucu etkileyebilir gibi özellikle ilginç bir özelliktir P. aeruginosa biyofilmler hiç insülin meslektaşları ile karşılaştırıldığında. Buna ek olarak, bizim modelinde, mortalite oranları tüysüz kohort hayvanlar potansiyel olarak daha esnek enfeksiyon ile ilgili olduğunu gösteren bir ciddi azalma vardı.
Bu modelin ikinci bir özelliği planktonik yetişkin hücreler aksine yaralar bulaştırmak için ölçülen önceden biçimlendirilmiş biyofilm inoculum Bulamaç uygulamadır. Yaraya bir zaten metabolik olarak karmaşık ve yapılandırılmış bakteriyel topluluk sunarak bakteri hücreleri bağışıklık sistemi kaçmasına edebiliyoruz ve lezyonlar hemen biyofilmler etkilerini belirlenebilir.
Bu yeni yara modelin üçüncü avantajı mikrobiyal zorlanma görüntüleme sistemi dağınık şekilde yerelleştirilmesine ve bakteri ölçmek için bir vivo içinde ile ölçülebilir bioluminescence üretebilen kullanmaktır. Bu zaman içinde biyofilm evrimin gerçek zamanlı izlenmesini sağlar. P. aeruginosa Xen 41 zorlanma P. luminescences luxCDABE operon ultra-hassas kamera tarafından yakalanan ışıldama bünye emisyon sonuçlanan bakteriyel kromozom üzerinde tek bir sabit kopyasını sahip olur. görüntüleme sistemi. Bu gerçek zamanlı, non-invaziv, in situ özellik ateli ve kapak yerinde iken biyofilm bioluminescence tarafından ölçme sağlar. Biyofilm izlemek için belirli zaman noktalarda hayvanlar kurban gerek yok olduğu bu özellik büyük ölçüde hayvan çalışma, gerekli sayısını azaltır. Ancak, biyofilm ve irin varlığı ölçüm yara iyileşmesi tıkandı. Bu çalışmada, yara iyileşmesi, görselleştirme izin vermek için soyunma gün 8 kaldırıldı, ama bu parametre ele alınmaktadır sorular bağlı olarak değiştirilmiş olabilir.
Son olarak, görüntüleme sistemi bioluminescence kadar tespit yeteneğine sahip olduğu gibi 2.5 cm derinlik, yeni önerilen model çözüm veya jeller formunda antimikrobiyal tedaviler test için mükellef veya tıkayıcı pansuman için dahil. Bir gerçek zamanlı enfeksiyon izleme modeli farklı dozaj konsantrasyonları ve süreleri bir statik noktalardan tahlil karşı etkisini ölçmek çok daha fazla esneklik sağlar. Bu model doğrulama biyofilmler kronik yaralarda ortadan kaldırmak için potansiyel yeni tedavilerin katkıda bulunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Yazarlar Amerikan Diyabet Derneği bu eser (Grant # #7-13-BS-180), Devlet Üniversitesi Araştırma teknoloji Michigan Destek Merkezi eğitim ve görüntüleme sistemi vivo içinde erişim sağlamak için destek için teşekkür etmek istiyorum ve Michigan Eyalet Üniversitesi araştırmacı histopatoloji histopatolojik inceleme için fare biyopsileri işlemek için laboratuvarı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
References
- James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).
- Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).
- Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care. Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).
- Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team. J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Rocchetta, H. L., et al. Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection. Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).
- Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265 (2013).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge - a model for the study of chronic wounds. Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).
- Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin. Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).
- Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-ĸB/AP-1 signalling pathways. Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).
