Summary
泪膜细胞因子的分析有助于研究各种眼部疾病。基于微珠的复合检测方法简单、灵敏, 能够对小体积样品中的多个目标进行测试。在这里, 我们描述了一个协议的撕裂膜细胞因子分析一个使用珠基复用法。
Abstract
泪膜是一种复杂的脂质、蛋白质和矿物质的混合物, 覆盖了眼睛的外表面, 从而为底层细胞提供润滑、营养和保护。泪流分析是鉴别各种眼部疾病的预测、诊断和预后的标志物的一个新兴领域。眼泪是容易接近, 他们的收集是无创的。因此, 在研究蛋白质或代谢物组成的变化及其与病理条件的关系时, 先进的技术正日益突出, 以识别多分析的泪水。泪液细胞因子是研究眼部健康状况的理想标志物, 也有助于了解眼部疾病和春季结膜炎等不同眼表疾病的发病机制。基于微珠的复用检测具有较高的灵敏度, 能在少量样品中探测多个分析。在这里, 我们描述了一个标准的催泪样本收集, 提取和分析细胞因子的特征, 采用微珠的多重检测。
Introduction
眼泪是由泪腺和副腺体产生的, 并覆盖眼睛的外表面。泪膜由外脂层和内水层组成, 包括可溶性蛋白、粘和膜结合粘。眼泪可以防止微生物侵入, 提供营养, 并为眼部表面润滑。眼泪作为空气和组织之间的接口, 用于氧气输送到角膜。1撕裂膜由蛋白质、碳水化合物、血脂和电解质组成。一些研究发现, 泪液蛋白与眼部和全身性疾病如青光眼、干眼病、春季结膜炎、糖尿病、甲状腺相关眼眶和癌症之间的关联。2,3,4撕裂样品可以通过 microcapillary 管或撕裂流条 (斯戈默条) 收集。此外, 斯戈默的测试是在角膜和屈光手术诊所中执行的标准程序, 其结果可用于细胞因子分析化验。无创样本采集, 生物标本的可及性, 撕裂成分与各种生理和病理条件的联系, 使泪膜成为几种眼部和全身性疾病的生物标志物的潜在来源。4,5,6
泪液细胞因子在研究各种眼病的眼表健康和炎症状态方面起着重要的作用。7撕裂标本中几种细胞因子的异常浓度报告与干眼病、春季结膜炎 (VKC)、特应性结膜炎 (AKC)、季节性过敏性结膜炎和葡萄膜炎有关。8,9,10,11,12,13撕裂蛋白可以用质谱、印迹和酶联免疫吸附法等传统方法进行分析。14,15然而, 这些方法的局限性是敏感性差和大量的样本需要分析的多个撕裂细胞因子在每个病人。16,以17微珠为基础的复配分析方法, 对复杂混合样品中的多分析进行了研究, 成功地应用于撕裂样品, 分析了不同疾病中的多种细胞因子。6,18结合了三明治 elisa 和流式细胞术技术, 使得这些检测方法比 elisa 更灵敏, 可以对单个样本中的多个分析进行量化。19该方法可应用于多种临床标本和细胞培养清, 有助于研究几种病理生理条件下的免疫应答。20,21,22,23,24
有几项研究比较了珠基多重检测与 ELISA 法的相关性, 并报告了这些方法之间的相互关系。厕所et al.比较了基于微珠的多重检测与常规 ELISA 法测定人血清或血浆样品中脂联素、抵抗素、瘦蛋白和生长激素的含量, 并报告了两者之间的强相关性 (r 和 #62; 0.9)。25杜邦et al.报告了在 IL-6 和脂多糖刺激全血的 IL-1β、IL-4、IL-5、IL-10、节能、干扰素-植物和 TNF-α的检测中, 珠基复合测定与 ELISA 之间的强相关性。从怀孕妇女收集。26平克林et al.报告了另一种强关联度检测血清抗体对乙型流感嗜血杆菌(r = 0.96), 毒素的测定破伤风梭菌 (r = 0.96) 和杆菌白喉(r = 0.91)。27 Biagini et al.报告了一个高正相关 (r = 0.852) 之间的珠基复合测定和 ELISA 检测的芽孢杆菌抗体在血清样品中的抗 PA IgG。28 Wang et al.报告了在检测阿尔茨海默病生物标志物淀粉样蛋白β 42 (r = 0.77), 总 tau (r = 0.94), 和头磷酸化的氨基酸 181 (r = 0.82) 之间的相关性。脑脊液样本29这些研究证明了基于微珠的多重分析方法对临床样品的多样性、小样本量的要求以及与标准 ELISA 的相关性, 使微珠基复合检测成为一个有前途替代传统的 ELISA 方法检测不同类型的样品中的多种分析的疾病表型。在这里, 我们描述了一个标准化的协议, 以珠子为基础的多重检测细胞因子分析41分析的撕裂样本从健康的主题使用斯戈默带。
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Protocol
本研究中使用的协议已获新加坡谭家医院机构审查委员会批准.
1. 撕裂细胞因子分析
- 催泪集:
- 要求受试者舒适地坐在检查椅上, 并将其头部置于头枕上.
- 请主题查找, 仔细打开斯戈默条 (由惠特曼滤纸41制成), 并将条的圆端放在眼睛的下穹上, 并指示主体闭上眼睛5分钟。在收集眼泪时, 要非常小心, 尽量减少眼睛表面接触。 30
- 要求主题打开他/她的眼睛, 删除该条并将其放置在无菌1.5 毫升离心管中。立即将导管转移到实验室或存储在-80 o C, 直到测试细胞因子分析.
- 撕裂流条的撕裂试样的洗脱:
- 将撕裂流条切至长度为0.5 厘米 (以规范要测试的泪水的数量) 并将其置于无菌1.5 毫升离心管中.
- 添加30和 #181; 检测缓冲液, 室温孵育5分钟, 然后在 1.4万 x g 处离心, 1 分钟.
- 将上清液转移到另1.5 毫升离心管中, 然后丢弃该条。将含有该管的样品放在冰上, 并立即使用洗撕裂样品进行细胞因子分析.
- 准备试剂:
注: 在每个样品中测试的四十一分析, 采用珠基复合法测定, 分别为白细胞介素 (il)-1-#945;、IL-1 和 #946;、IL 和 #945;、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, 干扰素-α (干扰素-#945;) 2, 干扰素和 #947;, 干扰素-伽马诱导蛋白 10 (IP-10, CXCL10), 巨噬细胞衍生的趋化因子 (MDC), 巨噬细胞炎症蛋白 (MIP)-1 和 #945; 和 MIP-1 和 #946;, 单核趋蛋白 (MCP)-1, MCP-3, 肿瘤坏死因子α (tnf-和 #945;), tnf-和 #946; 生长调节的癌基因, 肿瘤生长因子α (TGF #945;), 血管内皮生长因子 (VEGF), 表皮生长因子 (EGF), 成纤维细胞生长因子-2, 血小板衍生生长因子-AA, 增殖素-AB/BB, 粒细胞集落刺激因子 (g-csf), 粒细胞-巨噬群刺激因子 (GM-csf), 细胞, fractalkine, 可溶性 CD40 配体 (sCD40L), Fms 样酪氨酸激酶3配体 (Flt-3L), 调节激活, 正常 T 细胞表达和分泌蛋白 (RANTES)。- 将抗体珠溶液 (50X) 瓶带到室温 (20 和 #160;-25 o C), 并将小瓶旋转1分钟。
- 统计化验所需的水井数, 并计算该化验所需的总抗体珠鸡尾酒溶液 (25 和 #181; L) 和每个抗体珠溶液 (50X) 的数量.
- 通过添加每个抗体珠溶液的计算量来准备鸡尾酒解决方案, 并通过加入剩余的珠稀释剂填充到所需的最终体积。确保鸡尾酒中每个抗体的最终浓度是1X。总是准备至少20% 额外量的鸡尾酒解决方案, 以防移错误.
注: 作为一个例子, 为96井化验准备3000和 #181; 抗体珠鸡尾酒解决方案的 L。每个抗体珠溶液所需的量 = 3000/每种抗体珠溶液的浓度;3000/50 = 60 和 #181; 每个抗体珠解决方案的 L- 添加60和 #181; l 每41抗体珠解决方案 (60 X 41 = 2460 和 #181; l) 成鸡尾酒瓶, 并添加540和 #181; 珠稀释液对抗体珠合剂进行3000和 #181; 最终的 l工作解决方案 (1X).
- 使用前, 适当混合珠鸡尾酒解决方案。在检测后, 将剩余的卷存储在 2-8 o C 上, 最多30天.
- 通过添加250和 #181 来准备质量控制 (qc); 去离子水到 qc 1 和 qc 2 库存.
- 通过将瓶子反转数次和十年代的漩涡来正确混合. 将解决方案转移到正确标记的聚丙烯离心管, 并将余下的解决方案存储在-20 和 #176; C 可用于最多30天.
- 通过将270毫升去离子水添加到30毫升的10X 洗涤缓冲液中, 并混合好 (稀释前, 将10X 缓冲带到室温, 并通过混合溶解所有的盐沉淀物) 来准备洗涤缓冲器。将未使用的洗涤缓冲器 (1X) 存储在2-8 和 #176; C 可用于最多30天.
- 通过添加250和 #181 来准备人体细胞因子标准库存 (所有分析的 1万 pg/毫升); 去离子水到储存瓶混合好通过多次倒置和漩涡小瓶十年代. 允许它站立10分钟, 并将库存解决方案转移到正确标记的聚丙烯离心管。化验后, 将余下的溶液储存在-20 及 #176; C, 可用于30天.
- 使用5倍的串行稀释 (50 和 #181; l 和 #62; 200 和 #181; l) 用化验缓冲器来准备工作人体细胞因子标准, 以获得2000、400、80、16和 3.2 pg/毫升.
- 标准准备后, 使用60分钟内的工作标准, 并使用化验缓冲作为空白/背景 (-pg/毫升).
- 基于多路检测的细胞因子分析:
- 将所有试剂置于室温和漩涡中5-10 秒后再加入到96井孔板中。如果洗撕裂样品被储存在-80 o C 之前的化验, 解冻冰冻撕裂提取物的冰和离心机在 1000 X g 5 分钟
- 为工作人体细胞因子标准 (0 (空白)、3.2、16、80、400、2000和 1万 pg/mL)、QC1、QC2 和样品准备一个垂直配置的化验工作表.
- 添加200和 #181; L 1X 洗涤缓冲器的每一个良好的板, 密封它与板封口机, 并保持它在一个平板振动筛室温 (20-25 o C) 为 10 min.
- 醒酒1X 洗涤缓冲器通过倒置板, 并点击它到吸水毛巾几次, 以消除任何残留量的洗涤缓冲区在水井.
- 添加25和 #181; 每个工作的人体细胞因子标准, QC1, QC2, 空白 (化验缓冲) 和样本到适当的井.
- 添加25和 #181; 对每个井进行化验缓冲.
- 在每个井中添加25和 #181; 1X 抗体珠鸡尾酒溶液。由于抗体珠溶液是轻敏感的, 密封板与板封口机和覆盖它与铝箔, 以保护它从光期间的化验.
- 将盘在 4 o C 在摇床上过夜.
- 将板放在自动磁板垫圈的板架上。让它坐1分钟, 以解决在底部的磁性珠子和吸井的内容。添加200和 #181, 每井洗涤缓冲器, 并让它坐1分钟, 然后抽吸井的内容。再重复一次洗涤 (为洗盘子, 跟随成套制造商和 #39; s 指示).
- 添加25和 #181; 在每个井中检测抗体溶液, 密封板, 用铝箔覆盖, 并在室温下孵育60分钟的振动筛.
- 添加25和 #181; Streptavidi藻溶液放入每个井中, 密封板, 用铝箔覆盖, 并在室温下孵育30分钟的振动筛.
- 将板放在磁板垫圈上。让它坐1分钟, 然后抽吸好的内容。添加200和 #181, 每井洗涤缓冲器。让它坐1分钟, 然后抽吸好的内容。重复一次洗涤.
- 添加150和 #181; 每个井的鞘液 L, 并放置在一个振动筛5分钟的室温, 以重抗体珠的板.
- 使用基于磁珠的多重检测板读取器立即读取车牌, 并使用5参数曲线拟合算法分析细胞因子的浓度。在 图 1 中显示了撕裂细胞因子分析的示意图流程图.
- 读取检测板 (仪器设置) 和数据分析:
- 在基于磁路的多路检测读取器上切换, 并预热激光30分钟.
- 启动基于磁珠的多重检测软件。根据和 #39; 自动维护和 #39; 选项卡, 选择和 #39; 校准-验证和 #39; 选项。涡旋每个试剂瓶的校准和验证珠三十年代. 将每种试剂的5滴放入指定的井中。用去离子水和70% 乙醇填充指定的水库.
- 创建新协议
- 打开和 #39;P rotocols 和 #39; 页然后 #39;P rotocols 和 #39; 选项卡. 单击和 #34; 创建新的协议和 #34;; #39; 设置和 #39; 选项卡将打开
- 在 #39; 名称和 #39; 框中, 键入协议的名称.
- 在 #39 的右侧框中键入说明; 名称和 #39; 框.
- 在 #39; 版本和 #39; 框中, 键入协议的版本.
- 在 #39; 制造商和 #39; 框中, 键入协议的制造商信息.
- 定义和 #39 中的设置; 购置设置和 #39; 部分, 如下所示。设置和 #39; 容量和 #39;: 100 和 #181; #39; 超时和 #39;: 六十年代;#39;DD 门 #39;: 8000 到 1.5万;#39; 记者增益和 #39;: 标准 PMT;#39; 珠型和 #39;: 磁珠.
- 定义和 #39 中的设置; 分析设置和 #39; 部分, 选择和 #39; 定量和 #39; 作为分析类型。设置和 #39; 标准和 #39 的数量;: 6;#39; 控制和 #39 的数量;: 0;#39; 复制和 #39 的平均值; 框;
在获得样品和 #39 时, #39; 分析结果; 框. - 单击和 #34; 下一 #34;; #39; 分析和 #39; 选项卡打开, 单击所需的分析 (珠子 ID) 在已编号的分析物网格中.
- 在 and #39 中单击并键入相应的分析物名称; 名称和 #39; 分析物网格右侧的列 (分析和 #39; 名称及其相应的磁珠区域详细信息在 表 1 ) 中提到.
- 单击并键入所需的度量单位 (即 pg/mL) 在和 #39; 单位和 #39; #39 的左侧框; 应用所有和 #39; 按钮。然后单击并 #34; 应用所有 #34;.
- 在 #39 中单击并键入每个分析物 ( 即 50) 所需的磁珠计数; 计数和 #39; 框。单击并 #34; 应用所有 #34;.
- 单击并 #34; 下一 #34;; "板布局" 选项卡打开。为标准和选择 #34; 2 和 #34; 在 "复制计数" 下, 单击 "与 #34; S 和 #34; 标准按钮。为背景和 #34 重复此步骤; B 和 #34; 以及样品和 #34; U 和 #34; 井.
- 单击并 #34; 保存和 #34;.
- 创建新的标准/控制批次
- 打开和 #39;P rotocols 和 #39; 页, 然后 #39; 标准和 #38; 控件和 #39; 选项卡. 单击和 #34; 创建新的标准/控制批次和 #34;...
- 打开和 #39; 选择协议和 #39; 框。选择在步骤1.5.3 中创建的协议.
- 相应标准信息的关键字: std/ctrl 套件号、std/ctrl 套件名称、过期和制造商.
- 每个分析物的最高标准值的键 ( 即 10000 pg/毫升)。在5的关键在稀释和点击和 #34; 应用所有 #34; 自动生成其余标准的预期浓度.
- 单击并 #34; 保存和 #34;.
- 从现有协议中创建新批处理
- 打开和 #39; 批次和 #39; 页并单击和 #34; 从现有协议和 #34 创建新的批处理选项卡..
- 在 "和 #39 中键入批次名称; 批次名称和 #39; 框, 然后在" 和 "#39 中键入有关批次的说明; 输入可选说明和 #39; 框.
- 单击先前生成的协议 (在步骤1.5.3 中).
- 单击和 #34; 下一页 #34;; 下一个选项卡是 #39; 性病和 #38; Ctrls 和 #39; 选项卡. 查看检测标准的详细信息, 选择和 #34; 下一页和 #34;.
- 在 #39;P 后期布局和 #39; 选项卡上, 为该批分配良好的命令, 然后单击并 #34; 保存和 #34; 将批处理信息保存到 #39;P 结束批次和 #39; 列表.
- 将该板加载到基于磁路的多路检测板读取器中, 摇动它5分钟, 然后从待定的批处理列表中运行批处理。获取的数据将以. csv 文件格式保存.
- 数据分析
- 使用 rbx 转换软件将从基于珠子的多路检测软件生成的. csv 文件转换为. rbx 文件 (结果数据文件) 格式。启动转换软件, 选择 xPONENT 文件下的. csv 文件, 然后单击 #34; 生成和 #34; 按钮;. rbx 文件将保存在选定的输出文件夹中.
- 启动分析软件并打开. rbx 文件.
- 使用 4 pl/5 pl 曲线拟合优化标准曲线。
- 在和 #39 中选择以下内容; 标准曲线和 #39; 选项卡: 和 #39; 回归类型和 #39;: #39; Logistic-5PL 和 #39;; #39; 轴变换和 #39;; #39; 日志 (x)-线性 (y) 和 #39;; 勾选和 #39; 显示具体范围线和 #39; 框; 勾选 #39; 显示未知样品和 #39; 箱;勾选和 #39; 显示控制样本和 #39; 框;勾选 #39; 在所有的分析和 #39 中应用;勾选 #39; 在优化和 #39 后显示报告; 框.
- 单击 #34; 优化和 #34; auto-optimization 按钮.
- 在 #39 下标记示例标识; 输入示例信息和 #39; 选项卡.
- 获取 #39 中的观察到的浓度; 报表表和 #39; 选项卡, 然后单击并 #34; 导出报表表和 #34; 在电子表格文件中生成数据以进行进一步分析.
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Representative Results
用泪流条和细胞因子水平分析了8眼4健康受试者的泪液样本。所有科目均为男性, 四受试者的年龄分别为36、42、44及52岁。通过临床试验 (泪膜破裂时间、斯戈默试验、角膜染色、结膜染色、眼睑/板腺检查、角膜撕裂征象和视觉体征及症状), 对眼部健康和干眼病进行评估。国际干眼研讨会, 2007 指导方针, 没有一个主题显示任何迹象和症状的干眼病。31
在41细胞因子分析, 在所有的撕裂标本中检测到31种细胞因子, IL-17A、MIP-1β和 TNF-α在7眼中检测4例, IL-4 在4科6眼中检测, 在6个实验对象中检测到干扰素γ, IL-1A 3 眼主题细胞和 IL-9 在3眼中检测到2科, IL-3 在1眼和 MIP-1α中均未检出标本。在表 2中提到了在健康主体中检测到的41种细胞因子的平均± SD 浓度 (图 2)。在41细胞因子分析, IL-1ra 被发现是高度表达的所有样品与平均± SD 203.9 ± 52.6 ng/毫升, 从 129.64 ng/毫升到 271.7 ng/毫升。细胞因子 IP-10、MCP-1、血小板-AA、Fractalkine、IL-8、EGF、血小板生长因子-BB、VEGF 和 g-csf 在健康人的泪中也有很高的表达 (ng/毫升数量), 其余的细胞因子以 pg/毫升的数量表达 (表 2)。最低浓度的撕裂细胞因子是 TNF-α与平均± SD 27.25 ± 19.97 pg/毫升, 从 10.75 pg/毫升到 56.02 pg/毫升。在所有样本中检测到的31种细胞因子中, 没有一个在右眼和左眼睛之间的浓度 (p和 #62; 0.05) 之间有统计学意义的差异 (图 3)。
图 1: 撕裂细胞因子分析的原理流程图.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 健康人群中撕裂细胞因子的特征。代表散显示的日志平均± SD 浓度41细胞因子的撕裂标本从健康的主题收集.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 眼撕裂细胞因子在健康人中的分布差异.代表性散显示没有统计学意义的差异 (p和 #62; 0.05) 在 inter-eye 平均浓度31撕裂细胞因子在健康的科目。请单击此处查看此图的较大版本.
| No。 | 分析 | 珠区 |
| 1 | egf | 12 |
| 2 | FGF-2 | 13 |
| 3 | 细胞 | 14 |
| 4 | TGF-α | 15 |
| 5 | g-csf | 18 |
| 6 | Flt-3L | 19 |
| 7 | GM-CSF | 20 |
| 8 | Fractalkine | 21 |
| 9 | IFNα2 | 22 |
| 10 | IFNγ | 25 |
| 11 | 主任 | 26 |
| 12 | IL-10 | 27 |
| 13 | MCP-3 | 28 |
| 14 | IL-12P40 | 29 |
| 15 | mdc | 30 |
| 16 | IL-12P70 | 33 |
| 17 | 血小板生长因子-AA | 34 |
| 18 | IL-13 | 35 |
| 19 | AB/BB | 36 |
| 20 | IL-15 | 37 |
| 21 | sCD40L | 38 |
| 22 | IL-17A | 39 |
| 23 | IL-1RA | 42 |
| 24 | IL-1α | 44 |
| 25 | IL-9 | 45 |
| 26 | IL-1β | 46 |
| 27 | IL-2 | 48 |
| 28 | IL-3 | 51 |
| 29 | IL-4 | 53 |
| 30 | IL-5 | 55 |
| 31 | IL-6 | 57 |
| 32 | IL-7 | 61 |
| 33 | IL-8 | 63 |
| 34 | IP-10 | 65 |
| 35 | MCP-1 | 67 |
| 36 | MIP-1α | 72 |
| 37 | MIP-1β | 73 |
| 38 | rantes | 74 |
| 39 | TNFα | 75 |
| 40 | TNFβ | 76 |
| 41 | vegf | 78 |
表 1:分析的名称和相应的珠区详细信息.
| No。 | 因子 | 眼睛的数量 | 科目数 | 平均浓度 | sd |
| 1 | egf | 8 | 4 | 2610.29 | 1711.56 |
| 2 | 细胞 | 3 | 2 | 404.73 | 260.76 |
| 3 | FGF-2 | 8 | 4 | 827.73 | 262.44 |
| 4 | Flt-3L | 8 | 4 | 475。4 | 133。6 |
| 5 | Fractalkine | 8 | 4 | 4179.08 | 1888.38 |
| 6 | g-csf | 8 | 4 | 1287.57 | 633.16 |
| 7 | GM-CSF | 8 | 4 | 93.03 | 28。1 |
| 8 | 主任 | 8 | 4 | 23176.87 | 18692.07 |
| 9 | IFNa2 | 8 | 4 | 641。4 | 253.55 |
| 10 | IFNg | 6 | 3 | 76。6 | 42.81 |
| 11 | IL-10 | 8 | 4 | 101.32 | 41.52 |
| 12 | IL-12 p40 | 8 | 4 | 245.46 | 133.01 |
| 13 | IL-12 |
表 2:在健康的主题中撕裂细胞因子的特征.平均± SD 浓度的41细胞因子检测在健康的主题采用微珠的多重检测。
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Discussion
细胞因子是小细胞分泌的蛋白质和有效的免疫调节调控免疫应答。32撕裂标本中各种细胞因子的表达谱与眼睛的各种病理条件有关, 研究细胞因子图谱有助于了解疾病发病机制, 确定眼部健康状况,疾病的严重性, 诊断和进展。2,5较低的蛋白质浓度和小样本量是传统方法的主要挑战, 限制了对撕裂细胞因子的分析, 如 ELISA 法的使用。基于33的多路复用检测方法免疫, 具有明显的优越性。基于微珠的复用检测需要更小的样本量来分析多个分析, 并且高度敏感, 能够探测生物体液中蛋白质的 picogram 浓度。34
在这里, 我们报告了一个标准化的协议, 定量分析41泪细胞因子在健康的人使用珠基复合检测。在该小组的41细胞因子中, 基于微珠的多重分析检测了撕裂标本中的40细胞因子, 无法检测 MIP-1α。这种负面的结果可能是因为在健康的撕裂标本中, 或由于泪水的体积较小, MIP-1α的水平是无法检测到的。使用斯戈默条收集的撕裂样品比其他收集方法如 microcapillary 管和海绵具有优势。例如, 在几个临床条件下, 泪液容积可以用斯戈默条测量, 而泪液可以在测量后洗, 并用于细胞因子分析。35虽然 microcapillary 管通常用于收集泪水和产生更一致的撕裂轮廓, 但该过程比条方法要多得多的时间, 更繁琐, 可能会让儿童和其他病人感到不适。此外, 该方法还可以通过接触结膜产生反射性撕裂, 并生成与基底撕裂相比的细胞因子变化结果, 从而影响分析的重现性。36在某些临床条件下, 如干眼病, 斯戈默条撕裂标本收集是可靠的蛋白质分析和帮助识别生物标志物。37,38
基于微珠的多重分析是流式细胞仪和多重酶联免疫吸附法的结合, 其中分析在样品中被夹在特定抗体涂层和彩色编码磁珠或化检测抗体之间。这些配合物可以通过添加记者分子亲和-藻 (PE) 共轭和随后暴露在一个双激光系统的改进流 cytometry-based 仪检测。39在双激光系统中, 一激光激发内部染料, 其信号代表涂层特异抗体。第二激光激发的报告分子 PE 共轭绑定到检测抗体复合体和强度的信号表示浓度的分析物。
用不同强度的染料对微球进行编码的能力使该测定能够在单井中的小体积样品中检测多达100不同的分析。39虽然基于微珠的复用检测方法快速、重现性好, 可与标准 ELISA 法进行比较, 但34,40此方式需要专用仪器、套件评估和协议标准化各种生物标本。39临床样品中抗体的存在可能会影响基于微珠的复合结果。34,39在临床设置中例行使用这些化验, 建议使用一个特定制造商的化验试剂盒。报告的灵敏度, 检测的绝对浓度的细胞因子, 和重现性被报道不同的套件。41抗体微阵列或膜芯片是高度敏感、廉价的替代高通量技术, 可检测小量样品中的多个分析, 并能成功应用于撕裂样品, 分析细胞因子和其他蛋白质。35,42但是, 由于这些检测耗时、半定量、具有较高的信噪比和缺乏标准化的协议, 因此存在许多限制。19,43
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Disclosures
作者没有什么可透露的。没有经济利益或利益冲突。
Acknowledgments
该项研究工作得到由谭医院个人种子资助计划2015中心资助;新加坡眼科研究所的试点补助金和谭医院的资金补助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit | Merck, USA | HCYTOMAG-60K-41 | |
| Flexmap 3D luminex instrument | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| xPonent software | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| RBXGenerator software | BIO-RAD, France | ||
| Bio-Plex Manager 6.1 | BIO-RAD, France | ||
| Plate shaker | Corning, USA | ||
| TECAN Microplate Washer | Tecan, Switzerland | HydroSpeed | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries inc, USA | G560E | |
| Pipettes | Mettler Toledo, CA, USA | ||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Axygen, USA | MCT-150-C | |
| Schirmer tear flow test strip | Eye Care and Cure, USA | 101657 | |
| Flexmap 3D Calibration Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-028 | |
| Flexmap 3D Verfication Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-029 | |
| Ocular examination chair |
References
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