Summary
Analisi del film lacrimale citochine aiuta a studiare varie malattie oculari. Saggi multiplex perlina basata sono semplici e sensibili e abilitare il testing di bersagli multipli in campioni con piccoli volumi. Qui descriviamo un protocollo per lacrima film cytokine profilatura un mediante perlina basato su analisi multiplex.
Abstract
Film lacrimale è una miscela complessa di lipidi, proteine e minerali che copre la superficie esterna dell'occhio, fornendo in tal modo la lubrificazione, la nutrizione e la protezione alle celle sottostanti. Analisi delle lacrime sono un'area emergente per l'identificazione di biomarcatori per la previsione, diagnosi e prognosi di varie malattie oculari. Le lacrime sono facilmente accessibili e loro insieme è invasivo. Di conseguenza, avanzante tecnologie stanno guadagnando importanza per l'identificazione degli analiti multiple in lacrime per studiare i cambiamenti nella composizione della proteina o del metabolita e la sua associazione con condizioni patologiche. Lacrima citochine sono biomarcatori ideale per studiare la salute della superficie oculare e anche aiutano nella comprensione dei meccanismi di diversi disordini di superficie oculari come malattia dell'occhio asciutta e congiuntivite primaverile. Saggi multiplex perlina base hanno la capacità di rilevare analiti multiple in una piccola quantità di campione con una maggiore sensibilità. Qui descriviamo un protocollo standardizzato di raccolta del campione di lacrima, estrazione ed analisi di cytokine profilatura mediante una perlina basato su analisi multiplex.
Introduction
Le lacrime sono prodotte dalla ghiandola lacrimale e ghiandole accessorie e rivestire la superficie esterna dell'occhio. Film lacrimale è costituito da uno strato lipidico esterno e uno strato acquoso interno che comprende proteine solubili, mucine e membrana associato mucine. Lacrime impediscono l'invasione microbica, forniscono sostanze nutritive e forniscono la lubrificazione alla superficie oculare. Lacrime di fungere da interfaccia tra l'aria ed il tessuto per il trasporto di ossigeno alla cornea. 1 film lacrimale è costituito da proteine, carboidrati, lipidi ed elettroliti. L'associazione tra proteine di strappo con malattie oculari e sistemiche come glaucoma, malattia dell'occhio secco, congiuntivite primaverile, mellito di diabete, cancro e orbitopatia tiroide-collegato è stato identificato in diversi studi. 2 , 3 , 4 lacrima campioni possono essere raccolti da microcapillary tubi o lacrima flusso strips (strisce di Schirmer). Inoltre, test di Schirmer è una procedura standard eseguita nella cornea e cliniche di chirurgia refrattiva, i cui risultati possono essere utilizzati per analisi di analisi di cytokine. Raccolta dei campioni non-invasivo, accessibilità del bio-campione e l'associazione di strappo composizione con varie condizioni fisiologiche e patologiche fanno strappare la pellicola una potenziale fonte di biomarcatori per parecchie malattie oculari e sistemiche. 4 , 5 , 6
Lacrima citochine svolge un ruolo importante nello studio della salute di superficie oculare e condizioni infiammatorie di varie malattie oculari. 7 concentrazioni anormali di diverse citochine in campioni di rottura sono state segnalate per essere associati con la malattia dell'occhio asciutta, cheratocongiuntivite primaverile (VKC) e cheratocongiuntivite atopica (AKC), congiuntivite allergica stagionale e uveite. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 lacrima proteine possono essere analizzati con metodi tradizionali come la spettrometria di massa, western blotting e analisi enzima-collegate dell'immunosorbente (ELISA). 14 , 15 tuttavia, le limitazioni di questi metodi sono scarsa sensibilità e un più grande volume di campione richiesto per l'analisi delle citochine multiple di lacrima in ogni paziente. 16 , 17 saggi multiplex perlina basata sono stati sviluppati per analizzare più analiti nei campioni di miscela complessa e applicati con successo su campioni di lacrima per analizzare più citochine nelle malattie differenti. 6 , 18 A combinazione di sandwich ELISA e tecniche di citometria di flusso consentono queste analisi diventare più sensibile dell'ELISA per la quantificazione degli analiti multipli in un singolo campione. 19 questo metodo può essere applicato su una varietà di campioni clinici e surnatanti della cultura delle cellule e aiuta nello studio delle risposte immunitarie in diverse condizioni fisiopatologiche. 20 , 21 , 22 , 23 , 24
Ci sono parecchi studi confrontando perlina basato multiplex assays con ELISA e hanno segnalato una correlazione tra i metodi. Perlina di Loo et al rispetto basato l'analisi multiplex con ELISA convenzionale per la rilevazione di adiponectina, resistina, leptina e grelina nei campioni di siero o plasma umano e segnalato una forte correlazione (r > 0,9) tra i saggi. 25 Dupont et al ha segnalato una forte correlazione fra saggi multiplex perlina basato ed ELISA per la rilevazione di IL-1 β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ e TNF-α nel phytohemagglutinin e lipopolisaccaride stimolato sangue intero raccolti da donne incinte. 26 Pickering et al ha segnalato un altro forte correlazione tra analisi multiplex perlina basato ed ELISA per la rilevazione degli anticorpi del siero di Haemophilus influenzae tipo b polisaccaride (r = 0,96), tossoidi del Clostridium tetani (r = 0,96) e Corynebacterium diphtheriae (r = 0,91). 27 Biagini et al ha segnalato un'alta correlazione positiva (r = 0,852) tra analisi multiplex perlina basato ed ELISA per il rilevamento di Bacillus anthracis anti-PA IgG nei campioni di siero. 28 Wang et al ha segnalato una correlazione tra analisi multiplex perlina basato ed ELISA per l'individuazione di biomarcatori di malattia di Alzheimer amiloide-β 42 (r = 0.77), tau totale (r = 0.94) e tau fosforilate su aminoacido 181 (r = 0.82) in campioni del liquido cerebrospinale. 29 questi studi hanno dimostrato che l'applicabilità del branello basato multisala saggi su varietà di campioni clinici, minori requisiti di volume di campione e una correlazione con ELISA standard, che rendono saggi multiplex perlina basato un promettente alternativa ai tradizionali metodi ELISA per il rilevamento di più analiti in diversi tipi di campioni in fenotipi differenti di malattia. Qui descriviamo un protocollo standardizzato per l'analisi multiplex perlina basato per la citochina profilatura per 41 analiti in lacrima campioni prelevati da soggetti sani utilizzando strisce di Schirmer.
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Protocol
i protocolli utilizzati in questo studio sono stati approvati dal comitato di revisione istituzionale di Tan Tock Seng Hospital, Singapore.
1. analisi di Cytokine strappare
- collezione di lacrime:
- chiedere al soggetto di sedersi comodamente su una sedia di esame e posizionare il suo testa contro il poggiatesta.
- Chiedere al soggetto di cercare, aprire le strisce di Schirmer (fatte di carta da filtro Whatman n. 41) e posizionare l'estremità arrotondata della striscia il fornix inferiore dell'occhio e istruire il soggetto di chiudere gli occhi per 5 min. Mentre la raccolta le lacrime fare molta attenzione a ridurre al minimo la superficie di contatto oculare. 30
- chiedere al soggetto di aprire il suo occhi per rimuovere la striscia e metterlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL sterile. Il tubo di trasferimento immediatamente al laboratorio o conservare a-80 o C fino al test per il profilo di citochina.
- Eluizione dell'esempio tear striscia a strappo flusso:
- tagliare la striscia a strappo flusso ad una lunghezza di 0,5 cm (per standardizzare la quantità di lacrime da testare) e metterlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL sterile.
- Aggiungere 30 µ l di tampone per il test e incubare a temperatura ambiente per 5 min seguita da centrifugazione il tubo a 14.000 x g per 1 min.
- Trasferire il surnatante in un'altra provetta di microcentrifuga da 1,5 mL e scartare la striscia. Posizionare il campione contenente il tubo sul ghiaccio e utilizzare l'esempio di lacrima eluiti immediatamente per profilatura di citochina.
- Preparazione dei reagenti:
Nota: quarantuno analiti per essere testato in ogni campione dall'analisi multiplex perlina basato sono interleuchina (IL)-1 α, IL-1 β, IL-Rα, il-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, p70 di IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A, interferone-alfa (IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-gamma-viscoelastico della proteina 10 (IP-10, CXCL10), macrofago-derivata chemochine (MDC), proteina infiammatoria macrofagica (MIP)-1 α e MIP-1 β, monocito proteina chemiotattica (MCP) -1, MCP-3, fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α), TNF-β, crescita-regolata dell'oncogene (GRO), alfa di fattore di crescita del tumore (TGF-α), fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), fattore di crescita epidermico (EGF) e del fibroblasto fattore di crescita (FGF) -2, piastrina derivato il fattore di crescita (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, fattore distimolazione del granulocyte (G-CSF), fattore distimolazione del granulocyte-macrofago (GM-CSF), eotaxin, fractalchina, solubile ligando di CD40 (sCD40L), Fms-like legante di tirosina chinasi 3 (Flt - 3L) e regolato al momento dell'attivazione, T-cellula normale espressa e secreta proteina (RANTES).- Portare i flaconcini di soluzione (50 X) anticorpo perlina a temperatura ambiente (20-25 o C) e vortex le fiale per 1 min.
- Contare il numero di pozzetti necessari per il dosaggio e calcolare la quantità di soluzione di anticorpo totale della perla cocktail (25 µ l per pozzetto) e ogni soluzione di perlina di anticorpo (50x) richiesto per il dosaggio di.
- Preparare la soluzione di cocktail aggiungendo la quantità calcolata di ogni soluzione di anticorpo perlina e riempire il volume finale desiderato aggiungendo l'importo residuo del branello diluente. Garantire che la concentrazione finale di ogni anticorpo nel cocktail è 1x. Sempre preparare almeno 20% extra volume della soluzione di cocktail in caso di errori di pipettamento.
Nota: Ad esempio, per un dosaggio di 96 pozzetti preparare 3000 µ l di soluzione di anticorpo perlina cocktail. La quantità necessaria di ogni soluzione di perlina di anticorpo = concentrazione di 3000/stock di ogni soluzione di perlina di anticorpo; 3000/50 = 60 µ l di soluzione di ogni anticorpo perlina- aggiungere 60 µ l di ciascuna delle soluzioni perlina 41 anticorpo (60 X 41 = 2460 µ l) in un cocktail bottiglia e aggiungere 540 µ l di soluzione diluente della perla per la miscela di microsfere di anticorpo di rendere 3000 µ l di finale soluzione di lavoro (1. X).
- Prima dell'uso, mescolare bene la soluzione cocktail della perla. Dopo l'analisi dell'archivio il volume residuo a 2-8 o C per fino a 30 giorni.
- Preparare i controlli di qualità (QC) aggiungendo 250 µ l deionizzata acqua agli stock 1 QC e QC 2.
- Mescolare correttamente invertendo le bottiglie diverse volte e vortex per 10 s. trasferimento la soluzione correttamente etichettato in polipropilene per microcentrifuga e conservare la soluzione rimanente a-20 ° C, che può essere utilizzato fino a 30 giorni.
- Preparare il tampone di lavaggio aggiungendo 270 mL di acqua deionizzata a 30 mL di 10 X soluzione tampone di lavaggio e mescolare bene (prima diluizione, portare il buffer X 10 a temperatura ambiente e sciogliere tutti i precipitati sale di miscelazione). Conservare il tampone di lavaggio inutilizzati (1x) a 2-8 ° C, che può essere utilizzato fino a 30 giorni.
- Preparare il brodo di standard umana di citochina (10.000 pg/mL di tutti gli analiti) aggiungendo 250 µ l deionizzata acqua nel flacone stock. Mix bene capovolgendo più volte e vortice il flaconcino per 10 s. lasciare riposare per 10 min e trasferire la soluzione di riserva per correttamente etichettato in polipropilene per microcentrifuga. Dopo il dosaggio, conservare la soluzione rimanente a-20 ° C, che può essere utilizzato fino a 30 giorni.
- Preparare il lavoro umano citochina standard da 5 volte diluizioni seriali (50 µ l - > 200 µ l) con tampone di dosaggio per ottenere 2000, 400, 80, 16 e 3,2 pg/mL.
- Dopo preparazione standard, utilizzare gli standard di lavoro entro 60 min e utilizzare il tampone del saggio come vuoto/sfondo (-pg/mL).
- Cytokine Profilatura da perlina basato su analisi multiplex:
- portare tutti i reattivi a temperatura ambiente e mescolare nel vortex per 5-10 secondi prima di aggiungerli alla piastra microtiter a 96 pozzetti. Se i campioni eluiti lacrima sono conservati a -80 o C prima del dosaggio, scongelare gli estratti congelati lacrima sul ghiaccio e centrifugare a 1000 X g per 5 min.
- Preparare un foglio di lavoro di analisi in una configurazione verticale per l'utilizzo standard di citochina umana [0 (vuoto), 3.2, 16, 80, 400, 2.000 e 10.000 pg/mL], QC1, campioni e QC2.
- Aggiungere 200 µ l di tampone di lavaggio di ciascuno: 1x bene della piastra, sigillarlo con copripiastra e tenerlo su un agitatore per piastre a temperatura ambiente (20-25 o C) per 10 min.
- Decantare il tampone di lavaggio X 1 invertendo la piastra e toccare su assorbenti più volte per rimuovere qualsiasi residuo di tampone di lavaggio nei pozzetti.
- Aggiungere 25 µ l di ogni lavoro umano citochina standard, QC1, DC2, vuoto (tampone) e campioni nei pozzetti appropriati.
- Aggiungere 25 µ l assay buffer in ogni pozzetto. Soluzione cocktail perlina di
- aggiungere 25 µ l di 1 X anticorpo in ciascun pozzetto. Come la soluzione del branello dell'anticorpo è sensibile alla luce, sigillare la piastra con il copripiastra e coprirlo con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce durante il dosaggio.
- Incubare la piastra a 4 o C durante la notte su un agitatore.
- Collocare la piastra sulla cremagliera di piatto di un lavatore automatico piastra magnetica. Lasciate riposare per 1 min a stabilirsi i branelli magnetici nella parte inferiore del pozzo e aspirare il contenuto bene. Aggiungere 200 µ l di tampone di lavaggio per pozzetto e lasciate riposare per 1 minuto e poi aspirare il contenuto bene. Ripetere il lavaggio ancora una volta (per il lavaggio della piastra, seguire il produttore di kit ' s istruzioni).
- Aggiungere 25 µ l di soluzione di identificazione degli anticorpi in ogni bene, sigillare la piastra, coprirla con carta stagnola e incubare a temperatura ambiente per 60 minuti su un agitatore.
- Aggiungere 25 µ l di Streptavidisoluzione di n-ficoeritrina in ciascun pozzetto, sigillare la piastra, coprirla con carta stagnola e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti su un agitatore.
- Collocare la piastra su una rondella piastra magnetica. Lasciate riposare per 1 minuto e poi aspirare il contenuto bene. Aggiungere 200 µ l di tampone di lavaggio per pozzetto. Lasciate riposare per 1 minuto e poi aspirare il contenuto bene. Ripetere il lavaggio ancora una volta.
- Aggiungere 150 µ l di liquido di guaina di ogni bene e posizionare la piastra su un agitatore per 5 min a temperatura ambiente per risospendere le perline di anticorpo.
- Leggere la piastra immediatamente utilizzando il tallone analisi multiplex piastra lettore basato e analizzare le concentrazioni di citochine utilizzando un algoritmo di curva-montaggio 5-parametri. Un diagramma di flusso schematico di lacrima cytokine profilatura è illustrato nella Figura 1.
- Leggendo il saggio piastra (strumento istituito) e analisi dei dati:
- interruttore sul tallone basato su analisi multiplex reader e pre-caldo il laser per 30 min.
- Avviare il software di analisi multiplex perlina basato. Sotto il ' automatizzato manutenzione ' scheda, selezionare il ' verifica della calibrazione ' opzione. Vortex ciascun reagente fiala delle perle taratura e verifica per 30 s. Place 5 gocce di ciascun reagente nei pozzetti designati. Riempire i serbatoi designati con deionizzata acqua e 70% di etanolo.
- Crea un nuovo protocollo
- aprire il ' protocolli ' pagina e poi la ' protocolli ' scheda, fare clic " creare nuove ProtocolŔ il ' impostazioni ' scheda si aprirà.
- Nella ' nome ', digitare il nome del protocollo.
- Digitare una descrizione nella casella a destra del ' nome ' casella.
- Nella ' versione ', digitare la versione del protocollo.
- Nella ' produttore ', digitare le informazioni sul produttore per il protocollo.
- Definire impostazioni nella ' impostazioni di acquisizione ' come segue. Impostare ' Volume ': 100 µ l, ' Timeout ': 60 s; ' DD Gating ': 8.000 a 15.000; ' Reporter guadagno ': PMT Standard; ' Tallone tipo ': Magnetic Beads.
- Definire impostazioni nella ' impostazioni di analisi ' sezione, selezione ' quantitativa ' come il tipo di analisi. Impostare ' numero di norme ': 6; ' Numero di controlli ': 0; Spunta la ' dire di replica ' scatola;
Spuntare il ' analizzare risultati mentre l'acquisizione di campioni ' casella. - Clic " NextŔ la ' analiti ' si apre, fare clic su analiti desiderati (ID del branello) nella griglia numerata analita.
- Doppio clic e modifica l'analita corrispondente nome nella ' nome ' colonna a destra della griglia dell'analita (analiti ' i nomi e i loro dettagli di regione perlina corrispondenti sono stati menzionati nella tabella 1).
- Clic e digitare l'unità di misura (cioè pg/mL) desiderata nella ' unità ' casella a sinistra della ' applica tutti ' pulsante. Quindi fare clic su " applicare tutti i ".
- Doppio clic e modifica il tallone desiderato contare per ogni analita (cioè 50) nella ' Conte ' casella. Fare clic su " applicare tutti i ".
- Clic " NextŔ si apre la scheda di Layout della piastra. Evidenziare i pozzetti per il standard e selezionare " 2 " sotto conteggio di replicare e fare clic sul " S " pulsante Standard. Ripetere questo passaggio per lo sfondo " B " e campioni " U " wells.
- Clic " salvare ".
- Creare nuovi standard/controllo lotti
- aperto il ' protocolli ' pagina e poi la ' standard & controlli ' scheda, fare clic " creare nuovi Standard/controllo lotti ".
- Apri il ' Selezionare protocollo ' casella. Selezionare il protocollo che è stato creato nel passaggio 1.5.3.
- Chiave di conseguenza le informazioni delle norme: numero di kit Std/Ctrl, nome kit Std/Ctrl, scadenza e produttore.
- Chiave nel valore di altissimo livello per ciascun analita (cioè 10000 pg/mL). Chiave in 5 sotto diluizione e fare clic su " applica tutti " per generare automaticamente le concentrazioni previste per il resto delle norme.
- Clic " salvare ".
- Crea un nuovo Batch da un protocollo esistente
- aperto il ' batch ' pagina e fare clic su " creare una scheda di nuovo Batch da un protocollo esistente ".
- Digitare il nome del batch nel ' nome Batch ' casella e digitare una descrizione sul batch nella ' descrizione facoltativa immettere ' casella.
- Fare clic sul protocollo generato in precedenza (nel passaggio 1.5.3).
- Fare clic " NextŔ scheda successiva che si apre è la ' Stds & Ctrls ' Tab. visualizzare i dettagli delle norme di test e selezionare " prossimo ".
- Sui ' piastra Layout ' scheda, assegnare comandi ben per questo batch e fare clic su " salvare " per salvare le informazioni di batch per il ' Batch in sospeso ' elenco.
- Caricare la piastra nel lettore della piastra di perlina basato su analisi multiplex, scuoterlo per 5 min ed eseguire il batch dall'elenco batch in sospeso. I dati acquisiti verranno salvati nel formato di file con estensione CSV.
- Analisi dei dati
- convertire file CSV generato dal software di analisi multiplex perlina basato nel formato di file (file di dati di risultati). RBX utilizzando il software di conversione rbx. Avviare il software di conversione, selezionare il file CSV sotto xPONENT selezionare file e fare clic sul " generare " pulsante; il file. RBX verrà salvato nella cartella di output selezionato.
- Avviare il software di analisi e aprire il file. RBX.
- Ottimizzare le curve standard utilizzando la curva 4PL/5PL.
- Selezionare le opzioni seguenti nella ' curva Standard ' scheda: ' tipo di regressione ': ' Logistic-5PLƆ ' asse trasformazione ': ' log (x) - tick Ɔ lineare (y) il ' Mostra linee di gamma Conc ' scatola; spuntare il ' Show sconosciuto Campioni ' scatola; Spuntare il ' campioni di controllo Visualizza ' scatola; Spuntare il ' applica attraverso tutti gli analiti ' scatola; spuntare il ' Visualizza rapporto dopo l'ottimizzazione ' casella.
- Scegliere la " ottimizza " pulsante per auto-ottimizzazione.
- Etichettare le identità di campione sotto ' immettere campione Info ' Tab.
- Ottenere le concentrazioni osservate nel ' Report tabella ' scheda e fare clic su " esportare report tabella " per generare i dati in un file di foglio di calcolo per ulteriori analisi.
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Representative Results
Lacrima campioni sono stati raccolti da 8 occhi di 4 soggetti sani utilizzando strisce di flusso lacrima e livelli di citochina sono stati analizzati utilizzando il protocollo di cui sopra. Tutti gli oggetti erano maschi e l'età delle quattro materie era 36, 42, 44 e 52 anni rispettivamente. Salute di superficie oculare e l'occhio asciutto la malattia è stata valutata da test clinici (lacrima film break up tempo, di Schirmer test, colorazione corneale, colorazione congiuntivale, esame della ghiandola meibomian/coperchio, lacerazione corneale segni e segni visivi e sintomi) secondo la Workshop internazionale di occhio secco, linee guida 2007 e nessuno dei soggetti ha mostrato segni e sintomi della malattia dell'occhio secco. 31
Fuori le 41 citochine analizzate, 31 citochine sono stati rilevati in tutti i campioni di lacrima, IL-17A, MIP-1 β e TNF-α sono stati rilevati in 7 occhi di 4 soggetti, IL-4 è stato rilevato in 6 occhi di 4 soggetti, IFN-γ è stato rilevato in 6 occhi di 3 soggetti, IL-1A è stato rilevato in 5 occhi di cong 3 ECTS, eotaxin e IL-9 sono stati rilevati in 3 occhi di 2 soggetti, IL-3 è stato rilevato in 1 occhio e MIP-1 α in nessuno dei campioni. Le concentrazioni di media ± SD di 41 citochine rilevate in soggetti sani usando analisi multiplex perlina basata (Figura 2) sono state menzionate nella tabella 2. Fuori di 41 citochine analizzate, IL-1ra è stato trovato per essere altamente espresso in tutti i campioni con la media ± SD di 203.9 ± 52,6 ng/mL e variava da 129.64 ng/mL a 271.7 ng/mL. Le citochine IP-10, GRO, MCP-1, PDGF-AA, fractalchina, IL-8, EGF, PDGF-BB, VEGF e G-CSF sono stati anche altamente espressi (quantità di ng/mL) nelle lacrime di soggetti sani e le citochine rimanenti sono stati espressi in quantità di pg/mL (tabella 2). La concentrazione minima misurata di lacrima citochina TNF-α si trovava con la media ± SD di 27.25 ± 19.97 pg/mL e variava da 10.75 pg/mL a 56.02 pg/mL. In 31 citochine che sono state rilevate in tutti i campioni, nessun hanno mostrato una differenza statisticamente significativa nella concentrazione (p> 0.05) tra l'occhio destro e sinistro da t-test (Figura 3).
Figura 1: diagramma di flusso schematico di lacrima cytokine profilatura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: strappare profili di cytokine in persone sane. Tear rappresentante scatterplot mostrando il registro media ± concentrazioni SD di 41 citochine in campioni prelevati da soggetti sani. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Inter-occhio lacrima cytokine profilo differenze negli individui sani. Rappresentante scatterplot non risultati nessuna differenza statisticamente significativa (p> 0.05) in concentrazioni medie Inter-occhio di 31 strappare citochine in soggetti sani. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| S. n. | Analiti | Regione della perla |
| 1 | FEG | 12 |
| 2 | FGF-2 | 13 |
| 3 | Eotaxin | 14 |
| 4 | TGF-Α | 15 |
| 5 | G-CSF | 18 |
| 6 | FLT - 3L | 19 |
| 7 | GM-CSF | 20 |
| 8 | Fractalchina | 21 |
| 9 | IFNΑ2 | 22 |
| 10 | IFNΓ | 25 |
| 11 | GRO | 26 |
| 12 | IL-10 | 27 |
| 13 | MCP-3 | 28 |
| 14 | IL - 12P 40 | 29 |
| 15 | MDC | 30 |
| 16 | IL - 12P70 | 33 |
| 17 | PDGF-AA | 34 |
| 18 | IL-13 | 35 |
| 19 | PDGF-AB/BB | 36 |
| 20 | IL-15 | 37 |
| 21 | sCD40L | 38 |
| 22 | IL-17A | 39 |
| 23 | IL-1RA | 42 |
| 24 | IL-1 Α | 44 |
| 25 | IL-9 | 45 |
| 26 | IL-1 Β | 46 |
| 27 | -2 | 48 |
| 28 | IL-3 | 51 |
| 29 | IL-4 | 53 |
| 30 | IL-5 | 55 |
| 31 | IL-6 | 57 |
| 32 | IL-7 | 61 |
| 33 | IL-8 | 63 |
| 34 | IP-10 | 65 |
| 35 | MCP-1 | 67 |
| 36 | MIP-1 Α | 72 |
| 37 | MIP-1 Β | 73 |
| 38 | RANTES | 74 |
| 39 | TNFΑ | 75 |
| 40 | TNFΒ | 76 |
| 41 | VEGF | 78 |
Tabella 1: Degli analiti nomi e dettagli di regione corrispondenti perlina.
| S. n. | Citochina | Numero di occhi | Numero di soggetti | Le concentrazioni medie | SD |
| 1 | FEG | 8 | 4 | 2610.29 | 1711.56 |
| 2 | Eotaxin | 3 | 2 | 404.73 | 260.76 |
| 3 | FGF-2 | 8 | 4 | 827.73 | 262.44 |
| 4 | FLT - 3L | 8 | 4 | 475,4 | 133,6 |
| 5 | Fractalchina | 8 | 4 | 4179.08 | 1888.38 |
| 6 | G-CSF | 8 | 4 | 1287.57 | 633.16 |
| 7 | GM-CSF | 8 | 4 | 93.03 | 28.1 |
| 8 | GRO | 8 | 4 | 23176.87 | 18692.07 |
| 9 | IFNa2 | 8 | 4 | 641,4 | 253.55 |
| 10 | IFNg | 6 | 3 | 76,6 | 42.81 |
| 11 | IL-10 | 8 | 4 | 101.32 | 41.52 |
| 12 | IL-12 p40 | 8 | 4 | 245.46 | 133.01 |
| 13 | IL-12 |
Tabella 2: Strappare profili di cytokine negli individui sani. Concentrazioni ± SD, di 41 citochine rilevate in soggetti sani usando analisi multiplex perlina basato.
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Discussion
Le citochine sono piccole proteine secrete cellulare e potenti modulatori immuni regolazione della risposta immunitaria. 32 i profili di espressione di varie citochine in campioni collegati alle varie circostanze patologiche dell'occhio e studi sulla citochina profili aiutano a capire i meccanismi della patogenesi della malattia, determinare lo stato di salute oculare, lacrima la gravità della malattia, la diagnosi e la progressione. 2 , Piccolo campione volumi e concentrazioni più basse di proteina 5 sono le principali sfide dei metodi tradizionali, limitando l'uso di dosaggi come ELISA per l'analisi dei profili di cytokine di lacrima. 33 analisi multiplex perlina basato sono test immunologici, che hanno chiari vantaggi rispetto a ELISA. Analisi multiplex perlina basato richiedono più piccoli volumi di campione per l'analisi di più analiti e sono altamente sensibile, capace di rilevare concentrazioni picogrammo di proteine nei liquidi biologici. 34
Qui segnaliamo un protocollo standardizzato per l'analisi quantitativa di 41 lacrima citochine in persone sane usando analisi multiplex perlina basato. Fuori le 41 citochine nel pannello, analisi multiplex perlina basato rilevato 40 citochine in campioni di lacrima e non ha potuto rilevare MIP-1 α. Questo risultato negativo potrebbe essere perché c'erano i livelli inosservabili di MIP-1 α in campioni di sano lacrima o a causa di un minor volume di lacrime. Lacrima campioni raccolti utilizzando strisce di Schirmer hanno un vantaggio rispetto ad altri metodi di raccolta come microcapillary tubo e spugne. Per esempio, in diverse condizioni cliniche, volume fluido dello strappo può essere misurato da strisce di Schirmer e lo strappo fluido può essere eluito dalla stessa striscia dopo misurazione e utilizzato per l'analisi di cytokine. 35 anche se microcapillary tubi sono abitualmente utilizzati per raccogliere le lacrime e produrre più coerente lacrima profili, la procedura richiede più tempo rispetto al metodo di striscia, è più noiosa e può essere scomoda per i bambini e altri pazienti. Inoltre, questo metodo può anche indurre il riflesso della lacrimazione toccando la congiuntiva e produrre risultati variabili di profili di cytokine rispetto al basale lacrime, influenzando di conseguenza la riproducibilità del dosaggio. 36 in alcune condizioni cliniche come malattia dell'occhio asciutta, raccolta campione lacrimale di Schirmer strisce è affidabile per l'analisi della proteina e aiuta nell'identificazione di biomarcatori. 37 , 38
Analisi multiplex perlina basato sono una combinazione di citometria a flusso ed ELISA multiplex in cui analiti nel campione sono intramezzati fra l'anticorpo specifico e colore codificati biglie magnetiche o microsfere e biotinilati anticorpo di rilevazione. Questi complessi possono essere rilevati aggiungendo il reporter molecola streptavidina-ficoeritrina (PE) coniugato e l'esposizione successiva ad un sistema di doppio laser in uno strumento di base di citometria a flusso modificate. 39 in un sistema dual laser, un laser eccita le tinture interne e relativo segnale rappresenta l'anticorpo specifico rivestito. Il laser secondo eccita il coniugato di molecola PE report associato per l'anticorpo di rilevazione complessa e l'intensità dei segnali rappresentano la concentrazione dell'analita.
La capacità delle microsfere di essere codificati con coloranti di diversa intensità attivare l'analisi rilevare fino a 100 diversi analiti in un piccolo volume di campione in un singolo pozzo. 39 se perlina base analisi multiplex sono rapido, riproducibile e paragonabile a saggi ELISA standard,34,40 questo metodo richiede strumenti dedicati, valutazione dei kit e la standardizzazione dei protocolli per vari campioni biologici. 39 la presenza di autoanticorpi nei campioni clinici può influenzare i risultati di multiplex perlina basato. 34 , 39 per uso sistematico di queste analisi in ambito clinico, si consiglia di utilizzare i corredi di analisi da un produttore specifico. La sensibilità, il rilevamento di concentrazioni assolute di citochine e di riproducibilità sono stati segnalati per variare con i diversi kit. Microarrays dell'anticorpo 41 o membrana microarrays sono altamente sensibili, tecniche poco costoso alternativa elevato throughput rilevare analiti multiple in un piccolo volume di campioni e possono essere applicati con successo su lacrima campioni per l'analisi di citochine e altre proteine. 35 , 42 tuttavia, numerose limitazioni esistono, come queste analisi sono termini, semi quantitativo di tempo, presentano un elevato rapporto segnale-rumore e la mancanza di protocolli standardizzati. 19 , 43
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare. Alcun interesse finanziario o conflitti di interesse.
Acknowledgments
Il lavoro di ricerca è stato sostenuto dalla sovvenzione centro Tan Tock Seng Hospital personalizzato sementi finanziamento programma 2015; Singapore Eye Research Institute pilota Grant e Tan Tock Seng Hospital Pitch per fondo di concedere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit | Merck, USA | HCYTOMAG-60K-41 | |
| Flexmap 3D luminex instrument | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| xPonent software | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| RBXGenerator software | BIO-RAD, France | ||
| Bio-Plex Manager 6.1 | BIO-RAD, France | ||
| Plate shaker | Corning, USA | ||
| TECAN Microplate Washer | Tecan, Switzerland | HydroSpeed | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries inc, USA | G560E | |
| Pipettes | Mettler Toledo, CA, USA | ||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Axygen, USA | MCT-150-C | |
| Schirmer tear flow test strip | Eye Care and Cure, USA | 101657 | |
| Flexmap 3D Calibration Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-028 | |
| Flexmap 3D Verfication Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-029 | |
| Ocular examination chair |
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