Summary
Analyse av tåre filmen cytokiner hjelper i å studere ulike øyet sykdommer. Perle basert multiplex analyser er enkel og følsom og aktiverer testing av flere mål i prøver med små volumer. Her beskriver vi en protokoll for rive filmen cytokin profilering en med perle basert multiplex analysen.
Abstract
Rive filmen er en kompleks blanding av lipider, proteiner og mineraler som dekker den ytre overflaten av øyet, og dermed gir smøring, ernæring og beskyttelse til de underliggende cellene. Analyse av tårer er en voksende område for identifikasjon av biomarkers for prediksjon, diagnose og prognosen for ulike øyet sykdommer. Tårer er lett tilgjengelig og deres samling er ikke-invasiv. Derfor er fremmarsj teknologier økende innflytelse for identifikasjon av flere analytter i tårer å studere endringer i proteiner eller metabolitten komposisjon og dets tilknytning til pathological betingelser. Rive cytokiner er ideelle biomarkers for å studere helse okulær overflaten og også hjelpe forstå mekanismene av ulike okulær overflaten lidelser som tørre øyne-sykdom og vernal konjunktivitt. Perle basert multiplex analyser har evnen til å oppdage flere analytter i en liten mengde utvalg med en høyere følsomhet. Beskriver her vi standardiserte protokollen tåreoppsamling utvalg, utvinning og analyse av cytokin profilering bruker en perle basert multiplex analysen.
Introduction
Tårer er produsert av lacrimal kjertel og tilbehør kjertler og strøk den ytre overflaten av øyet. Rive filmen består av en ytre lipid lag og en indre vandig lag som inneholder løselig proteiner, mucins og membran bundet mucins. Tårer hindre mikrobiell invasjon, levere næringsstoffer og gir smøring på okulær overflaten. Tårer fungere som et grensesnitt mellom luften og vev for oksygen-transport til hornhinnen. 1 tåre filmen består av proteiner, karbohydrater, lipider og elektrolytter. Tilknytningen mellom tåre proteiner med okulær og systemiske sykdommer som glaukom, tørre øyne-sykdom, vernal konjunktivitt, diabetes mellitus, skjoldbrusk-assosiert orbitopathy og kreft er funnet i flere studier. 2 , 3 , 4 tåreprøver kan samles ved microcapillary rør eller rive flyt strimler (Schirmer strimler). I tillegg er til Schirmer test en standard prosedyre utføres i hornhinnen og refraktiv kirurgi klinikker, resultatene som kan brukes til cytokin analyse analyser. Ikke-invasive prøvetaking, tilgjengelighet av bio-prøven og foreningen av tåre komposisjon med ulike fysiologiske og patologiske forhold gjør rive filmen en potensiell kilde til biomarkers for flere okulær og systemiske sykdommer. 4 , 5 , 6
Rive cytokiner spiller en viktig rolle i å studere okulær overflaten helse og inflammatoriske tilstander av ulike øyet sykdommer. 7 unormal konsentrasjoner av flere cytokiner i tåreprøver ble rapportert å være assosiert med tørre øyne-sykdom, vernal keratoconjunctivitis (VKC), atopisk keratoconjunctivitis (AKC), sesongmessige allergisk konjunktivitt og uveitis. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 tåre proteiner kan analyseres av tradisjonelle metoder som massespektrometri, vestlige blotting og enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISA). 14 , 15 men begrensningene for disse metodene er dårlig følsomhet og et større volum av prøve kreves for analyse av flere tåre cytokiner i hver pasient. 16 , 17 perle basert multiplex analyser har blitt utviklet for å analysere flere analytter i kompleks blanding prøvene og brukt på rive prøver å analysere flere cytokiner i ulike sykdommer. 6 , 18 A kombinasjon av sandwich ELISA og flyt cytometri teknikker gjør disse analyser blir mer følsom enn ELISA for kvantifisering av flere analytter i en enkelt prøve. 19 denne metoden kan brukes på en rekke kliniske prøver og celle kultur supernatants og hjelper i studiet av immunreaksjoner i flere patofysiologiske forhold. 20 , 21 , 22 , 23 , 24
Det er flere studier sammenligne perle basert multipleks søk med ELISA og har rapportert en sammenheng mellom metodene. Do et al. sammenlignet perle basert multiplex analysen med konvensjonelle ELISA for påvisning av adiponectin, resistin, leptin og ghrelin i prøver fra mennesker serum- eller og rapportert en sterk sammenheng (r > 0,9) mellom analyser. 25 Dupont et al. rapportert en sterk sammenheng mellom perle basert multiplex analyser og ELISA for påvisning av IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ og TNF-α phytohemagglutinin og lipopolysakkarid stimulert fullblod samlet fra gravide. 26 Pickering et al. rapportert en sterk sammenheng mellom perle basert multiplex analysen og ELISA for påvisning av serum antistoffer mot Haemophilus influensa type b polysakkarid (r = 0.96), toxoids av Clostridium tetani (r = 0.96), og Corynebacterium diphtheriae (r = 0,91). 27 Biagini et al. rapportert en høy positiv korrelasjon (r = 0.852) mellom perle basert multiplex analysen og ELISA deteksjon av Bacillus anthracis anti-PA IgG i serumprøver. 28 Wang et al. rapportert en sammenheng mellom perle basert multiplex analysen og ELISA for påvisning av Alzheimers biomarkers amyloid-β 42 (r = 0.77), totalt tau (r = 0,94), og tau fosforylert på aminosyre 181 (r = 0,82) i Cerebrospinalvæske prøver. 29 disse studiene har vist anvendelse av perle basert multiplex analyser på rekke kliniske prøver, mindre utvalg volumkrav og en sammenheng med standard ELISA, som gjør perle basert multiplex analyser en lovende alternativ til tradisjonelle ELISA metoder for påvisning av flere analytter i forskjellige typer prøver forskjellige sykdommen fenotyper. Her beskriver vi en standardisert protokoll for perle basert multiplex analysen for cytokin profilering for 41 analytter i tåreprøver fra sunn fag med Schirmer strimler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
protokollene som brukes i denne studien var godkjent av institusjonelle gjennomgang styret Tan takk Seng Hospital, Singapore.
1. Riv cytokin analyse
- samling av tårer:
- be personen(e) som sitter komfortabelt på en undersøkelse stol og plassere hodet mot nakkestøtten.
- Spør emnet å slå opp, nøye åpne Schirmer strimler (laget av Whatman filter papir nr 41) og plassere avrundet slutten av stripen på de underlegne fornix av øyet og instruere forbehold for å lukke øynene for 5 min. Samle tårer ta stor forsiktighet for å minimere okulær overflate kontakt. 30
- spør emnet til å åpne sine øyne for å fjerne stripen og sted den inne en bakteriefri 1.5 mL microcentrifuge tube. Øyeblikkelig overføre røret laboratorium eller butikken på-80 o C til testing av cytokin profilering.
- Elueringsrør av tåre prøve fra rive flyt strip:
- kuttet tåre flyt stripen til en lengde på 0,5 cm (å standardisere mengden av tårer å bli testet) og sted den inne en bakteriefri 1.5 mL microcentrifuge tube.
- Legge til 30 µL av analysen buffer og ruge ved romtemperatur for 5 min etterfulgt av sentrifugering røret 14.000 x g i 1
- Overføre nedbryting til en annen 1,5 mL microcentrifuge rør og kast stripen. Plasser prøven med røret på is og bruke elut rive prøven umiddelbart for cytokin profilering.
- Forberedelse av reagenser:
Merk: førti en analytter skal testes i hvert utvalg av perle basert multiplex analysen er interleukin (IL)-1α, IL-1β, IL-Rα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, interferon-alfa (IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-gamma-induserbart protein 10 (IP-10, CXCL10) macrophage-avledet chemokine (MDC), macrophage inflammatorisk protein (MIP)-1α og MIP-1β, monocyte chemotactic protein (MCP) -1, MCP-3, tumor nekrose faktor-alfa (TNF-α), TNF-β, vekst regulert oncogene (GRO), tumor vekst faktor alpha (TGF-α), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), epidermal vekstfaktor (EGF), fibroblast vekstfaktor (FGF) -2, Platederivert avledet vekst faktor (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, granulocytt koloni-stimulerende faktor (G-CSF), granulocytt-macrophage koloni-stimulerende faktor (GM-CSF), eotaxin, fractalkine, løselig CD40 ligand (sCD40L), Fms-lignende Tyrosin kinase 3 ligand (Flt - 3L) og regulert ved aktivering, normal T-celle uttrykt og utskilles protein (RANTES).- Bringe antistoff perle løsning (50 X) hetteglass romtemperatur (20-25 o C) og vortex ampullene i 1
- Antall strimler som kreves for analysen og beregne antallet for totalt antistoff perle cocktail løsning (25 µL per brønn) og hver antistoff perle løsning (50 X) kreves for analysen.
- Forberede cocktail løsningen ved å legge det beregnede beløpet av hver antistoff perle løsning og fyll til ønsket endelige volumet ved å legge restbeløpet til perle fortynner. Kontroller at den siste konsentrasjonen av hver antistoff cocktail er 1 X. Alltid forberede minst 20% ekstra volum cocktail løsning ved pipettering feil.
Merk: Som et eksempel for en 96-brønns analysen forberede 3000 µL av antistoff perle cocktail løsning. Den nødvendige mengden av hver antistoff perle løsning = 3000/lager konsentrasjon av hver antistoff perle løsning; 3000/50 = 60 µL av hver antistoff perle løsning- Legg til 60 µL av hver av de 41 antistoff perle løsningene (60 X 41 = 2460 µL) i en cocktail flaske og legge 540 µL av perle fortynningsmiddel løsning til antistoff perle blandingen å gjøre 3000 µL av finalen fungerende løsning (1 X).
- Før bruk, bland perle cocktail løsningen riktig. Etter analysen lagre gjenværende volumet på 2-8 o C i opptil 30 dager.
- Forberede kvalitetskontroll (QC) ved å legge til 250 µL vaskebuffer vann QC 1 og QC 2.
- Blande riktig invertere flaskene flere ganger og vortex for 10 s. overføring løsningen på riktig merket polypropylen microcentrifuge rør og lagre gjenværende løsningen ved 20 ° C som kan brukes i opptil 30 dager.
- Forberede vaskebuffer ved å legge til 270 mL vaskebuffer vann 30 mL 10 X vask buffer løsning og bland godt (før fortynning, bringe 10 X bufferen til romtemperatur og oppløse alle salt precipitates ved å blande). Lagre den ubrukte vaskebuffer (1 X) på 2-8 ° C som kan brukes i opptil 30 dager.
- Forberede menneskelige cytokin standard lager (10 000 pg/mL av alle analytter) ved å legge til 250 µL vaskebuffer vann lager ampullen. Bland godt ved å snu flere ganger og vortex ampullen for 10 s. la den stå i 10 min og overføre lager løsningen korrekt merket polypropylen microcentrifuge rør. Etter analysen, lagre gjenværende løsningen ved 20 ° C, som kan brukes i opptil 30 dager.
- Forbered arbeidet menneskelige cytokin standarder ved 5-fold føljetong fortynninger (50 µL - > 200 µL) med analysebuffer å få 2000 400, 80, 16 og 3,2 pg/mL.
- Etter standard forberedelse, bruke arbeider standarder innen 60 min og bruke analysebuffer som Tom/bakgrunn (-pg/mL).
- Cytokin profilering av perle basert multiplex analysen:
- bringe reagenser til romtemperatur og vortex for 5-10 sekunder før du legger dem til 96-brønnen microtiter plate. Hvis elut tåre-prøvene er lagret på-80 o C før analysen, tine frosne tåre ekstrakter på is og sentrifuge 1000 X g for 5 min.
- Forbereder en analysen arbeidsseddel i en loddrett konfigurasjon for arbeid menneskelige cytokin standarder [0 (null), 3.2, 16, 80, 400, 2000 og 10.000 pg/mL], DC1 QC2 og smakebiter.
- Legge til 200 µL av 1 X vaskebuffer hver godt av platen, forsegle den med plate sealer og holde den på en plate shaker ved romtemperatur (20-25 o C) for 10 min.
- Dekanter av 1 X vaskebuffer ved å snu platen og trykk det på absorberende håndklær flere ganger for å fjerne eventuelle gjenværende mengden av vaskebuffer i brønnene.
- Legge til 25 µL av hver arbeider menneskelige cytokin standard, DC1, QC2, tom (analysebuffer) og prøver ned i aktuelle brønnene.
- Legge til 25 µL av analysebuffer i hver brønn.
- Legge til 25 µL 1 X antistoff perle cocktail løsning i hver brønn. Antistoff perle løsningen er følsomt for lys, forsegle platen med plate sealer og dekke det med aluminiumsfolie å beskytte den mot lys under analysen.
- Ruge platen ved 4 o C over natten på en shaker.
- Plasser platen på plate rack med en automatisk magnetisk plate skive. La det sitte i 1 min å avgjøre de magnetiske perlene nederst i brønnen og Sug opp godt innholdet. Legge til 200 µL av vaskebuffer per godt og la den sitte i 1 min og deretter Sug opp godt innholdet. Gjenta vask igjen (Følg utstyr produsenten for plate vasking, ' s instruksjoner).
- Legge til 25 µL av gjenkjenning antistoffer løsning i hver Vel, forsegle plate dekke det med aluminiumsfolie og ruge ved romtemperatur for 60 min på en shaker.
- Legge til 25 µL av Streptavidin-Phycoerythrin løsning i hver brønn, forsegle platen, dekke det med aluminiumsfolie og ruge ved romtemperatur for 30 min på en shaker.
- Plasser platen på en magnetisk plate vaskemaskin. La den sitte i 1 min og deretter Sug opp godt innholdet. Legge til 200 µL av vaskebuffer per brønn. La den sitte i 1 min og deretter Sug opp godt innholdet. Gjenta vask igjen.
- Legge til 150 µL skjede væske hver vel og Plasser platen på en shaker i 5 minutter ved romtemperatur å resuspend antistoff perlene.
- Lese platen umiddelbart med perlen basert multiplex analysen plate leseren og analysere de cytokin konsentrasjonene benytter en 5-parameteren Kurvetilpasning algoritmen. En skjematisk sekvensdiagram for rive cytokin profilering er vist i figur 1.
- Lese analysen plate (instrument definert) og dataanalyse:
- slå på perlen basert multiplex analysen leseren og pre varme laseren for 30 min.
- Starter perle basert multiplex analysen programvaren. Under den ' automatiserte vedlikehold ' kategorien velger den ' kalibrering-bekreftelse ' alternativet. Vortex hver reagens medisinglass av kalibrering og verifisering perler for 30 s. sted 5 dråper hver reagens i de angitte brønnene. Fyll de angitte reservoarene med deionisert vann og 70% etanol.
- Opprett en ny protokoll
- åpne den ' protokoller ' siden og så den ' protokoller ' tab. falle i staver " opprette ny ProtocolŔ den ' innstillinger ' kategorien åpnes.
- i det ' navnet ' skriver du inn navnet på protokollen.
- Skriv inn en beskrivelse i boksen til høyre for det ' navnet ' boksen.
- i det ' versjon ' Skriv inn versjon av protokollen som.
- i den ' produsent ' skriver du inn informasjonen for protokollen.
- Definere innstillingene i den ' oppkjøpet innstillinger ' seksjonen som følger. Angi ' Volume ': 100 µL ' tidsavbrudd ': 60 s; ' DD Gating ': 8000 til 15.000; ' Reporter gevinst ': Standard innbetaling; ' Perle type ': magnetisk perle.
- Definere innstillingene i den ' innstillinger ' delen, velge ' kvantitativ ' som analysetypen. Angi ' rekke standarder ': 6; ' Antall kontroller ': 0; Kryss den ' mener av replikerer ' boksen;
Kryss den ' analysere resultatene mens anskaffe prøver ' boksen. - Klikk " NextŔ den ' analytter ' kategorien åpnes, klikk på ønsket analytter (perle ID) i nummererte analytt rutenettet.
- Klikk og skriv den tilsvarende analytt navn i det ' navnet ' kolonnen til høyre for analytt rutenettet (analytter ' navn og tilhørende perle regionen detaljer ble nevnt i tabell 1).
- Klikk og skriv inn den ønskede måleenheten (i.e. pg/mL) i den ' enheter ' boksen til venstre for den ' bruke alle ' knappen. Klikk " bruke alle ".
- Klikk og skriv ønsket perle greven for hver analytt (dvs. 50) i det ' teller ' boksen. Klikk " bruke alle ".
- Klikk " NextŔ Plate layouten tab åpner. Markere brønnene for standarder, og velg " 2 " under replikere teller og klikk på den " S " Standard-knapp. Gjenta dette trinnet for bakgrunnen " B " og prøver " U " brønner.
- Klikk " lagre ".
- Opprette nye standarder/kontroll mye
- åpne den ' protokoller ' siden og så den ' standarder & kontroller ' tab. falle i staver " opprette ny Standard/kontroll mye ".
- Åpen det ' Velg protokollen ' boksen. Velg protokollen som ble opprettet i trinn 1.5.3.
- Nøkkel informasjon av tilsvarende: Std/Ctrl kit nummer Std/Ctrl kit navn, utløpsdato og produsenten.
- Nøkkel i verdien av den høyeste standarden for hver analytt (i.e. 10000 pg/mL). Inntaste 5 under fortynning og klikk på " bruke alle " automatisk generere forventet konsentrasjonen for resten av standardene.
- Klikk " lagre ".
- Opprette en ny gruppe fra en eksisterende protokollen
- åpne den ' grupper ' siden og klikk " opprette en ny satsvis fra en eksisterende protokoll ".
- Skriver kladdenavnet i den ' Bunkenavn ' boks og skriv inn en beskrivelse av den satsvise jobben i den ' angi valgfri beskrivelse ' boksen.
- Klikk på protokollen generert tidligere (i trinn 1.5.3).
- Klikk " NextŔ neste kategorien som åpnes, er den ' Kjønnssykdommer & Ctrls ' kategorien vise detaljene for analysen standarder og velg " neste ".
- På den ' Plate Layout ' kategorien, tilordne godt kommandoer for denne kjørselen, og klikk " lagre " lagre satsvise informasjonen til den ' venter satsvis ' listen.
- Laste inn platen i perle basert multiplex analysen plate leseren og rist den for 5 min kjøre den satsvise jobben fra listen over ventende satsvise. Data ervervet lagres i CSV-filformatet.
- Dataanalyse
- konvertere CSV-fil som er generert fra perle basert multiplex analysen programvare til .rbx (resultater datafiler)-filformatet ved hjelp av rbx konvertering programvare. Start konvertering programvare, Velg CSV-filen under Velg xPONENT fil(er) og klikk på den " generere " knappen; .rbx filen vil bli lagret i mappen valgte output.
- Start analyseprogramvare og åpne filen .rbx.
- Optimalisere standard kurvene bruker 4PL/5PL kurve.
- Velg følgende i den ' standardkurve ' kategorien: ' regresjon Type ': ' Logistic-5PLƆ ' akse transformasjon ': ' Log(x) - lineær (y) Ɔ sjekke det ' Vis Kons utvalg linjer ' boksen; sjekke den ' Vis ukjent Prøver ' boksen; Kryss den ' Vis kontroll prøver ' boksen; Kryss den ' bruk på tvers av alle analytter ' boksen; kryss den ' Vis rapport etter optimalisering ' boksen.
- Klikk på " Optimaliser " knappen for auto-optimalisering.
- Merke eksempel identiteter under ' inn utvalg Info ' kategorien
- Få de observerte konsentrasjonene i den ' tabellen til rapporten ' kategorien og klikk på " rapporten dataeksporttabellen " generere data i en regnearkfil for videre analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Innhentet tåreprøver fra 8 øynene til 4 sunn fag ved hjelp rive flyt strimler og cytokin nivåer ble analysert ved hjelp av ovennevnte protokollen. Alle fag var mannlige og en alder av fire fagene var 36, 42, 44 og 52 år henholdsvis. Okulære overflaten helse og tørre øyne sykdom ble evaluert av kliniske tester (rive filmen bryte opp tid, Schirmerfamiliens test, hornhinnen flekker, conjunctival flekker, lokket/meibomian kjertel eksamen, hornhinnen tåre tegn og visuelle tegn og symptomer) i henhold til den International tørre øyne Workshop 2007 retningslinjer og ingen av de viste noen tegn og symptomer på tørre øyne-sykdom. 31
Ut av 41 cytokiner analysert, ble 31 cytokiner oppdaget i alle tåre prøvene, IL-17A, MIP-1β og TNF-α ble oppdaget i 7 øynene til 4 fag, IL-4 ble oppdaget i 6 øynene til 4 fag, IFN-γ ble oppdaget i 6 øynene til 3 fag, IL-1A ble oppdaget i 5 øynene til 3 subj ECTS, eotaxin og IL-9 ble oppdaget i 3 øynene til 2 fag, IL-3 ble oppdaget i 1 øye og MIP-1α ingen prøvene. Gjennomsnittlig ± SD konsentrasjonen av 41 cytokiner oppdaget i sunn fag med perle basert multiplex analysen (figur 2) ble nevnt i tabell 2. Ut av 41 cytokiner analysert, ble IL-1ra funnet å være svært uttrykt i alle prøvene med gjennomsnittlig ± SD 203.9 ± 52.6 ng/ml og varierte fra 129.64 ng/mL til 271.7 ng/mL. Cytokiner IP-10, GRO, MCP-1, PDGF-AA, Fractalkine, IL-8, EGF, PDGF-BB, VEGF og G-CSF var også svært uttrykt (ng/mL kvanta) i tårer av friske og gjenværende cytokiner ble uttrykt i pg/mL mengder (tabell 2). Laveste målt konsentrasjonen av tåre cytokin var TNF-α med gjennomsnittlig ± SD 27.25 ± 19.97 pg/ml og varierte fra 10.75 pg/mL til 56.02 pg/mL. I 31 cytokiner som ble oppdaget i alle prøvene, ingen viste en statistisk signifikant forskjell i konsentrasjon (p> 0,05) mellom høyre og venstre øyet av t-test (Figur 3).
Figur 1: skjematisk sekvensdiagram for rive cytokin profilering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: rive cytokin profiler i friske mennesker. Representant scatterplot viser logg gjennomsnittlig ± SD konsentrasjoner av 41 cytokiner i rive prøver fra friske. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: mellom øyet slitasje cytokin profil forskjeller i friske. Representant scatterplot viser ingen statistisk signifikant forskjell (p> 0,05) mellom øyet mener konsentrasjonene av 31 rive cytokiner i friske. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| S. nr. | Analytter | Perle-regionen |
| 1 | EGF | 12 |
| 2 | FGF-2 | 13 |
| 3 | Eotaxin | 14 |
| 4 | TGF-Α | 15 |
| 5 | G-CSF | 18 |
| 6 | Flt - 3L | 19 |
| 7 | GM-CSF | 20 |
| 8 | Fractalkine | 21 |
| 9 | IFNΑ2 | 22 |
| 10 | IFNΓ | 25 |
| 11 | GRO | 26 |
| 12 | IL-10 | 27 |
| 13 | MCP-3 | 28 |
| 14 | IL - 12P 40 | 29 |
| 15 | MDC | 30 |
| 16 | IL - 12P 70 | 33 |
| 17 | PDGF-AA | 34 |
| 18 | IL-13 | 35 |
| 19 | PDGF-AB/BB | 36 |
| 20 | IL-15 | 37 |
| 21 | sCD40L | 38 |
| 22 | IL-17A | 39 |
| 23 | IL-1RA | 42 |
| 24 | IL-1Α | 44 |
| 25 | IL-9 | 45 |
| 26 | IL-1Β | 46 |
| 27 | IL-2 | 48 |
| 28 | IL-3 | 51 |
| 29 | IL-4 | 53 |
| 30 | IL-5 | 55 |
| 31 | IL-6 | 57 |
| 32 | IL-7 | 61 |
| 33 | IL-8 | 63 |
| 34 | IP-10 | 65 |
| 35 | MCP-1 | 67 |
| 36 | MIP-1Α | 72 |
| 37 | MIP-1Β | 73 |
| 38 | RANTES | 74 |
| 39 | TNFΑ | 75 |
| 40 | TNFΒ | 76 |
| 41 | VEGF | 78 |
Tabell 1: Analytter navn og tilsvarende perle regionen detaljer.
| S. nr. | Cytokin | Antall øyne | Antall fag | Mener konsentrasjoner | SD |
| 1 | EGF | 8 | 4 | 2610.29 | 1711.56 |
| 2 | Eotaxin | 3 | 2 | 404.73 | 260.76 |
| 3 | FGF-2 | 8 | 4 | 827.73 | 262.44 |
| 4 | Flt - 3L | 8 | 4 | 475.4 | 133.6 |
| 5 | Fractalkine | 8 | 4 | 4179.08 | 1888.38 |
| 6 | G-CSF | 8 | 4 | 1287.57 | 633.16 |
| 7 | GM-CSF | 8 | 4 | 93.03 | 28,1 |
| 8 | GRO | 8 | 4 | 23176.87 | 18692.07 |
| 9 | IFNa2 | 8 | 4 | 641.4 | 253.55 |
| 10 | IFNg | 6 | 3 | 76.6 | 42.81 |
| 11 | IL-10 | 8 | 4 | 101.32 | 41.52 |
| 12 | IL-12 p40 | 8 | 4 | 245.46 | 133.01 |
| 13 | IL-12 |
Tabell 2: Rive cytokin profiler i friske. Mener ± SD konsentrasjoner av 41 cytokiner oppdaget i sunn fag med perle basert multiplex analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cytokiner er små mobilnettet utskilles proteiner og potent immun modulatorer regulere immunreaksjoner. 32 uttrykket profiler av ulike cytokiner i tåre prøver er knyttet til ulike patologiske forhold av øyet og studier av cytokin profiler å forstå sykdom patogene mekanismer, bestemme okulær helsetilstanden, sykdommens alvorlighetsgrad, diagnostisering og progresjon. 2 , 5 lavere protein konsentrasjoner og lite utvalg volumer er hovedutfordringene med tradisjonelle metoder, begrenser bruken av analyser som ELISA for analyse av tåre cytokin profiler. 33 perle basert multiplex analyser er immunanalyser, som har forskjellige fordeler over ELISA. Perle basert multiplex analyser krever mindre utvalg volumer for analyse av flere analytter og er svært følsom, stand til å oppdage hører konsentrasjoner av proteiner i biologiske væsker. 34
Her rapporterer vi et standardisert protokoll for kvantitativ analyse av 41 tåre cytokiner i friske mennesker med perle basert multiplex analysen. Ut av 41 cytokiner i panelet, perle basert multiplex analysen oppdaget 40 cytokiner i tåreprøver og finner ikke MIP-1α. Dette negative resultatet kan være fordi det var umulig å oppdage nivåene av MIP-1α i sunn tåreprøver eller et mindre volum av tårer. Tåreprøver samles inn med Schirmer strimler har en fordel fremfor andre samling metoder som microcapillary rør og svamper. For eksempel i flere klinisk betingelser tåre væske volum kan måles Schirmer strimler og tåre væske kan elut fra samme stripen etter måling og brukes for cytokin analyse. 35 men microcapillary rør brukes rutinemessig å samle tårer og produsere mer konsekvent tåre profiler, prosedyren tar mer tid enn metoden stripen er mer kjedelig og kan være ubehagelig for barn og andre pasienter. Denne metoden kan videre også induserer refleks tåre produksjon ved å berøre Konjunktiva og gi variabel resultater cytokin profiler sammenlignet basale tårer, og dermed påvirke reproduserbarhet til analysen. 36 i noen klinisk betingelser som tørre øyne-sykdom tåreoppsamling utvalg av Schirmer strimler er pålitelig for protein analyse og bidrar til identifisering av biomarkers. 37 , 38
Perle basert multiplex analyser er en kombinasjon av flowcytometri og multiplex ELISA der analytter i prøven er klemt mellom spesifikt antistoff belagt og farge kodet magnetiske perler eller mikrosfærer og biotinylated gjenkjenning antistoff. Disse kompleksene kan oppdages ved å legge den reporter molekyl Streptavidin-Phycoerythrin (PE) konjugert og påfølgende eksponering for en dobbel lasersystem i en endret flyt cytometri-baserte instrument. 39 i en dobbel lasersystem, en laser interesserer de interne fargestoffer og dekningen representerer belagt spesifikke antistoffer. Andre laseren interesserer rapportering molekyl PE konjugert bundet til gjenkjenning antistoffer komplekse og intensiteten av signaler representerer konsentrasjonen av analytt.
Evnen til mikrosfærer kodes med fargestoffer med varierende intensiteter aktiverer analysen å oppdage opp til 100 forskjellige analytter i et lite volum på prøve i en enkelt brønn. 39 men perle basert multiplex analyser er rask, reproduserbare og sammenlignes med standard ELISA analyser,34,40 denne metoden krever dedikert instrumenter, evaluering av kits og standardisering av protokoller for ulike biologiske prøver. 39 tilstedeværelse av auto-antistoffer i klinisk utvalgene kan påvirke perle basert multiplex resultatene. 34 , 39 for rutinemessig bruk av disse analyser i klinisk innstillinger, er det anbefalt å bruke analysen kits fra en bestemt produsent. Følsomhet, deteksjon av absolutt konsentrasjoner av cytokiner, og reproduserbarhet ble rapportert å variere med de ulike kits. 41 antistoff microarrays eller membran microarrays er svært følsomme, billig alternativ høy gjennomstrømning teknikker som oppdage flere analytter i et lite antall prøver og kan brukes med hell på rive prøver for analyse av cytokiner og andre proteiner. 35 , 42 men mange begrensninger finnes, som disse analyser er tidkrevende, semi kvantitativ, viser en høy signal-til-støy-forhold og mangler standardiserte protokoller. 19 , 43
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre. Ingen økonomisk interesse eller interessekonflikt.
Acknowledgments
Forskningsarbeid ble støttet av sentrum tilskudd fra Tan takk Seng Hospital personlig frø finansiering Program 2015; Singapore øye Research Institute Pilot Grant og Tan takk Seng Hospital Pitch for fondet gi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit | Merck, USA | HCYTOMAG-60K-41 | |
| Flexmap 3D luminex instrument | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| xPonent software | Luminex Corp, Austin, TX, USA | ||
| RBXGenerator software | BIO-RAD, France | ||
| Bio-Plex Manager 6.1 | BIO-RAD, France | ||
| Plate shaker | Corning, USA | ||
| TECAN Microplate Washer | Tecan, Switzerland | HydroSpeed | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries inc, USA | G560E | |
| Pipettes | Mettler Toledo, CA, USA | ||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Axygen, USA | MCT-150-C | |
| Schirmer tear flow test strip | Eye Care and Cure, USA | 101657 | |
| Flexmap 3D Calibration Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-028 | |
| Flexmap 3D Verfication Kit | Luminex Corp, Austin, TX, USA | 40-029 | |
| Ocular examination chair |
References
- Conrady, C. D., Joos, Z. P., Patel, B. C. Review: The Lacrimal Gland and Its Role in Dry Eye. J Ophthalmol. 7542929, (2016).
- von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. , 126-137 (2013).
- Pieragostino, D., D'Alessandro, M., di Ioia, M., Di Ilio, C., Sacchetta, P., Del Boccio, P. Unraveling the molecular repertoire of tears as a source of biomarkers: beyond ocular diseases. Proteomics Clin Appl. 9 (1-2), 169-186 (2015).
- Azkargorta, M., Soria, J., Acera, A., Iloro, I., Elortza, F. Human tear proteomics and peptidomics in ophthalmology: Toward the translation of proteomic biomarkers into clinical practice. J Proteomics. 150, 359-367 (2017).
- Hagan, S., Martin, E., Enríquez-de-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: potential use for predictive, preventive and personalised medicine. EPMA J. 7, 15 (2016).
- Rentka, A., et al. Membrane array and multiplex bead analysis of tear cytokines in systemic sclerosis. Immunol Res. 64 (2), 619-626 (2016).
- Zhou, L., Beuerman, R. W. Tear analysis in ocular surface diseases. Prog Retin Eye Res. 31 (6), 527-550 (2012).
- Jackson, D. C., et al. Tear Interferon-Gamma as a Biomarker for Evaporative Dry Eye Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4824-4830 (2016).
- Agrawal, R., et al. A distinct cytokines profile in tear film of dry eye disease (DED) patients with HIV infection. Cytokine. 88, 77-84 (2016).
- Uchio, E., Ono, S. Y., Ikezawa, Z., Ohno, S. Tear levels of interferon-gamma, interleukin (IL) -2, IL-4 and IL-5 in patients with vernal keratoconjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis and allergic conjunctivitis. Clin Exp Allergy. 30 (1), 103-109 (2000).
- Leonardi, A., Curnow, S. J., Zhan, H., Calder, V. L. Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast cultures. Clin Exp Allergy. 36 (6), 777-784 (2006).
- Enríquez-de-Salamanca, A., Calonge, M. Cytokines and chemokines in immune-based ocular surface inflammation. Expert Rev Clin Immunol. 4 (4), 457-467 (2008).
- Carreño, E., et al. Cytokine and chemokine tear levels in patients with uveitis. Acta Ophthalmol. , (2016).
- Bjerrum, K. B., Prause, J. U. Collection and concentration of tear proteins studied by SDS gel electrophoresis. Presentation of a new method with special reference to dry eye patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (7), 402-405 (1994).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- Thakur, A., Willcox, M. D. Cytokine and lipid inflammatory mediator profile of human tears during contact lens associated inflammatory diseases. Exp Eye Res. 67 (1), 9-19 (1998).
- Wei, Y., Gadaria-Rathod, N., Epstein, S., Asbell, P. Tear cytokine profile as a noninvasive biomarker of inflammation for ocular surface diseases: standard operating procedures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8327-8336 (2013).
- Topcu-Yilmaz, P., et al. Determination of tear and serum inflammatory cytokines in patients with rosacea using multiplex bead technology. Ocul Immunol Inflamm. 21 (5), 351-359 (2013).
- Hagan, S., Tomlinson, A. Tear fluid biomarker profiling: a review of multiplex bead analysis. Ocul Surf. 11 (4), 219-235 (2013).
- Choi, R., et al. Serum inflammatory profiles in pulmonary tuberculosis and their association with treatment response. J Proteomics. 149, 23-30 (2016).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
- Staples, E., Ingram, R. J., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. J Immunol Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
- Inic-Kanada, A., et al. Comparison of ophthalmic sponges and extraction buffers for quantifying cytokine profiles in tears using Luminex technology. Mol Vis. 18, 2717-2725 (2012).
- Moncunill, G., Aponte, J. J., Nhabomba, A. J., Dobaño, C. Performance of multiplex commercial kits to quantify cytokine and chemokine responses in culture supernatants from Plasmodium falciparum stimulations. PLoS One. 8 (1), e52587 (2013).
- Loo, B. M., Marniemi, J., Jula, A. Evaluation of multiplex immunoassays, used for determination of adiponectin, resistin, leptin, and ghrelin from human blood samples, in comparison to ELISA assays. Scand J Clin Lab Invest. 71 (3), 221-226 (2011).
- Dupont, N. C., Wang, K., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J Reprod Immunol. 66 (2), 175-191 (2005).
- Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (4), 872-876 (2002).
- Biagini, R. E., Sammons, D. L., Smith, J. P., MacKenzie, B. A., Striley, C. A., et al. Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxins. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (1), 50-55 (2004).
- Wang, L. S., Leung, Y. Y., Chang, S. K., Leight, S., Knapik-Czajka, M., et al. Comparison of xMAP and ELISA assays for detecting cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 31 (2), 439-445 (2012).
- Kalsow, C. M., Reindel, W. T., Merchea, M. M., Bateman, K. M., Barr, J. T. Tear cytokine response to multipurpose solutions for contact lenses. Clin Ophthalmol. 7, 1291-1302 (2013).
- The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). The ocular surface. 5 (2), 75-92 (2007).
- Stenger, S., Röllinghoff, M. Role of cytokines in the innate immune response to intracellular pathogens. Ann Rheum Dis. 60, (2001).
- Li, S., et al. Antibody protein array analysis of the tear film cytokines. Optom Vis Sci. 85 (8), 653-660 (2008).
- Tighe,, Negm, O., Todd, I., Fairclough, L. Utility, reliability and reproducibility of immunoassay multiplex kits. Methods. 61 (1), 23-29 (2013).
- Dionne, K., Redfern, R. L., Nichols, J. J., Nichols, K. K. Analysis of tear inflammatory mediators: A comparison between the microarray and Luminex methods. Mol Vis. 22, 177-188 (2016).
- Sitaramamma, T., Shivaji, S., Rao, G. N. HPLC analysis of closed, open, and reflex eye tear proteins. Indian J Ophthalmol. 46 (4), 239-245 (1998).
- Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
- VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
- Khalifian, S., Raimondi, G., Brandacher, G. The use of luminex assays to measure cytokines. J Invest Dermatol. 135 (4), e31 (2015).
- Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. J Biomol Screen. 15 (5), 562-568 (2010).
- Berthoud, T. K., et al. Comparison of commercial kits to measure cytokine responses to Plasmodium falciparum by multiplex microsphere suspension array technology. Malar J. 10, 115 (2011).
- Boehm, N., Riechardt, A. I., Wiegand, M., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proinflammatory cytokine profiling of tears from dry eye patients by means of antibody microarrays. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7725-7730 (2011).
- Sack, R., Conradi, L., Beaton, A., Sathe, S., McNamara, N., Leonardi, A. Antibody array characterization of inflammatory mediators in allergic and normal tears in the open and closed eye environments. Exp Eye Res. 85 (4), 528-538 (2007).
