Summary
方法为广泛的中枢神经系统基因交付在大鼠被盖。在这个例子中, 目的是模拟一种疾病, 影响整个脊髓。广泛的转导可以用来提供一个治疗蛋白的中枢神经系统从一个 one-time, 外围管理。
Abstract
腺相关病毒 (AAV) 载体是神经中的一个关键试剂, 用于 interspaced 短复发重复 (CRISPR)、遗传学、液氧靶向等。这份手稿的目的是帮助研究者尝试通过尾静脉注射 AAV 大鼠的扩张中枢神经系统 (CNS) 基因转移。广泛的表达是相关的条件与广泛的病理, 和大鼠模型是重要的, 因为它的大小和生理上的相似性, 与人类相比, 小鼠。在这个例子应用中, 一个广泛的神经传导是用来模拟一种神经退行性疾病, 影响整个脊髓, 肌萎缩侧索硬化症 (ALS)。有效的广泛的中枢神经系统转导也可以用于提供临床前研究中的治疗蛋白因子。经过数周的后表达间隔后, 对转导的影响进行了评价。对于绿色荧光蛋白 (gfp) 控制向量, 在小脑中 GFP 的数量是由一个基本的成像程序快速和可靠的估计。对于由 ALS 相关蛋白交互应答 DNA 结合蛋白诱导的 43 kDa (TDP-43) 的运动疾病表型, 通过逃逸反射和 rotarod 来评分。除了疾病建模和基因治疗, 在这里描述的广泛的基因打靶有不同的潜在应用。扩大使用这种方法将有助于加速假设测试在神经和遗传学。
Introduction
重组腺相关病毒 (AAV) 载体是中枢神经系统研究不可缺少的工具, 因为它们对换神经元的体内有效。AAV 载体对于研究不同的转基因和蛋白质异构体、不同的组织、不同的寄主种类和不同的管理途径是非常通用的。例如, AAV 可以通过外周、相对非侵入性、静脉注射到中枢神经系统的传感器神经元来进行小鼠的管理, 这首先在 Foust et al.和杜克et al.中描述(参见朱庇特纸由 Gombash et al.(2014))。1,2,3这一基因传递方法用于大鼠有效表达绿色荧光蛋白 (GFP) 或 ALS 相关蛋白、交互反应 DNA 结合蛋白 43 kDa (TDP-43) 的中枢神经系统。4,5,6,7,8,9在大鼠中工作是很重要的, 因为老鼠的生理和代谢参数与小鼠相比更接近人类, 而且还有专门为老鼠设计的行为和毒理学化验。此外, 越来越多的转基因大鼠品系可用于 AAV 基因转移研究。
方法是详细的大鼠扩张 CNS 基因转移, 并迅速, 可靠的量化结果。广泛的中枢神经系统转导是用来模拟的症状性 ALS 在大鼠通过表达 TDP-43 整个脊髓。该方法是在杰克逊et al.中使用的 TDP-43 载体的尾静脉注射。6,8,9在几周后, TDP-43-induced 的马达缺陷分为两种方法: 转义反射和 rotarod, 用于代顿et al.和杰克逊et al.5,6,7,9为控制 GFP 载体, 在验尸分析中, 小脑的萤光区被计算为在杰克逊et al.中使用的转导效率指数。6,8小脑的分析已被证明是一个快速和可靠的指标的程度中枢神经系统转导后, 外周基因交付, 并应适用于各种方法试图 peripheral-to-central 基因转移。
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Protocol
所有程序都遵循了适当的 NIH 指南。所有的程序都遵循动物协议, 这是由位于什里夫波特的路易斯安那州立大学健康科学中心的动物保育和使用委员会批准的。6周龄的雌性大鼠被用于此手术.
1. 确定所需的向量的剂量/体积
- 将被注射的老鼠称重, 并根据载体制剂的滴度 (浓度) 确定每种动物所需的病毒载体的数量。使用的矢量剂量已经成功地在大鼠中枢神经系统的表达之前 (见杰克逊 et al . 6 ).
注意: 对于 AAV9 TDP-43 或 AAV9 GFP, 典型剂量介于 3 x 10 13 -1 x 10 14 矢量基因组/千克之间。6周龄的成年小鼠体重约150克. - 在所有动物中每千克当量剂量进行系统比较。确保音量不超过标准建议的注塑量 (250-500 和 #181; L 为250克鼠)。一个典型的注射量是200和 #956; 我对一个年轻的成年老鼠.
2。准备工作站
- 收集所有必需的耗材: 每只动物一个石蜡薄膜正方形 (约 5 x 5 厘米), 每只动物一个酒精制剂垫, 纱布垫 (每只动物 2-3), 吸管提示和微.
- 用70% 乙醇清洗表面, 准备工作表面。将加热垫放下, 温度设置为低 (〜37和 #176; C)。将一个长凳垫放在暖气垫的顶部.
- 准备气体麻醉 (异氟醚)。确保充分的氧气和气体麻醉的程序。用70% 乙醇清洗感应室和麻醉面罩, 并将麻醉面罩放在工作台垫上.
3。准备矢量
- 在室温下解冻向量, 并为每个动物标记一个无菌离心管.
- 吸管将步骤1.1 中确定的 AAV 的体积转换成适当的管, 并使音量达到所需的注入量 (这里, 200 和 #956; l) 与林格林格和 #39; s 溶液或盐水.
- 脉冲涡流样品 1-2 s, 然后脉冲离心机 5 s, 使样品到底部的管.
- 吸管的总注射量为鼠出管和到广场的石蜡薄膜.
- 在1毫升注射器上放置一个30口径的针.
- 将针与斜面朝下放置在石蜡膜上的矢量上。拉回注射器柱塞, 直到所有的病毒是在针头和注射器。小心避免把气泡拉进针里, 这样练习就容易多了.
4。准备大鼠
- 将氧气升至1升/分, 并将异氟醚麻醉设置为5%。通过检查所有连接软管和塞方向, 确保气体麻醉流向感应室.
- 将大鼠置于气体麻醉诱导室中约3分钟, 直到老鼠没有反应.
- 通过捏脚趾来确保充分的麻醉深度。脚趾捏后, 脚或腿不应有运动.
- 将异氟醚麻醉减少到 2%, 用于麻醉的维护, 调整塞, 使麻醉流到麻醉面罩上.
- 将老鼠和 #39 的鼻子放在麻醉面罩里, 调整老鼠的位置, 使它躺在它的侧面.
- 识别侧尾静脉.
注: 侧尾静脉位于大约10和 2 o 和 #39; 时钟与尾部的背顶部作为 12 o 和 #39; 时钟。当老鼠躺在它的一侧时, 侧尾静脉应该朝上. - 用酒精准备垫擦拭注射区域。注射地点是2/3 下长度的尾巴.
5。注入矢量
- 将尾部略微固定在注射区域上方, 用一根手指直接越过侧尾静脉; 这会放大静脉.
- 将斜面朝上, 将针与可见尾静脉对准同一方向.
- 在非常小心的时候, 在尾部静脉上刺穿皮肤, 避免另一只手按住尾部并按下尾部静脉.
- 释放来自尾静脉的压力以允许正常的血流.
- 将针头移入静脉。为了确保针头刺穿了尾静脉, 在柱塞上稍微向后拉。如果针头在静脉, 血液就会流入针头。
- 根据需要重新定位针。然后, 为了稳定针头, 将手移到注射部位的下方, 并将注射器的末端固定在尾部.
- 将向量慢慢注入尾部 (大约20和 #181; 注: 当矢量流经时, 静脉可能会失去颜色。在静脉外注入溶液的迹象包括起泡, 皮肤的烫漂, 或注射载体时的阻力。通过实践, extra-vascular 的曝光率可以最小化.
- 在该载体被管理后, 从鼠身上取出针头, 并在注射部位上压上纱布垫以帮助 30-六十年代的出血.
6。清除
- 关闭异氟醚麻醉和氧气。监测鼠, 直到它恢复知觉, 然后返回到它的笼子.
- 小心地把所有的针头放在锋利的容器里。将可能被 AAV 污染的所有其他一次性材料处理成适当的生物危害容器。用70% 乙醇清洁工作站.
7。评估后肢逃生反射
注: 在 TDP-43 基因转移后, 后肢缺损通常出现 2-6 周, 这取决于载体剂量.
- 在平坦的表面上清除碎片, 用两个手指抓住鼠和 #39; 尾巴大约2厘米从身体。轻轻抬起大鼠, 直到前肢在观察鼠腹底时悬挂。
- 在基因转移 (例如, 基因转移后12周) 的整个实验时效中每周执行过程.
注: 也以这种方式得分前肢赤字, 但后肢赤字更有可能发生在这个模型, 取决于所使用的向量剂量.
- 在基因转移 (例如, 基因转移后12周) 的整个实验时效中每周执行过程.
- 观察十年代的后肢. 注意, 如果一个或两个后肢紧握对中线在十年代.
- 重复此测试总共三次, 与三十年代之间的试验。如果一个或两个后肢是紧握的每三试验, 老鼠显示运动功能障碍。记录数据 (手动在笔记中), 无论是单边或双边后肢赤字存在, 如果有一致的紧握在所有三试验.
8。在 rotarod 上评估马达功能
- 设置 rotarod, 在 rotarod 下放置一个工作台垫, 并将加速度设置为每分钟 4-40 转 (rpm) 超过2分钟 (速率增加了 ~ 0.3 rpm/秒)。12周的时效, 在基因转移后的2、4、8和12周内进行实验.
- 允许老鼠适应测试室20分钟.
- 训练大鼠第一次使用 rotarod, 首先以 4 rpm 的速度启动 rotarod, 然后将老鼠放在 rotarod 上。允许老鼠在4分钟的转速下进行一次全面的革命, 然后开始加速, 让老鼠在 rotarod 上行走, 直到它脱落。继续训练, 直到老鼠能持续至少四十年代的步行。一个健康的, 年轻的成年鼠将容易接受这种方式的训练。
- 在有明显的运动损伤的大鼠的情况下, 这可能会阻止大鼠在四十年代底之前达到基线潜伏期, 在开始 rotarod 评分之前提供 3-5 的训练尝试.
- 开始 rotarod 测试, 将鼠放在 rotarod 上, 并开始加速 rotarod。注意老鼠从 rotarod 上掉下的时间;这是下降的潜伏期。如果老鼠仍然在 rotarod 在120s 以后, 盖帽会议在这一点上, 去除鼠从 rotarod 并且记录秋天潜伏期 120s.
- 对总共三项试验重复测试两次。为了尽量减少疲劳的影响, 试验间隔至少5分钟。平均三项试验的得分。未受损伤的成年鼠通常有平均潜伏期和 #62; 四十年代.
- 将老鼠放回笼子里, 用70% 乙醇清洁 rotarod 和周围的区域.
9。在小脑中荧光蛋白表达的量化
- 麻醉鼠和灌注与磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 然后4% 甲醛。解剖大脑和脊髓, 并浸泡在定影液过夜, 然后将其移动到30% 蔗糖溶液。平衡后, 削减50和 #956; m 冠状部分在滑动切片与冻结阶段 4 , 5 , 6 。
- 选择小脑的3-6 节, 在小脑中央裂片的蚓中均匀分布。荧光标签的 GFP, 以最大限度的信号。使用 GFP 的主要抗体在1:500 和使用 Alexa-488 共轭二级抗体在稀释 1:300 4 , 5 , 6 。 注意: 有关取样、切片和染色过程的详细信息, 请参阅 4 、 5 、 6 。
- 显微使用显微镜对所定义的感兴趣区域中的每个剖面进行低放大透镜。使用2.5X 目标 (0.12) 和过滤器设置 10, 450-490/515-565 的励磁/发射)。保持相机设置 (曝光时间, 例如, 2 秒) 相同的跨样品进行分析。另存为。TIF 文件.
- 在广泛可用的接穗图像程序中打开显微; 将打开两个窗口。关闭指示为和 #34 的窗口; 索引颜色和 #34;.
- 选择和 #34; 选项和 #34;, 然后 #34;D ensity 切片和 #34;; 在 "查找表" 窗口中, 将用红色表示一系列色调。在窗口中, 使用光标只填充特定的 GFP 标签, 并在图像中开始拾取非特异背景时停止.
注: 这将突出显微上的荧光区域将被量化。这些设置应进行优化, 以专门捕获所有可见的荧光细胞。实践表明, 该方法能准确地突出特定的荧光特性. - 在测量荧光区域之前, 首先要确保所做的测量是正确的单位 (像素)。为此, 请单击并 #34; 分析和 #34;, 然后 #34; 设置规模和 #34;;第四行应该说和 #34; 单位和 #34;。从下拉列表中, 选择像素以像素为单位, 然后单击并 #34; 好的 #34。将分析选项切换到和 #34; 包括内部孔和 #34; 确保在分析中包含整个单元体.
- 测量荧光区域, 单击和 #34; 分析和 #34; 然后单击和 #34; 测量和 #34;。要查看此值, 请单击 "#34"; 分析和 #34; 然后单击并 #34; 显示结果和 #34;;将出现一个结果窗口。荧光区域测量将在标题和 #34; 面积和 #34;.
- 若要确保整个测量的标准化, 请不要更改 "查找" 窗口中突出显示的值.
- 一旦记录了所有的测量值, 每个动物的平均值 (每只动物的 3-6 节)。使用适当的统计测试来比较组之间的转区域。 6
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Representative Results
TDP-43 引起的运动损伤应在 2-6 周内出现, 这取决于使用的 AAV TDP-43 的剂量 (图 1)。不成功的尾静脉注射会导致局部或无损伤;AAV 必须到达血流才能产生效果。成功注射 AAV gfp, 将导致在整个大脑和脊髓的 gfp 表达, 以向量剂量的依赖方式。当使用强的重组启动子驱动表达, 巨细胞病毒鸡β-肌动蛋白混合启动子, 也称为 CAG 启动子, 有有效的表达在中枢神经系统以及其他一些组织, 如肝脏和心脏。4,5,10在大鼠中枢神经系统中使用 AAV9 或 AAV PHP。B 向量, 该模式主要是神经元转导和只有稀疏, 零星的胶质转导。4,8由于在大鼠体内的转导效率不受性别差异的影响, 雌性通常用于静脉注射基因, 因为其重量较低。6
所描述的半定量成像方法快速可靠, 具有良好的信噪比。将 non-transduced 样本与图 2中的转样本进行比较, 这两个样本都沾有 GFP 抗体。从这些示例中收集的值表明, non-transduced 示例中的0.3% 噪声 (来自图 2B, D中列出的值), 这可以被认为是微不足道的。该方法具有良好的信噪比, 适用于对向量类型、矢量剂量、性别、年龄等实验条件的快速比较。
图1。广泛的 AAV9 TDP-43 基因转移到大鼠导致渐进性运动障碍.Rotarod 的表现在 1-3 周后, 无论是基因转移的控制 GFP 或 ALS 相关基因 TDP-43。实验对象在基因转移之前进行了测试, 随后的测量结果表示为基线时间点的比值。一个正常的未经治疗的老鼠将留在 rotarod 从 60-九十年代在这些情况下。此图已从6中修改。
图2。对大鼠静脉注射 AAV 后小脑 GFP 阳性荧光区的快速定量.a、B) 用 GFP 抗体染色的非转样品。C, D) 样品从老鼠接受 AAV9 GFP。B、D) 接穗图像上的密度切片选项用于选择性地突出红色的荧光区域, 然后由程序计算红色像素。密度切片选项应突出显示所有可见的荧光细胞, 如 C 所示。由程序计算的以正方形像素表示的红色区域显示在 B、D。时间点是4周后, 尾静脉注射 AAV9 GFP, 以一个年轻的成年大鼠的矢量剂量为 1 x 1014向量基因组/千克。A 中的刻度栏为536µm;在-d 中的放大倍数相同。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
各种分娩路线已测试 AAV 载体: intra-parenchymal, intra-cerebroventricular, intra-thecal, 静脉注射, 鼻腔, intra-muscular 等。每条路线可能有具体的优点和缺点。尾静脉 AAV 对成年大鼠是一种可靠的方法, 以实现一致转导的中枢神经系统。外周注射法避免将注射套管引入中枢神经系统组织, 因此是微创的。这种方法能实现的有效的 CNS 表达是该技术的最大优势。其他的实际优势是, 注射法是非常快 (约10分钟每动物从开始到结束) 和尾静脉注射不是高度技术, 因此可以很快掌握。当然, 一个主要的缺点是, 大量的高效度向量是需要的, 这将是一个可行性的问题, 如果 AAV 准备低于 1 x 1013向量基因组/毫升。随着向量靶向能力的进一步细化, 这种方法在未来的临床基因治疗中是有利的, 因为基因的传递是由外围途径而非侵入性的。另一方面, 更直接的 intra-cerebrospinal 液体注射可能是有利的前体和临床方法有两个原因: 更有限的传播载体和使用较低的载体剂量。
在深色色素沉着的大鼠中, 尾静脉可能更难辨认。因此, 可以使用替代的管理途径, 如逆行眶内注射或静脉注射到隐静脉。这种复古轨道注射的目标是致密的毛细血管床, 因此类似于静脉注射。对于老鼠, 也许对老鼠来说, 复古轨道法可能比尾静脉注射更容易, 但三项研究显示, 成年大鼠尾静脉注射的一致性很大。6,8,9这项工作的大部分使用了强大的重组启动子驱动转基因表达, 巨细胞病毒鸡β-肌动蛋白混合启动子。10如果实验者希望将表达式与中枢神经系统中的神经元分隔, 则可以尝试一个特定于细胞类型的启动子, 例如突启动子。8,11
关于成像方法, 它是一种快速的, 半定量的方法来估计的转导效率。如果正确地进行, 则化验结果的可靠估计的转面积。在中枢神经系统组织中计算物体的金标准方法称为视学。每只动物需要大约75分钟的时间, 在大脑感兴趣的区域进行视学探针, 而所描述的方法在每只动物中的20分钟或更少的地方缩放时速度更快。如果所有条件都保持不变, 并且对同一区域进行了适当取样, 则数据的一致性接近视学的一致性, 大量的样本群可以快速地进行分析。
还有许多额外的技术性说明值得进一步讨论。对于1节关于向量剂量, 大鼠有效转基因表达所需的载体剂量由王et al.、代顿et al.和杰克逊et al.的试错和剂量反应确定, 以及以前的剂量用于小鼠 (Foust et al.和杜克et al)。1,2,4,5,6肯定是一个关键的, 而且可能的速率限制步骤是生产 high-titer AAV 准备以达到有效剂量。
在3节中, 关于将向量加载到针中, 注射液中的气泡应尽量避免。少量的空气不应该是问题, 因为这可以被过滤出来的肺部, 但过量的空气注入静脉可能导致静脉空气栓塞可能导致死亡。12如果注射器中存在气泡, 则应将病毒从注射器中排出, 并加载新的注射器。为了避免气泡的产生, 确保将针的位置放在膜上, 并使斜面朝下。当大部分的向量被拿起针, 非常缓慢地草拟剩下的解决方案。一个小的空气袋将形成在注射器的后面。这是死亡的空间, 不会被注入。为了确保它保持向注射器的背部, 保持注射器水平或指向向下, 不要轻弹注射器。
关于注射的5节, 为了确保注射进入静脉, 而不是静脉周围的组织, 一旦针头插入, 在柱塞上稍微向后拉, 在针尖上产生负压。如前所述, 如果针头在静脉内, 血液就会回流到针头上, 并在针头的底部可见。当注射入静脉时, 当针适当地放置时, 应该感觉少许抵抗。如果遇到明显的阻力, 那么很可能注射进入尾部的组织, 如上所述。也有可能刺穿静脉, 造成 "吹的静脉", 当针插入的角度太陡, 当针的量规太大的静脉, 或当注射速度太快, 把太多的压力, 静脉。在静脉的初始穿刺或注射过程中, 可以发生吹出的静脉。为了避免在注射过程中刺穿静脉或使针头从静脉中脱落, 注射器应该通过将注射器的末端固定在尾部来稳定。如果针头成为脱落或第二次注射是需要的另一个原因, 第二次注射可以作出的侧向尾静脉在对面或更接近身体在同一侧。
在8节中, rotarod 试验在实验期间以4周的间隔运行。正常的, 未经治疗的大鼠有更好的分数时, 他们更年轻 (4-6 周龄) 比在年龄较大。随着时间的推移, 逃逸反射中的缺陷被绘制为肢体功能的存活。通过对棱镜软件的对数秩测试, 分析了其生存曲线。
对于9节的转导分析, 在实践中, 该程序变得相对快速, 每只动物大约20分钟或更少。这种化验也是高度可靠的, 因为 non-transduced 的组织, 是处理与 GFP 染色程序基本上微不足道的阅读 (图 2B), 并因为有一个巨大的动态范围的读数。大部分的 GFP 荧光来源于转浦肯野细胞, 因此它们的大量提供了一个大的动态范围。到目前为止, 所取得的基因转移效率并没有导致整个领域的读数饱和 (即浦肯野细胞的100% 转导), 至少当基因转移被管理到成年大鼠。如果整个场的饱和是一个问题, 那么信号可以降低通过应用较低的矢量剂量在单独的动物或只测量较弱, 本地 GFP 荧光, 放弃染色程序。当然, 小脑中其他细胞类型的转导也可能导致信号的发生, 但程序中最容易看到和计数的是浦肯野细胞层中的细胞体及其在分子中的树突树根据他们已知的位置和形态, 在整个小脑层。对该方法的一个重大挑战是, 可以计算气泡或荧光碎片, 从而污染读数。不使用此噪音的剖面和字段;无需非特定噪音的清洁样品。由于 GFP 是一种外源蛋白, 在组织中没有背景噪声, 因此可以精确捕捉和估计特定的荧光。在这些研究中, GFP 显微被捕获的颜色, 然后转换成灰度使用的成像程序以外的接穗图像。然而, 这将是更直接的捕捉黑绿色荧光蛋白在第一个地方, 随后分析接穗图像。先前的研究分析了脊髓下运动神经元的传导率, 即运动神经表达 GFP 的百分比。4,6然而, 小脑的分析更快速, 需要较少的部分, 也似乎更加一致和可靠 (例如, 在个别观察者进行评估)。因此, 快速小脑成像方法是 peripheral-to-central 基因转移成功的一个很好的快速指标。在大鼠神经系统的脊髓转导和其他部位转导的例子中, 已有报道在王et al., 代顿et al., 和杰克逊et al.4,5,6
总之, 静脉用药的途径是微创的;中枢神经系统可以被周边的管理的目标, 而不放置在大脑或脊髓针。随着靶向性的进一步细化, 相关的临床前和基因治疗将继续使用静脉注射, 而许多未来的类型的基础功能研究的大鼠可以受益于扩张转导的追求加速对体内基因功能的假设检验。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由 als 协会, Karyopharm 疗法, Inc., Meira GTx, 和一个慈善捐赠的 als 研究从托马斯劳森, 我们很感激。我们感谢 Elysse 果园和唐娜伯尼的建议和培训。JAS 得到了撒谎基金会和国立卫生研究院 GM103418 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scale | Pelouze | SP5 | |
| Nalgene bucket | Thermo Scientific | 12014000 | 4000 mL |
| Microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Lactated Ringer's Solution | Baxter Healthcare | 0338-0114-04 | |
| Mini vortexer | Fisher Scientific | 128101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22624415 | |
| Laboratory film | Bemis | PM996 | |
| 1-mL syringe | BD | 309626 | Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection |
| 30g needle | BD | 305106 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | Isoflurane USP 250 mL |
| Anesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Gauze | Henry Schein | 100-2524 | 2" x 2" (5cm x 5cm) |
| Pipet tips | USA Scientific | 1111-0816 | |
| Micropipet | Gilson | 4642080 | |
| Gas anesthesia vaporizer | SurgiVet | 4214322 | Classic T3 |
| Gas anesthesia scavenger | SurgiVet | 32373B10 | Enviro-PURE |
| Heating pad | Sears | 17280 | |
| Bench pad | VWR | 56617-006 | |
| Rotarod | Panlab/Harvard Apparatus | 76-0772 | 4 rats/ 4 mice |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2401 | 140 proof |
| 70% Isopropanol | VWR | 89108-160 | |
| Scion Image | Scion Corporation | ||
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Invitrogen | A11122 | Primary Antibody - 1:500 dilution |
| AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11070 | Secondary Antibody - 1:300 dilution |
| Axioskop 40 microscope | Zeiss |
References
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