Methoden und Tipps für die intravenöse Gabe von Adeno-assoziierten Virus an Ratten und Bewertung des zentralen Nervensystems Transduktion

Summary

Methoden für eine breit angelegte zentrale Nervensystem gen Lieferung bei der Ratte sind abgedeckt. In diesem Beispiel ist der Zweck, eine Krankheit zu imitieren, die das gesamte Rückenmark betrifft. Die weit verbreitete Transduktion lässt sich ein therapeutisches Protein aus einer einmaligen, periphere Verwaltung an die CNS liefern.

Abstract

Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren sind eine wichtige Reagenz in den Neurowissenschaften für gruppierte regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR), Optogenetik, Cre Lox targeting usw.. Dieses Manuskript soll die Ermittler versuchen expansive zentrale Nervensystem (ZNS) Gentransfer bei der Ratte über Heck Vene Injektion von AAV zu unterstützen. Breit angelegte Ausdruck ist relevant für Bedingungen mit weit verbreiteten Pathologie und einem Rattenmodell ist bedeutend wegen seiner größeren Größe und physiologischen Ähnlichkeiten mit Menschen im Vergleich zu Mäusen. In dieser Beispielanwendung wird eine breit angelegte neuronale Transduktion verwendet, um eine Neurodegenerative Erkrankung zu imitieren, die betrifft das gesamte Rückenmark Amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Die effiziente breit angelegte CNS Transduktion einsetzbar auch therapeutische Protein Faktoren in präklinischen Studien zu liefern. Nach einem Intervall von mehreren Wochen nach der Injektion Ausdruck sind die Auswirkungen der Transduktion bewertet. Für ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) Steuerung Vektor wird der Betrag der GLP im Kleinhirn durch ein basic imaging-Programm schnell und zuverlässig geschätzt. Für motor Krankheit Phänotypen, die durch die ALS induziert werden im Zusammenhang mit Protein transactive Antwort DNA-bindendes Protein von 43 kDa (TDP-43), sind die Defizite von Flucht-Reflex und Rotarod erzielte. Über Krankheit Modellierung und Gentherapie gibt es vielfältige Anwendungsmöglichkeiten für das breit angelegte gen Zielen hier beschrieben. Die erweiterte Nutzung dieser Methode hilft bei der Beschleunigung in den Neurowissenschaften und Neurogenetik Hypothesentests.

Introduction

Rekombinantes Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren sind unverzichtbare Werkzeuge für die CNS-Forschung, weil sie für transducing Neuronen in-vivo so effizient sind. AAV-Vektoren sind sehr vielseitig für verschiedene transgene und Protein-Isoformen, verschiedenen Geweben, verschiedenen Wirtsarten und verschiedenen Darreichungsformen zu studieren. Zum Beispiel kann AAV verabreicht werden mit Mäusen ein Peripheriegerät, relativ nichtinvasiv, intravenöser Injektion, Neuronen im gesamten ZNS als erstes transduzieren Foust Et Al. und Duque Et Al. beschrieben (siehe Jupiter Papier von Gombash Et Al. (2014)). ^{1 , 2 , 3} dieser gen Lieferung Ansatz wird verwendet bei Ratten entweder grünes fluoreszierendes Protein (GFP) effizient zum Ausdruck bringen oder die ALS im Zusammenhang mit Protein, transactive Antwort DNA-bindendes Protein von 43 kDa (TDP-43) im ZNS. ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} arbeiten bei Ratten ist bedeutsam, weil die Ratte physiologische und metabolische Parameter für den Menschen im Vergleich zu Mäusen näher sind und es Verhaltens- und toxikologische Tests, die speziell für die Ratten gibt. Weiterhin mehr transgene Ratte Linien sind immer verfügbar, die in AAV gen Übertragung Studien genutzt werden.

Methoden sind für expansive CNS Gentransfer in die Ratte und schnelle, zuverlässige Quantifizierung der Ergebnisse detailliert. Breit angelegte CNS Transduktion wird verwendet, um die Symptomatik Alsen in Ratten zu imitieren, TDP-43 in das Rückenmark zum Ausdruck zu bringen. Die Methode ist Tail Vene Injektionen von TDP-43 Vektor zu jungen Erwachsenen Ratten wie in Jackson Et al. ^{6 , 8 , 9} nach mehreren Wochen, TDP-43-induzierte motorische Defizite werden erzielt durch zwei Methoden: entkommen, Reflex und Rotarod wie in Dayton Et Al. und Jackson Et Al. ^{5 , 6 , 7 , 9} für Kontrolle GFP Vektor, in Post-Mortem-Analyse ist die fluoreszierende Fläche des Kleinhirns als Index der Transduktion Effizienz wie bei Jackson Et Al. berechnet ^{6 , 8} die Analyse des Kleinhirns erweist sich eine schnelle und zuverlässige Index für den Grad der CNS Transduktion nach peripheren gen Lieferung und auf eine Vielzahl von Ansätzen versucht peripher-zentrale Gentransfer anwendbar sein sollte.

Protocol

alle Verfahren der entsprechenden NIH-Richtlinien befolgt. Alle Verfahren gefolgt Tier Protokolle, die von der Animal Care and Use Committee an LSU Health Sciences Center in Shreveport genehmigt wurden. Weibliche Sprague-Dawley Ratten im Alter von 6 Wochen für dieses Verfahren verwendet wurden.

1. bestimmen die Dosen/Mengen des Vektors benötigt

1. wiegen die Ratten injiziert werden und bestimmen die Höhe der viralen Vektoren benötigt für jedes Tier der Titer (Konzentration) der Vektor-Vorbereitung anhand. Verwenden Sie Vektor-Dosen, die zuvor für effiziente Ausdruck bei der Ratte CNS erfolgreich gewesen (siehe Jackson Et Al. ⁶).
   Hinweis: für AAV9 TDP-43 oder AAV9 GFP, eine typische Dosis beträgt 3 x 10 ¹³ - 1 x 10 ¹⁴ Vektor Genomen/kg. Die jungen Erwachsenen Ratten im Alter von 6 Wochen wiegen ca. 150 g.
2. Stellen entsprechende Dosen pro kg bei allen Tieren für systematische Vergleiche. Stellen Sie sicher, dass die Lautstärke nicht standard beraten Einspritzmengen (250-500 µL für eine 250 g-Ratte) überschreitet. Eine typische Injektionsvolumen ist 200 μl zu einem jungen Erwachsenen Ratte.

2. Arbeitsplatz vorbereiten

1. alle erforderlichen Vorräte: Paraffin Film quadratisch (ca. 5 x 5 cm) pro Tier, einem Alkoholtupfer Vorbereitung pro Tier, Gaze-Pads (2-3 pro Tier), Pipettieren Tipps und einer Mikropipette.
2. Bereiten die Arbeitsfläche durch Reinigung der Oberfläche mit 70 % Ethanol. Legen Sie ein Heizkissen nach unten mit der Temperatur (~ 37 ° C) zu niedrig eingestellt. Legen Sie eine Bank-Pad auf der Oberseite des Heizkissens.
3. Bereiten die Gas-Anästhesie (Isofluran). Sorgen Sie für ausreichend Sauerstoff und Gas Narkose für den Eingriff. Reinigen Sie die Induktion Kammer und Anästhesie-Maske mit 70 % Ethanol, und legen Sie die Anästhesie-Maske auf der Bank.

3. Bereiten Sie den Vektor

1. des Vektors bei Zimmertemperatur auftauen, und beschriften Sie eine sterile Microcentrifuge Schlauch für jedes Tier.
2. Pipettieren, das Volumen des AAV bestimmt in, der entsprechenden Röhre 1.1 betreten und bringen das Volumen bis zu der gewünschten Injektionsvolumen (hier: 200 μl) mit gesäugt Ringer ' s Lösung oder Kochsalzlösung.
3. Puls der Probe für 1-2 s Wirbel und dann Puls Zentrifuge für 5 s, die Probe an der Unterseite des Rohres zu bringen.
4. Pipettieren der gesamten Injektionsvolumen für die Ratte aus der Tube und auf den Platz von Paraffin Film.
5. Eine 1 mL Spritze eine 30 Gauge-Nadel aufsetzen.
6. Legen Sie die Nadel mit der Fase nach unten in den Vektor auf dem Paraffin-Film. Ziehen Sie den Kolben der Spritze bis das Virus in die Nadel und Spritze ist. Vermeiden Sie Luftblasen in die Nadel, die mit etwas Übung leichter zeichnen.

4. Bereiten Sie die Ratte

1. schalten Sie den Sauerstoff bis zu 1 L/min und die Isofluran-Narkose auf 5 % festgelegt. Sicherzustellen, dass die Gas-Anästhesie zur Induktion Kammer fließt durch Überprüfung aller Anschluss-Schläuche und Absperrhahn Orientierungen.
2. Legen Sie die Ratte in Anästhesie Induktion Gaskammer ca. 3 min, bis die Ratte reagiert.
3. Gewährleisten ausreichende Tiefe der Narkose durch Kneifen der Zehs. Es darf keine Bewegung in den Fuß oder das Bein nach der Zehe Prise.
4. Reduzieren die Isofluran-Narkose auf 2 % für die Wartung der Anästhesie und der Hahn so einstellen, dass die Narkose, Anästhesie-Maske fließt.
5. Legen Sie die Ratte ' s Nase in der Anästhesie-Maske und die Ratte so einstellen, dass es auf der Seite liegenden ist.
6. Identifizieren die seitlichen Schweif Vene.
   Hinweis: Die seitlichen Schweif Venen liegen bei ca. 10 und 2 o ' Uhr mit der dorsalen Spitze der Rute als 12 o ' Uhr. Mit der Ratte liegend, sollten die seitlichen Schweif Vene up zugewandt sein
7. Wischen Sie die Injektion Fläche mit Vorbereitung Alkoholtupfer. Die Injektionsstelle beträgt 2 / 3 über die gesamte Länge der Rute.

5. Injizieren den Vektor

1. fest zu halten die Rute leicht oberhalb des Bereichs der Injektion mit einem Finger direkt über die seitlichen Schweif Vene; dies wird die Vene erweitern.
2. Mit der Fase nach oben, die Nadel mit der sichtbaren Schweif Vene in die gleiche Richtung ausrichten.
3. Durchbohren die Haut über die Rute Vene und die tolle Betreuung auf der anderen Seite hält die Rute und drücken auf die Rute Vene zu vermeiden.
4. Druck von der Rute Vene für normale Blutfluss ermöglichen.
5. Bewegen Sie die Nadel in die Vene. Um sicherzustellen, dass die Nadel die Rute Vene durchstochen hat, ziehen Sie leicht am Kolben. Wenn die Nadel in die Vene ist, strömt Blut in die Nadel.
   1. Neu positionieren der Nadel nach Bedarf. Dann, um die Nadel zu stabilisieren, bewegen Sie die Hand oberhalb der Injektionsstelle, unterhalb der Einstichstelle und halten Sie das Ende der Spritze gegen das Heck.
6. Langsam injizieren den Vektor in das Heck (ca. 20 µL/s).
   Hinweis: Die Vene verlieren Farbe als der Vektor durchströmt. Anzeichen dafür, dass die Lösung außerhalb der Vene injiziert wurde gehören Blebbing, Bleichen der Haut, oder der Widerstand beim Einspritzen des Vektors. Mit etwas Übung extra vaskuläre Belastung minimiert werden.
7. Nachdem der Vektor verabreicht wurde, entfernen Sie die Nadel aus der Ratte und drücken Sie einem Tupfer gegen die Injektionsstelle zur Eindämmung der Blutung für 30-60 s.

6. Sanierung

1. schalten Sie die Isoflurane Narkose und Sauerstoff. Die Ratte zu überwachen, bis er das Bewusstsein wiedererlangt, und wieder in seinen Käfig.
2. Legen Sie vorsichtig alle Nadeln in die Scharfbehälter. Entsorgen Sie alle anderen Einweg-Materialien, die in einen entsprechenden Biohazard Behälter mit AAV potenziell kontaminiert sind. Reinigen Sie die Arbeitsstationen mit 70 % igem Ethanol.

7. Bewerten Megalosauridae Flucht-Reflex

Hinweis: Megalosauridae Defizite entstehen in der Regel 2-6 Wochen nach TDP-43 Gentransfer, abhängig von der Dosis der Vektor.

1. Auf eine flache Oberfläche frei von Schutt mit zwei Fingern greifen die Ratte ' s Heck ca. 2 cm aus dem Körper. Heben Sie vorsichtig die Ratte, bis die Vorderbeine beim Betrachten der ventralen Unterseite der Ratte hängen.
   1. Ausführen der Prozedur wöchentlich im experimentellen Zeit-Verlauf nach Gentransfer (z. B. bis zu 12 Wochen nach Gentransfer).
      Hinweis: Gäste auch Vordergliedmaße Defizite auf diese Weise, aber Megalosauridae Defizite sind wahrscheinlicher, in diesem Modell, je nach der verwendeten Vektor-Dosis.
2. Der Hintergliedmaßen für 10 S. Hinweis zu beobachten, wenn eine oder beide Hinterbeine in Richtung der Mittellinie 10 Ballen s.
Wiederholen Sie diesen Test für insgesamt drei Mal mit 30
3. s zwischen Studien. Wenn eines oder beide Hinterbeine für jede der drei Studien geballt sind, zeigt die Ratte motorische Störungen. Notieren Sie die Daten (manuell in Noten) als entweder ein- oder beidseitig Megalosauridae Defizit vorhanden, wenn es stimmt, dass Pressen in allen drei Studien.

8. Bewerten Motorik auf die Rotarod

1. zum Einrichten der Rotarod, legen Sie eine Bank-Pad unter den Rotarod und Beschleunigung auf 4-40 Umdrehungen pro Minute (u/min) über 2 min (die Rate steigt von ~0.3 u/min/s). Für einen 12-Wochen-Zeit-Kurs, laufen die Fächer mit 2, 4, 8 und 12 Wochen nach gen übertragen.
2. Ermöglichen die Ratte zu akklimatisieren, um den Prüfraum für 20 min.
3. , Die Ratte die Rotarod zum ersten Mal verwenden, zuerst beginnen die Rotarod mit einer eingestellten Geschwindigkeit von 4 u/min und dann legen Sie die Ratte auf die Rotarod zu trainieren. Lassen Sie die Ratte zu gehen für eine volle Umdrehung 4 u/min, dann beginnen die Beschleunigung und ermöglichen Sie die Ratte zu Fuß auf den Rotarod, bis es fällt ab. Training fortsetzen, bis die Ratte konsequent für mindestens 40 Fuß s. Eine gesunde, junge Erwachsene Ratte wird leicht auf diese Weise trainiert werden.
   1. Im Falle einer Ratte mit einer spürbaren motorischen Beeinträchtigungen, die kann verhindern, dass der Ratte erreichen eine Basislinie Latenz von 40 fallen s, bieten der Ratte 3-5 Ausbildung Versuche vor Beginn erzielte Rotarod.
4. Um Rotarod testen zu beginnen, legen Sie die Ratte auf die Rotarod und Beschleunigung der Rotarod beginnen. Notieren Sie die Zeit, an der die Ratte aus der Rotarod fällt; Dies ist die Latenz zu fallen. Bleibt die Ratte auf die Rotarod nach 120 s, Kappe die Sitzung an diesem Punkt, entfernen Sie die Ratte aus der Rotarod und aufzeichnen eine Herbst-Latenz von 120 s.
5. Wiederholen Sie die Prüfung zweimal für eine Gesamtmenge von drei Studien. Um die Auswirkungen von Müdigkeit zu minimieren, Raum der Prüfungen mindestens 5 min auseinander. Die Ergebnisse der drei Studien im Durchschnitt. Eine ungestörte Erwachsenen Ratte hat in der Regel eine durchschnittliche Wartezeit von fallen > 40 s.
6. Legen Sie die Ratte zurück in den Käfig, und reinigen Sie die Rotarod und Umgebung mit 70 % Ethanol.

9. Quantifizierung der GFP Expression im Kleinhirn

1. die Ratten zu betäuben und mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und dann 4 % Paraformaldehyd durchspülen. Sezieren Sie das Gehirn und das Rückenmark zu und Einweichen Sie Gewebe in das Fixiermittel über Nacht und verschieben Sie sie dann in eine 30 % ige Saccharose-Lösung. Nach Gleichgewichtherstellung, geschnitten 50 μm koronalen Abschnitte auf einer verschiebbaren Mikrotom mit dem Einfrieren der Stufe ^{4 , 5 , 6}.
2. Wählen Sie 3-6 Abschnitte des Kleinhirns, die gleichmäßig verteilt sind in der Vermis, der zentralen Lappen des Kleinhirns. Eindringmittel Label der GFP, das Signal zu maximieren. Den primäre Antikörper für GFP bei 1: 500 und verwenden die Alexa-488-konjugierten Sekundärantikörper bei einer Verdünnung von 1: 300 ^{4 , 5 , 6}.
   Hinweis: Siehe Referenzen ^{4 , 5 , 6} für weitere Einzelheiten über die Probenahme, schneiden und färben Verfahren.
3. Photomicrograph mit geringer Vergrößerung Objektiv mit einem Mikroskop jeden Abschnitt in der definierten Region von Interesse. Verwendung einer 2,5 X Objektiv (N.A 0,12) und Filter set 10, 450-490/515-565 Erregung/Emission). Halten Sie die Kameraeinstellungen (Belichtungszeiten, z. B. 2 s) das gleiche über Proben analysiert werden. Speichern als ein. TIF-Datei.
4. Öffnen der Mikrophotographie in der weithin verfügbar Scion Bildprogramm; zwei Fenster öffnet sich. In der Nähe des Fensters angegeben als " indizierte Farbe ".
5. Wählen " Optionen ", dann " Dichte SliceŔ eine Palette von Schattierungen in rot im Fenster Look-Up Table (LUT) angegeben werden wird. Verwenden Sie den Cursor im Fenster, die spezifische GFP Kennzeichnung nur ausfüllen und aufhören, wenn die unspezifischen Hintergrund beginnt im Bild abgeholt werden.
   Hinweis: Damit wird die fluoreszierenden Bereich auf der Mikrophotographie quantifiziert werden markiert. Die Einstellungen sollten optimiert werden, um speziell alle sichtbar fluoreszierenden Zellen zu erfassen. Mit etwas Übung kann diese Methode genau die spezifischen Fluoreszenz hervorheben.
6. Vor der Messung fluoreszierende Bereich zunächst sicherstellen, dass die Messungen in die richtigen Einheiten (Pixel) sind. Um dies tun, klicken Sie " Analyse ", dann " Set ScaleŔ die vierte Zeile sollte sagen " Einheiten ". Wählen Sie aus der Dropdown-Liste, Pixel, gemessen in Pixel ein, und klicken Sie dann auf " OK ". Umschalten der Analysemöglichkeiten zu " gehören innere Löcher " um die Einbeziehung der gesamten Zellkörper in der Analyse zu gewährleisten.
Klicken Sie
7. um die fluoreszierende Fläche messen " Analyse " und klicken Sie dann auf " Maßnahme ". Um diesen Wert anzuzeigen, klicken Sie " Analyze " klicken Sie dann auf " zeigen ResultsŔ ein Fenster wird angezeigt. Die fluoreszierende Flächenmessung werden unter der Überschrift mit der Bezeichnung " Bereich ".
8. Um Standardisierung innerhalb der Messungen zu gewährleisten, ändern nicht die hervorgehobenen Werte im Fenster LUT.
9. Wenn alle Messungen aufgezeichnet wurden, Durchschnittswerte für jedes Tier (von 3-6 Teile pro Tier). Verwenden Sie einen geeigneten statistischen Test, um transduced Bereiche zwischen den Gruppen zu vergleichen. ⁶

Representative Results

TDP-43 induzierte motorische Beeinträchtigungen treten innerhalb von 2-6 Wochen abhängig von der Dosis der AAV TDP-43 verwendet (Abbildung 1). Erfolglose Schweif Vene Injektionen führen teilweise oder keine Beeinträchtigungen; die AAV muss in die Blutbahn um den Effekt zu produzieren gelangen. Eine erfolgreiche Injektion von AAV GFP führt GLP Ausdruck im gesamten Gehirn und Rückenmark in gewissem Vektor-Dosis abhängig. Bei der Verwendung der starken rekombinante Promotor auf Laufwerk Ausdruck, das Zytomegalievirus Huhn Beta-Actin Hybrid Promotor, auch bekannt als die CAG-Promoter, gibt es effiziente Ausdruck in der CNS, sowie mehrere andere Gewebe wie Leber und Herz. ^{4 , 5 , 10} innerhalb der Ratte CNS, bei Verwendung von AAV9 oder AAV PHP. B Vektoren, das Muster ist überwiegend neuronale Transduktion und nur spärlich, sporadische glialen Signaltransduktion. ^{4 , 8} da keine geschlechtsspezifischen Unterschied in Transduktion Effizienz mit der Wide-Scale-Methode bei Ratten beobachtet wurde, Weibchen in der Regel intravenös Gentransfer durch ihre geringere Gewichte dienen. ⁶

Das semi-quantitativen bildgebende Verfahren beschrieben ist schnell und zuverlässig, denn es ein ausgezeichnetes Signal-Rausch-Verhältnis gibt. Eine Probe nicht ausgestrahlt wird mit einem transduced Beispiel in Abbildung 2 mit beide Proben mit der GFP-Antikörper befleckt verglichen. Werte aus diesen Proben gesammelt zeigen 0,3 % Rauschen (von den Werten aufgeführt in Abb. 2 b, D) in der Stichprobe nicht ausgestrahlt, die als unerheblich angesehen werden kann. Angesichts der hervorragende Signal-Rausch-Verhältnis, ist diese Methode für schnelle Vergleiche der experimentellen Bedingungen wie Vektortypen, Vektor-Dosis, Geschlecht, Alter, etc. gültig.

Abbildung 1: Breit angelegte AAV9 TDP-43 Gentransfer in Ratten verursacht progressiven motorischen Beeinträchtigungen. Rotarod Leistung 1-3 Wochen nach gen übertragen das GFP-Steuerelement oder das ALS bezogene gen TDP-43. Die Probanden wurden vor der Gentransfer getestet und die nachfolgenden Messungen wurden im Verhältnis zum Baseline-Zeitpunkt ausgedrückt. Eine normale unbehandelte Ratte bleiben auf der Rotarod von 60-90 s unter diesen Bedingungen. Diese Zahl wurde von⁶geändert.

Abbildung 2: Schnelle Quantifizierung der GFP-positiven fluoreszierende Bereich im Kleinhirn nach intravenöser Gabe der AAV, die Ratte. A, B) nicht ausgestrahlt Probe, die mit der GFP-Antikörper gefärbt wurde. C, D) Probe aus einer Ratte AAV9 GFP empfangen. B, D) die Dichte Scheibe Option auf Scion Bild wird verwendet, um selektiv die fluoreszierenden Bereich in rot zu markieren, und dann die roten Pixel werden durch das Programm gezählt. Die Dichte Scheibe Option sollte aller sichtbaren fluoreszierenden Zellen markieren, wie in C. Der rote Bereich ausgedrückt in quadratischen Pixeln berechnet das Programm zeigt sich in B, D. Der Zeitpunkt war 4 Wochen nach einer Rute Vene Injektion der AAV9 GLP, eine junge Erwachsene Ratte in einer Vektor-Dosis von 1 x 10¹⁴ Vektor Genomen/kg. Maßstabsleiste a beträgt 536 µm; gleiche Vergrößerung in A-D. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Eine Vielzahl von Touren für AAV-Vektoren wurden getestet: Intra-Parenchym, Intra-Cerebroventricular, Intra-thecal, intravenöse, intranasale, intramuskulären, etc.. Jede Route kann sowohl vor-als auch Nachteile haben. Heckrotorblätter Vene Verabreichung von AAV an erwachsenen Ratten ist eine zuverlässige Methode zur Erreichung konsistente Transduktion des ZNS. Die peripheren Injektionsverfahren vermeidet die Einführung einer Injektionskanüle in der CNS-Gewebe und ist daher minimal invasiv. Die effiziente CNS-Ausdruck, der mit dieser Methode erreicht werden kann ist der größte Vorteil der Technik. Weitere praktische Vorteile sind, dass die Injektion Methode sehr schnell (ca. 10 min pro Tier von Anfang bis Ende) und dass die Rute Vene Injektionen nicht sehr technisch sind und daher schnell zu bewältigen. Ein großer Nachteil ist sicherlich, dass viel hohe Titer Vektor nötig ist, die ein Problem der Machbarkeit werden wenn die AAV Preps unterhalb von 1 x 10¹³ Vektor Genome/ml. Mit der Verfeinerung des Vektors targeting Funktionen könnte dieser Ansatz vorteilhaft für klinische Gentherapie in der Zukunft gegeben, dass die gen-Lieferung durch eine periphere Route ist und somit relativ nicht-invasiv. Auf der anderen Seite mehr direkte Intra zerebrospinale flüssige Spritzen könnte vorteilhaft sein, in präklinische und klinische Ansätze aus zwei Gründen: begrenzter Verbreitung des Vektors und die Verwendung von niedrigeren Vektor-Dosen.

Bei Ratten mit dunkler Pigmentierung kann die Rute Vene schwieriger zu identifizieren sein. Also, können alternative Routen der Verwaltung wie Retro-Orbital-Injektionen oder intravenösen Injektionen, die Stammvenen verwendet werden. Die Retro-Orbital-Injektionen gezielt eine Dichte Kapillare Bett und sind so ähnlich wie eine intravenöse Injektion. Vielleicht für Mäuse und Ratten auch die Retro-Orbital-Methode kann als Rute Vene Injektionen einfacher sein, sondern drei Studien großen Konsequenz der Schweif Vene Injektionen bei erwachsenen Ratten. ^{6 , 8 , 9} die meisten dieser Arbeiten verwendet einen starken rekombinanten Promotor auf Laufwerk Transgene Ausdruck, der Zytomegalievirus Huhn Beta-Actin Hybrid Projektträger. ¹⁰ wenn der Experimentator Ausdruck mit den Neuronen im ZNS abgrenzen will, kann Zelle typspezifische Förderer, zum Beispiel der synapsin Projektträger versucht werden. ^{8 , 11}

In Bezug auf das bildgebende Verfahren ist es eine schnelle, semi-quantitative Methode zur Abschätzung der Transduktion Effizienz. Wenn richtig durchgeführt, ergibt der Test eine zuverlässige Schätzung des Bereichs transduced. Der Goldstandard für zählen Objekte im CNS Gewebe Stereologie aufgerufen. Es dauert ca. 75 min. pro Tier stereologischen Sonde in einer Region of Interest im Gehirn führen, während das beschriebene Verfahren schneller bei 20 min pro Tier oder sogar weniger ist, wenn hochskaliert. Wenn alle Bedingungen gleich gehalten werden und die gleiche Region richtig abgetastet, die Konsistenz der Daten nähert sich die tolle Konsistenz der Stereologie und große Gruppen von Proben analysiert werden können schnell in Massen.

Es gibt eine Reihe von technischen Anmerkungen, die Diskussion weiter zu rechtfertigen. Für Abschnitt 1 zu Vektor-Dosen, die Vektor-Dosen erforderlich für effiziente Transgene Ausdruck bei Ratten wurden bestimmt durch Versuch und Irrtum und Dosis-Wirkungs-Wang Et Al., Dayton Et Al.und Jackson Et Al., sowie vorherigen Dosen bei Mäusen (Foust Et Al. und Duque Et Al) verwendet. ^{1 , 2 , 4 , 5 , 6} sicherlich erzeugt ein kritischer und potenziell Bandbreitenbegrenzung Schritt hohe Titer AAV Preps um die wirksame Dosis zu erreichen.

Abschnitt 3 werden bezüglich den Vektor in der Nadel, Luftblasen in der Injektionslösung laden so gut wie möglich vermieden. Eine kleine Menge an Luft sollte nicht problematisch sein, wie dies von der Lunge herausgefiltert werden kann, aber übermäßige Mengen an Luft in die Vene injiziert können dazu führen, dass eine venöse Luftembolien was zu Tod. ¹² wenn Luftblasen in der Spritze vorhanden sind, das Virus aus der Spritze ausgewiesen werden sollten, und eine neue Spritze sollte geladen werden. Um die Schaffung von Luftblasen zu vermeiden, achten Sie darauf, die Nadel in der Nähe der Tropfen des Vektors auf die Parafilm mit der Fase nach unten zu positionieren. Wenn die Mehrheit des Vektors in die Nadel aufgegriffen worden ist, erstellen Sie sehr langsam die restliche Lösung. Eine kleine Luftpolster bilden sich auf der Rückseite der Spritze. Dies ist der Totraum und wird nicht injiziert werden. Um sicherzustellen, dass es im hinteren Bereich der Spritze bleibt, halten Sie die Spritze horizontale oder Spitzen nach unten und streichen Sie die Spritze nicht.

Für Abschnitt 5 über die Injektionen um sicherzustellen, dass die Injektion in die Vene und nicht das Gewebe rund um die Vene, sobald die Nadel eingeführt wurde geht, zurückziehen Sie, leicht auf den Kolben, um Unterdruck an der Nadelspitze zu erstellen. Wie erwähnt, wenn die Nadel in die Vene ist, Blut soll fließen zurück in die Nadel und sichtbar an der Basis der Nadel. Während der Injektion in die Vene, muss wenig Widerstand spürbar sein, wenn die Nadel entsprechend gesetzt ist. Wenn erheblicher Widerstand gestoßen ist, dann ist es wahrscheinlich, dass die Injektion in das Gewebe des Hecks wird wie oben beschrieben. Es ist auch möglich, durch die Vene, verursacht eine "Defekte Vene", wenn der Winkel, dass die Nadel eingeführt wird zu steil ist, wenn der Gradmesser für die Nadel für die Vene zu groß ist, oder wenn die Einspritzgeschwindigkeit zu schnell zu viel Druck auf die Vene punktieren. Eine durchgebrannte Vene kann während der ersten Punktion der Vene oder während der Injektion auftreten. Um zu vermeiden, Punktion der Vene während der Injektion oder mit der Nadel von der Vene verdrängt werden, sollte die Spritze stabilisiert werden, indem Sie halten am Ende der Spritze gegen das Heck wie erwähnt. Wenn die Nadel verdrängt wird oder eine zweite Injektion aus einem anderen Grund erforderlich ist, kann die zweite Injektion entweder an der seitlichen Schweif Vene auf der gegenüberliegenden Seite oder näher an den Körper auf der gleichen Seite erfolgen.

Für Abschnitt 8 läuft die Rotarod Assay in 4-wöchigen Abständen während des Experiments. Normal, unbehandelte Ratten haben bessere Noten, wenn sie jüngere (4-6 Wochen alt) als im höheren Lebensalter sind. Die Defizite in der Flucht-Reflex als Überleben der Extremität Funktion im Laufe der Zeit dargestellt. Die Überleben Kurven werden durch eine Log-Rank-Test auf Prism Software analysiert.

Abschnitt 9 bezüglich der Transduktion Analyse, mit etwas Übung wird das Verfahren relativ schnell, ca. 20 min pro Tier oder weniger nehmen. Dieser Assay ist auch sehr zuverlässig, da Gewebe nicht ausgestrahlt, die werden eine im Grunde unerheblich Lesung (mit der GFP Färbeverfahren verarbeitetAbbildung 2 b), und da gibt es ein großer Dynamikbereich, das Auslesen. Die meisten der GFP Fluoreszenz leitet sich von Purkinje-Zellen ausgestrahlt, und somit ihre große Zahl einen großen Dynamikbereich. So weit, des gen-Übertragungs-Wirkungsgrades erreicht nicht die Messwerte im gesamten Bereich (d. h. 100 % Transduktion von Purkinje-Zellen), zumindest wenn sättigen verursacht hat der Gentransfer wird erwachsenen Ratten verabreicht. Wenn Sättigung des gesamten Feldes ein Problem darstellten, konnte dann das Signal durch die Anwendung einer niedrigeren Dosis der Vektor in separaten Tiere oder durch die Messung nur der schwächeren, nativen GFP Fluoreszenz, Verzicht auf das Färbeverfahren gesenkt werden. Sicherlich könnte die Transduktion von anderen Zelltypen im Kleinhirn auch einen Beitrag zum das Signal, aber die meisten von was ist gut sichtbar und durch das Programm gezählt ist eindeutig der Zellkörper in den Purkinje Zelle Schichten und ihre dendritischen Bäume in der molekularen Schichten in das Kleinhirn, basierend auf bekannten Position und Morphologie. Eine große Herausforderung an die Methode ist, dass Luftblasen oder fluoreszierenden Verunreinigungen gezählt werden konnten, die verunreinigen damit die Messwerte. Abschnitte und Felder mit diesem Lärm werden nicht verwendet; Saubere Proben frei von unspezifischen Lärm sind erforderlich. Da GFP fremdes Protein ist, gibt es keine Hintergrundgeräusche im Gewebe, so dass die spezifischen Fluoreszenz genau erfasst und geschätzt werden kann. In diesen Studien wurden die GFP Mikrofotos in Farbe erfasst und dann in Graustufen mit einem Bildbearbeitungsprogramm als Scion Bild konvertiert. Allerdings wäre es einfacher zu GLP in schwarz und weiß in erster Linie für die nachfolgende Analyse in Scion Bild erfassen. Frühere Studien analysiert die Transduktion von Rückenmark unteren Motoneuronen auf prozentualer Basis, d. h. der Anteil der Motoneurone GFP zum Ausdruck zu bringen. ^{4 , 6} die Analyse des Kleinhirns ist jedoch schneller, erfordern weniger Einzelteilen und scheint auch konsistent und zuverlässig zu (z. B. über einzelne Beobachter der Bewertungen). Das schnelle zerebelläre bildgebende Verfahren ist somit ein guter schnelle Index für den Erfolg der peripher-zentrale Gentransfer. Analysen des Rückenmarks Transduktion und Beispiele für die Transduktion von anderen Websites im Nervensystem Ratte wurden in Wang Et Al., Dayton Et Al.und Jackson Et Al. berichtet ^{4 , 5 , 6}

Zusammenfassend ist die intravenöse Verabreichungsweg minimalinvasive; das ZNS kann durch eine periphere Verwaltung ausgerichtet sein, ohne eine Nadel in das Gehirn oder Rückenmark. Zusammen mit weiteren Verfeinerung des Zielens weiterhin relevanten vorklinischen und klinischen Gentherapien intravenöse Lieferung verwenden, während viele auf unzähligen zukünftigen Arten von grundlegenden funktionalen Studien an Ratten durch die expansive Transduktion in Suche nach profitieren können Testen von Hypothesen der Genfunktion in vivo zu beschleunigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scale	Pelouze	SP5
Nalgene bucket	Thermo Scientific	12014000	4000 mL
Microcentrifuge tube	USA Scientific	1615-5500
Lactated Ringer's Solution	Baxter Healthcare	0338-0114-04
Mini vortexer	Fisher Scientific	128101
Centrifuge	Eppendorf	22624415
Laboratory film	Bemis	PM996
1-mL syringe	BD	309626	Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection
30g needle	BD	305106
Isoflurane	Piramal Healthcare	66794-013-25	Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask	Kopf Instruments	906
Gauze	Henry Schein	100-2524	2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips	USA Scientific	1111-0816
Micropipet	Gilson	4642080
Gas anesthesia vaporizer	SurgiVet	4214322	Classic T3
Gas anesthesia scavenger	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
Heating pad	Sears	17280
Bench pad	VWR	56617-006
Rotarod	Panlab/Harvard Apparatus	76-0772	4 rats/ 4 mice
70% Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 proof
70% Isopropanol	VWR	89108-160
Scion Image	Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody	Invitrogen	A11122	Primary Antibody - 1:500 dilution
AlexaFluor 488	Invitrogen	A11070	Secondary Antibody - 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope	Zeiss