Metoder og tupper for intravenøs administrasjon av Adeno-assosiert Virus rotter og evaluering av sentralnervesystemet signaltransduksjon

Summary

Metoder for en bred sentralnervesystemet gen levering rotta er dekket. I dette eksemplet er hensikten å etterligne en sykdom som påvirker hele ryggmargen. Den utbredt signaltransduksjon kan brukes til å levere en terapeutisk protein til CNS fra en engangs, ekstern administrasjon.

Abstract

Adeno-assosiert virus (AAV) vektorer er en nøkkel reagens i neurosciences for gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR), optogenetics, grobunn-lox målretting, etc. Hensikten med denne oppgaven er å hjelpe etterforskeren forsøker ekspansive sentralnervesystemet (CNS) genoverføring i rotte via hale blodåre injeksjon av AAV. Bred uttrykket er relevante for forhold med utbredt patologi, og en rotte modell er viktig på grunn av sin størrelse og fysiologiske likheter med human sammenlignet med mus. I dette eksemplet programmet brukes en bred neuronal signaltransduksjon til å etterligne en nevrodegenerative sykdommer som påvirker hele ryggmargen, amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Effektiv bred CNS signaltransduksjon kan også brukes til å levere terapeutiske protein faktorer i pre kliniske studier. Etter et etter injeksjon uttrykk intervall flere uker evalueres effekten av signaltransduksjon. For en grønn fluorescerende protein (GFP) kontroll vektor anslås mengden GFP i lillehjernen raskt og pålitelig ved en grunnleggende bildebehandlingsprogrammet. For motor sykdom fenotyper hjulpet av ALS relaterte protein transactive svar DNA-bindende protein av 43 kDa (TDP-43), scoret underskuddene escape refleks og rotarod. Utover sykdommen modellering og genterapi finnes det ulike mulige programmer for bred genet målretting beskrevet her. Utvidet bruk av denne metoden vil hjelpe å påskynde hypotesetesting i nevrovitenskap og neurogenetics.

Introduction

Rekombinant adeno-assosiert virus (AAV) vektorer er uunnværlige verktøy for CNS forskning fordi de er så effektiv for transducing nerveceller i vivo. AAV vektorer er svært allsidig for å studere ulike effekter av transgener og protein isoformene, ulike vev, andre arter og ulike bruksmåter. For eksempel kan AAV administreres til mus av en enhet, relativt ikke-invasiv, intravenøs injeksjon til transduce nerveceller i CNS som første beskrevet i Foust et al. og Duque et al. (se JOVE papir av Gombash et al. (2014)). ^{1 , 2 , 3} denne gen levering brukes i rotter effektivt uttrykke enten grønne fluorescerende protein (GFP) eller ALS protein, transactive svar DNA-bindende protein av 43 kDa (TDP-43) i CNS. ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} arbeider i rotter er viktig fordi det rotten fysiologiske og metabolske parametere er nærmere mennesker i forhold til mus og opptreden og toksikologiske analyser laget spesielt for rotter. Videre transgene rotte linjer blir tilgjengelig som kan benyttes i AAV genet overføring studier.

Metodene vises detaljert for ekspansive CNS genoverføring rotta og rask, pålitelig kvantifisering av resultatene. Bred CNS signaltransduksjon brukes til å etterligne symptomer av ALS i rotter ved å uttrykke TDP-43 gjennom ryggmargen. Metoden er halen blodåre injeksjoner av TDP-43 vektoren unge voksne rotter som brukes i Jackson et al. ^{6 , 8 , 9} etter ukene TDP-43-indusert motor underskudd er scoret to metoder: unnslippe refleks og rotarod som brukes i Dayton et al. og Jackson et al. ^{5 , 6 , 7 , 9} for kontroll GFP vektor, post mortem analyse, fluorescerende området av lillehjernen beregnes som en indeks av signaltransduksjon effektivitet i Jackson et al. ^{6 , 8} analyse av lillehjernen har vist seg for å være en rask og pålitelig indeks av graden av CNS signaltransduksjon etter eksterne gen levering og skal kunne brukes til en rekke tilnærminger forsøker enhet-til-sentrale genoverføring.

Protocol

alle prosedyrer fulgt riktig NIH retningslinjene. Alle prosedyrer fulgte dyr protokoller som ble godkjent av Animal Care og bruk komité i LSU Health Sciences Center i Shreveport. Sprague-Dawley hunnrotter for 6 ukens av alderen ble brukt for denne prosedyren.

1. fastslå doser/mengder vektor nødvendig

1. veie rotter injiseres og bestemme mengden av viral vektor nødvendig for hvert dyr basert på titer (konsentrasjon) av vektor preparatet. Bruke vektor doser som har vært vellykket for effektiv uttrykk i rotte CNS tidligere (se Jackson et al. ⁶).
   Merk: For AAV9 TDP-43 eller AAV9 GFP, en typisk dose er mellom 3 x 10 ¹³ - 1 x 10-¹⁴ vektor genomer/kg. Unge voksne rotter for 6 ukens av alderen veier ca 150 g.
2. Gjør tilsvarende doser per kg i alle dyr for systematisk sammenligninger. Sikre volumet ikke overstiger standard rådet injeksjon volumer (250-500 µL for rotte 250 g). En typisk injeksjon er 200 μl til en ung voksen rotte.

2. Forberede arbeidsstedet

1. samle alle nødvendige forsyninger: en parafin film kvadratmeter (ca 5 x 5 cm) per dyr, en spritpute forberedelse per dyr, gasbind pads (2-3 per dyr), Pipetter tips og brønnene.
2. Forberede arbeidsgruppen overflaten ved rengjøring overflaten med 70% etanol. Plass en heten pute med temperaturen sette å lav (~ 37 ° C). Plasser en benk pad på varmeputen.
3. Forberede gassen anestesi (isoflurane). Sikre tilstrekkelig oksygen og gass anestesi for prosedyren. Rengjør induksjon chamber og anestesi masken med 70% etanol, og plassere anestesi masken på benken puten.

3. Forberede vektoren

1. tine vektoren ved romtemperatur, og Merk en steril microcentrifuge tube for hvert dyr.
2. Pipetter volumet av AAV bestemt i trinn 1.1 inn i passende røret og ta volumet til ønsket injeksjon volumet (her, 200 μl) med lactated Ringer ' s løsning eller saltløsning.
3. Puls vortex utvalget for 1-2 s og deretter puls sentrifuge for 5 å bringe prøven til bunnen av røret.
4. Pipetter totale injeksjon volumet rotta ut av røret og på kvadratet parafinen film.
5. Plasserer en 30 gauge nål på 1 mL sprøyte.
6. Sted nålen med skråkanten vender ned i vektor av parafin filmen. Trekke tilbake på sprøytestempelet til alle virus i sprøytespiss- og sprøytebytteprogrammer. Være forsiktig for å unngå tegning luftbobler i nålen, som blir lettere med praksis.

4. Forberede rotta

1. slå oksygen opptil 1 L/min og sett isoflurane anestesi 5%. Sikre at gass anestesi strømmer til induksjon kammeret ved å sjekke alle koble slanger og stopcock orientering.
2. Sett rotta i anestesi induksjon gasskammeret ca 3 min til rotta er unresponsive.
3. Sikrer tilstrekkelig dybdeskarphet anestesi ved pinching tåen. Det bør ikke være noen bevegelse i fot eller Ben etter tå klemme.
4. Redusere isoflurane anestesi til 2% for vedlikehold av anestesi og justere til stopcock slik at anestesi strømmer til anestesi masken.
5. Sett rotta ' s nese i anestesi masken og justere rotta slik at det ligger på høykant.
6. Identifisere lateral hale venen.
   Merk: Lateral hale venene ligger på ca 10 og 2 o ' klokke med dorsal toppen av halen som 12 o ' klokke. Med rotten liggende på sin side, lateral hale venen skal være vendt opp
7. Tørke injeksjonsstedet området med alkohol forberedelse pad. Injeksjonsstedet er to tredjedels ned lengden på halen.

5. Injisere vektoren

1. fast holder halen litt over injeksjonsstedet området med én finger direkte over venen for sideveis hale, dette vil dilate venen.
2. Med skråkanten vender opp, justere nålen med synlige hale venen i samme retning.
3. Pierce huden over halen venen stund tar stor forsiktighet for å unngå andre hånden holder halen og trykke på halen venen.
4. Slipper press fra halen venen å tillate vanlige blodstrøm.
5. Flytte nålen i venen. For å sikre at nålen har punktert hale blodåre, trekke tilbake litt på stempelet. Hvis nålen i blodåre, vil blod flyte inn nålen.
   1. Omplasser nålen etter behov. Deretter for å stabilisere nålen, flytte hånden over injeksjonsstedet til under injeksjonsstedet og holde slutten av sprøyten mot halen.
6. Sakte injisere vektoren i halen (ca 20 µL/s).
   Merk: Venen kan miste farge som det vektor renn gjennom den. Tegn at løsningen var injiseres utenfor venen inkluderer blebbing, blanchering av huden eller motstand når sprøytebruk vektoren. Med praksis, ekstra vaskulær eksponering kan minimeres.
7. Når vektoren har blitt administrert, fjerne nålen fra rotta og trykke en gauze pute mot injeksjonsstedet for å stoppe blødningen for 30-60 s.

6. Rydde opp

1. slå av isoflurane anestesi og oksygen. Overvåke rotta til det gjenvinner bevisstheten, og deretter returnere det til buret sitt.
2. Forsiktig plassere alle nåler i beholderen. Kast alle andre disponibel materialer som er potensielt forurenset med AAV i en passende biohazard beholder. Feilfri arbeider stasjonene med 70% etanol.

7. Evaluere hindlimb rømme refleks

Merk: Hindlimb underskudd vanligvis oppstår 2-6 uker etter TDP-43 genoverføring, avhengig av vector-dose.

1. På en flat overflate klar av rusk, med to fingre fange rotta ' s hale ca 2 cm fra kroppen. Løft rotta forsiktig helt forelimbs henger mens ventrale undersiden av rotte.
   1. Utføre prosedyren ukentlig i eksperimentell tid-løpet etter genoverføring (f.eks opp til 12 uker etter genoverføring).
      Merk: Også score forlemen underskudd på denne måten, men hindlimb underskudd er mer sannsynlig å forekomme i denne modellen, avhengig av vektor dose brukes.
2. Observerer hindlimbs for 10 s. Merk Hvis ett eller begge hindlimbs knipe mot midtlinjen under 10 s.
3. Gjenta denne test for totalt tre ganger med 30 s mellom forsøkene. Hvis ett eller begge hindlimbs er knyttet til hver av tre forsøk, viser rotta motor dysfunksjon. Registrere data (manuelt i notater) som enten ensidige eller bilaterale hindlimb underskudd tilstede hvis det er konsekvent knuger over alle tre forsøk.

8. Vurdere funksjon på rotarod

1. til å definere rotarod, plassere en benk pute under rotarod og angi akselerasjon 4-40 omdreininger per minutt (rpm) over 2 min (hastigheten øker av ~0.3 rpm/s). For en 12 ukers tid-kurs, kjøre fagene 2, 4, 8 og 12 uker etter genet overføre.
2. Tillater rotta å acclimate til testing rom i 20 min.
3. å trene rotta å bruk rotarod for første gang, først starter rotarod med innstilt hastighet av 4 rpm, så sette rotta på rotarod. Tillate rotta å gå for en fullstendig revolusjon på 4 rpm, så starte akselerasjon og tillate rotta å gå på rotarod fram til det faller. Fortsette treningen til rotta kan konsekvent gå i minst 40 s. Rotte sunn, unge voksne vil være lett trent på denne måten.
   1. i rotte med en merkbar motor svekkelse, som kan hindre rotta å oppnå en planlagt ventetid å falle på 40 s, gi rotta 3-5 trening forsøk før du starter rotarod scoring.
4. For å begynne rotarod testing, plassere rotta på rotarod og starte akselerasjon av rotarod. Merk tiden der rotta faller fra rotarod; Dette er ventetiden å falle. Hvis rotta forblir på rotarod etter 120 s, cap økten på dette punktet, fjerne rotta fra rotarod og registrere en høst ventetid 120 s.
5. Gjenta testing to ganger for totalt tre forsøk. For å minimere effekten av tretthet, space forsøk minst 5 min fra hverandre. Gjennomsnitt av de tre forsøkene. En usvekket voksen rotten har vanligvis en gjennomsnittlig ventetid å falle av > 40 s.
6. Plasser rotta tilbake i buret, og rengjør rotarod og omegn med 70% etanol.

9. Kvantifisering av GFP uttrykk i lillehjernen

1. bedøve rotter og perfuse med fosfat bufret saltvann (PBS) og deretter 4% paraformaldehyde. Dissekere hjernen og ryggmarg og suge vev i bindemiddel over natten og flytte dem til en 30% sukrose løsning. Etter balanse, kuttet 50 μm framskaffet på en glidende mikrotom med frysing scenen ^{4 , 5 , 6}.
2. Velger 3-6 delene av lillehjernen som er jevnt fordelt i vermis, den sentrale flik av lillehjernen. Fluorescently etiketten GFP å maksimere signalet. Bruk primære antistoffer for GFP på 1:500 og bruke Alexa-488 konjugert sekundære antistoffer på en fortynning av 1:300 ^{4 , 5 , 6}.
   Merk: Se referanser ^{4 , 5 , 6} for flere detaljer om prøvetaking, skjæring, og flekker prosedyrer.
3. Photomicrograph hver del i den definerte regionen rundt med en lav forstørrelse linse med et mikroskop. Bruk et 2,5 X mål (N.A. 0,12) og filter angi 10, 450-490/515-565 eksitasjon/utslipp). Holde kamerainnstillingene (eksponering ganger, f.eks 2 s) samme over å bli analysert. Lagre som en. TIF-fil.
4. Åpner photomicrograph i utbredt Scion bildet programmet, to vinduer åpnes. Lukk vinduet angitt som " begrensede farger ".
5. Velg " alternativer ", deretter " tetthet SliceŔ en rekke gråtoner vises i rødt i vinduet Look-Up Table (LUT). I vinduet Bruk markøren for å fylle ut spesifikke GFP merking bare og stopper når ikke-spesifikke bakgrunnen begynner å bli plukket opp i bildet.
   Merk: Dette vil markere fluorescerende området på photomicrograph å være kvantifisert. Innstillingene skal optimaliseres spesielt fange alle synlig fluorescerende. Praksis denne metoden kan nettopp markerer den bestemte fluorescensen.
6. Taes fluorescerende området først sikre at målingene gjort i riktig enheter (piksler). Gjør klikk " analyser ", deretter " angi ScaleŔ den fjerde linjen skal si " enheter ". Velg piksler måle i piksler, og klikk deretter rullegardinlisten, " OK ". Veksle analysealternativene å " inkludere indre hull " å sikre inkludering av hele cellen kroppen i analysen.
7. å måle fluorescerende området, klikk " analyser " og deretter " mål ". Klikk for å se denne verdien, " analyser " deretter " vise ResultsŔ en resultatvinduet vises. Fluorescerende områdemålenheten vil være under overskriften merket " området ".
8. For å sikre standardisering på tvers av målinger, ikke endre de merkede verdiene i vinduet LUT.
9. Når alle mål er spilt, gjennomsnittlige verdiene for hvert dyr (fra 3-6 deler per dyr). Bruk en passende statistiske test for å sammenligne de transduced områdene mellom gruppene. ⁶

Representative Results

TDP-43 indusert motor impairments skulle oppstå innen 2-6 uker avhengig av dose av AAV TDP-43 som brukes (figur 1). Mislykket hale blodåre injeksjoner vil resultere i delvis eller ingen nedskrivninger; AAV må nå blodet å produsere effekten. En vellykket injeksjon av AAV GFP vil føre GFP uttrykk i hjernen og ryggmarg på vector-dose avhengige måte. Når du bruker sterk rekombinant arrangøren til stasjonen uttrykk, cytomegalovirus kylling beta begrepsordbok hybrid arrangøren, også kjent som CAG selskapet, er det effektiv uttrykk i CNS samt flere andre vev som lever og hjerte. ^{4 , 5 , 10} i rotta CNS, når du bruker AAV9 eller AAV PHP. B vektorer, mønsteret er overveiende neuronal signaltransduksjon og bare sparsom, sporadisk glial signaltransduksjon. ^{4 , 8} siden ingen Kjønnsforskjeller i signaltransduksjon effektivitet ble observert i rotter med metoden bred, kvinner er vanligvis brukt for intravenøs genoverføring på grunn av sin lavere vekter. ⁶

Semi kvantitative tenkelig metoden beskrevet er rask og pålitelig fordi det er en utmerket signal-til-støy-forhold. Et ikke-transduced utvalg sammenlignes med et transduced utvalg i figur 2 med begge prøver med GFP antistoffer. Verdiene hentes fra disse prøvene indikerer 0,3% støy (fra verdiene som vises i figur 2B, D) i ikke-transduced utvalget, som kan betraktes som ubetydelig. Gitt utmerket signal-til-støy forholdet, er denne metoden gyldig for rask sammenligninger av eksperimentelle forhold som vektor typer, vektor dose, kjønn, alder, etc.

Figur 1. Bred AAV9 TDP-43 genoverføring til rotter forårsaker progressiv motor verdifall. Rotarod ytelse på 1-3 uker etter genet overføring av kontrollen GFP eller ALS-relaterte genet TDP-43. Fagene ble testet før genoverføring og etterfølgende målene ble uttrykt som et forhold til det planlagte tidspunktet. Rotte normale ubehandlet vil bo på rotarod fra 60-90 s under disse forholdene. Dette tallet er endret fra⁶.

Figur 2. Rask kvantifisering av GFP-positive fluorescerende området i lillehjernen etter intravenøs AAV administrasjonen å rotta. A, B) ikke-transduced eksempel som var farget med GFP antistoffer. C, D) prøve fra rotte mottar AAV9 GFP. B, D) The tetthet skive alternativet på Scion bilde brukes til å kresent høydepunkt fluorescerende området i rødt, og deretter rød bildepunktene telles av programmet. Alternativet tetthet skive skal fremheve alle synlige fluorescerende som i C. Det røde området uttrykt firkantede bildepunkter som beregnet av programmet vises i B, D. Tidspunktet var 4 uker etter en hale blodåre injeksjon av AAV9 GFP til en ung voksen rotte på en vector-dose av 1 x 10¹⁴ vektor genomer/kg. Skala er i A 536 µm; samme forstørrelse i A-D. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

En rekke levering ruter er testet for AAV vektorer: intra-parenchymal, intra-cerebroventricular, intra-thecal, intravenøs, intranasal, intra-muskuløse, etc. Hver rute kan ha bestemte fordeler samt ulemper. Hale blodåre administrasjon av AAV voksen rotter er en pålitelig metode for å oppnå konsistente Albin på CNS. Eksterne injeksjon metoden unngår innføring av en injeksjon kanyle i CNS vev og er derfor minimal invasiv. Effektiv CNS uttrykket som kan oppnås ved denne metoden er den største fordelen med teknikken. Andre praktiske fordelene er at injeksjon metoden er veldig rask (ca 10 min per dyr fra start til slutt) og at halen blodåre injeksjoner er ikke svært teknisk, og kan derfor beherskes raskt. Selvfølgelig er en stor ulempe at mye av høy titer vektor er nødvendig, som vil være en mulighetsstudie problem hvis AAV forutbetalt er under 1 x 10¹³ vektor genomer/ml. Med ytterligere raffinement av vektor målfunksjoner, kan denne tilnærmingen være fordelaktig for klinisk genterapi i fremtiden, gitt at gen levering er en perifere og dermed relativt ikke-invasiv. På den annen side, direkte intra cerebrospinal væsken injeksjoner kan være fordelaktig i prekliniske og kliniske tilnærminger for to grunner: mer begrenset spredning av vektoren og bruk av lavere vektor doser.

I rotter med mørkere pigmentering, kan hale venen være vanskeligere å identifisere. Så, alternative måter som retro-orbital injeksjoner eller intravenøs injeksjoner til saphenous åre kan brukes. Retro-orbital injeksjoner målrette en tett kapillær seng og er dermed ligner en intravenøs injeksjon. For mus og kanskje rotter også metoden retro-orbital kan være enklere enn hale blodåre injeksjoner, men tre studier har vist stor konsistensen av halen blodåre injeksjoner i voksen rotter. ^{6 , 8 , 9} mesteparten av dette arbeidet brukt en sterk rekombinant promoter stasjonen transgene uttrykk, cytomegalovirus kylling beta begrepsordbok hybrid arrangøren. ¹⁰ hvis eksperimentator ønsker å avgrense uttrykk til neurons i CNS, en celle type-spesifikk promoter kan forsøkes, for eksempel synapsin promoter. ^{8 , 11}

Med hensyn til bildebehandling metode er det en rask, semi kvantitativ metode for beregning signaltransduksjon effektiviteten. Hvis utført riktig, så gir analysen en pålitelig estimat av transduced området. Metoden gullstandarden for teller objekter i CNS vev kalles stereology. Det tar ca 75 min per dyr å gjennomføre en stereological sonde i et område av interesse i hjernen mens metoden beskrevet er raskere på 20 min per dyr eller enda mindre når oppskalert. Hvis alle betingelser holdes like og samme region er riktig samplet, konsistensen av data nærmer seg stor konsistensen av stereology, og store grupper av prøver kan bli raskt analysert blasts.

Det er mange flere tekniske merknader som garanterer videre diskusjon. For inndeling 1 om vektor doser, vektor doser kreves for effektiv transgene uttrykk i rotter ble fastsatt av prøving og feiling og dose-respons i Wang et al., Dayton et al.og Jackson et al., samt tidligere doser brukt i mus (Foust et al. og Duque et al). ^{1 , 2 , 4 , 5 , 6} sikkert litt kritisk, og potensielt hastighetsbegrensning produserer høy-titer AAV forutbetalt å oppnå effektiv doser.

For punkt 3 bør angående laster vektoren inn nålen, luftbobler i injeksjon løsningen unngås så best som mulig. En liten mengde luft bør ikke være problematisk som dette kan filtreres av lungene, men overdreven mengder luft injisert i venen kan føre en venøs air embolism potensielt resulterer i død. ¹² hvis er bobler i sprøyten, viruset bør utvist fra sprøyten og en ny sprøyte skal lastes. For å unngå etablering av bobler, sørg for å plassere nålen nær dråpe vektor på parafilm med skråkanten vender ned. Når fleste av vektoren er tatt i nålen, veldig sakte utarbeide gjenværende løsningen. En liten luftlomme vil danne bak sprøyten. Dette er død plass og injiseres ikke. For å sikre at det forblir mot baksiden av sprøyten, holde sprøyten vannrett eller pekte nedover og ikke flick sprøyten.

Del 5 om injeksjoner, for å sikre at injeksjon går inn i venen og ikke vevet rundt venen, når nålen er satt inn, trekke tilbake litt på stempelet skape undertrykk på pinne-spissen. Som nevnt, hvis nålen i venen, blod skal flyte inn nålen og vises i bunnen av nålen. Mens sprøytebruk i venen, bør lite motstand merkes når nålen plasseres riktig. Hvis betydelig motstand, er det sannsynlig at injeksjon kommer inn i vevet av halen som beskrevet ovenfor. Det er også mulig å punktere gjennom åre, forårsaker en "blåst stemning", når vinkelen at nålen settes er for bratt, når måleren nålen er for stor for venen eller når injeksjon hastigheten er for fort å legge for mye press på venen. En blåst åre kan oppstå under den innledende punktering i venen eller under injeksjon. For å unngå punktering venen under injeksjon eller har nålen skulle løsne fra blodåre, bør sprøyten stabiliseres ved å holde slutten av sprøyten mot halen som nevnt. Hvis nålen blir forskyves eller en andre injeksjon er nødvendig for en annen grunn, kan andre injeksjon gjøres enten lateral hale venen på motsatt side eller nærmere kroppen på samme side.

Seksjon 8 kjøres rotarod analysen med 4 ukers mellomrom under eksperimentet. Normal, ubehandlet rotter har bedre resultater når de er yngre (4-6 uker gamle) enn i eldre alder. Underskudd i flukt refleks tegnes som overlevelse av lem funksjonen over tid. Den overlevelse kurver analyseres av en logg-rank test på prisme programvare.

Avsnitt 9 om signaltransduksjon analyse, med praksis, blir prosedyren relativt fort, tar ca 20 min per dyr eller mindre. Denne analysen er også svært pålitelig fordi ikke-transduced vev som er behandlet med GFP flekker prosedyren en i utgangspunktet ubetydelig lesing (Figur 2B), og fordi det er et stort dynamisk område å er avlesning. De fleste av GFP fluorescens stammer fra transduced Purkinje celler, og dermed deres store antall gir et stort dynamisk område. Så langt, gene overføring effektivitet oppnås ikke har ført målingene å mette over hele feltet (dvs. 100% signaltransduksjon Purkinje celler), minst når genoverføring administreres til voksen rotter. Hvis metning av hele feltet var et problem, kunne så signalet senkes ved å bruke en lavere vector-dose i separate dyr eller ved å måle bare den svakere, innfødt GFP fluorescensen, avkall flekker prosedyren. Sikkert kan signaltransduksjon andre celletyper i lillehjernen også bidra til signalet, men mest av hva som er synlig og telles av programmet er klart celle organer i Purkinje celle lag og sine dendrittiske trær i den molekylære Lag gjennom lillehjernen basert på posisjonen og morfologi. En viktig utfordring for metoden er at luftbobler eller fluorescerende rusk kan telles, som dermed forurenser målingene. Deler og felt med denne støyen brukes ikke; ren prøver gratis uspesifisert støy kreves. Siden GFP er en utenlandsk protein, er det ingen bakgrunnsstøy i vevet, så de bestemte fluorescensen kan nøyaktig fanget og beregnet. I disse studiene, var GFP photomicrographs fanget i farge og deretter konvertert til gråtoner ved hjelp av et bildebehandlingsprogram enn Scion bilde. Men ville det være enklere å fange GFP i svart-hvitt i utgangspunktet for påfølgende analyse i Scion bilde. Tidligere studier analysert Albin på ryggmargen lavere motor neurons på en prosent basis, dvs. andelen motoneurons uttrykke GFP. ^{4 , 6} men analyse av lillehjernen er raskere, krever færre deler og synes også å være mer konsistent og pålitelig for (for eksempel over enkelte observatører gjør vurderinger). Rask lillehjernen tenkelig metoden er således en god rask indeks av suksessen til enhet-til-sentrale genoverføring. Analyser av ryggmargen signaltransduksjon og eksempler på Albin på andre nettsteder i rotte nervesystemet er rapportert Wang et al., Dayton et al.og Jackson et al. ^{4 , 5 , 6}

Oppsummert er intravenøs ruten av administrasjonen minimal invasiv; CNS kan målrettes av en ekstern administrasjon uten å plassere en nål i hjernen eller ryggmargen. Med ytterligere avgrensning av målretting, vil relevante prekliniske og kliniske gen-terapi fortsette å bruke intravenøs levering, mens mange utallige fremtidige typer grunnleggende funksjonelle studier i rotter kan ha nytte av den ekspansive signaltransduksjon i søken for å fremskynde hypotesetesting av gen funksjon i vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scale	Pelouze	SP5
Nalgene bucket	Thermo Scientific	12014000	4000 mL
Microcentrifuge tube	USA Scientific	1615-5500
Lactated Ringer's Solution	Baxter Healthcare	0338-0114-04
Mini vortexer	Fisher Scientific	128101
Centrifuge	Eppendorf	22624415
Laboratory film	Bemis	PM996
1-mL syringe	BD	309626	Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection
30g needle	BD	305106
Isoflurane	Piramal Healthcare	66794-013-25	Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask	Kopf Instruments	906
Gauze	Henry Schein	100-2524	2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips	USA Scientific	1111-0816
Micropipet	Gilson	4642080
Gas anesthesia vaporizer	SurgiVet	4214322	Classic T3
Gas anesthesia scavenger	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
Heating pad	Sears	17280
Bench pad	VWR	56617-006
Rotarod	Panlab/Harvard Apparatus	76-0772	4 rats/ 4 mice
70% Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 proof
70% Isopropanol	VWR	89108-160
Scion Image	Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody	Invitrogen	A11122	Primary Antibody - 1:500 dilution
AlexaFluor 488	Invitrogen	A11070	Secondary Antibody - 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope	Zeiss