Metoder og Tips til intravenøs indgift af Adeno-associeret Virus at rotter og evaluering af centralnervesystemet transduktion

Summary

Metoder til en omfattende centralnervesystemet gen levering i rotten er dækket. I dette eksempel er formålet at efterligne en sygdom, der påvirker hele rygmarven. Den udbredte transduktion kan bruges til at levere en terapeutisk protein til CNS fra en engangs, perifere administration.

Abstract

Adeno-associeret virus (AAV) vektorer er en nøglen reagens i neurovidenskab for grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR), optogenetics, cre-lox målretning, osv. Formålet med dette manuskript er at støtte investigator forsøger ekspansiv centralnervesystemet (CNS) genoverførsel i rotten via hale vene injektion af AAV. Omfattende udtryk er relevante for betingelserne med udbredt patologi, og en rotte model er væsentlig på grund af dets større størrelse og fysiologisk ligheder til mennesker i forhold til mus. I dette eksempel program, er en omfattende neuronal transduktion bruges til at efterligne en neurodegenerativ sygdom, der påvirker hele rygmarven, amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Effektiv omfattende CNS transduktion kan også bruges til at levere terapeutiske protein faktorer i prækliniske studier. Efter en post injektion udtryk interval af flere uger, er at evaluere virkningerne af transduktion. For en grøn fluorescerende proteiner (NGL) kontrol vektor skønnes mængden af normal god landbrugspraksis i lillehjernen hurtigt og pålideligt med et grundlæggende billedbehandlingsprogram. For motor sygdom fænotyper, der er fremkaldt af ALS relaterede protein transactive svar DNA-bindende protein af 43 kDa (TDP-43), scorede underskuddene af undslippe reflex og rotarod. Ud over sygdom modellering og genterapi er der forskellige potentielle anvendelsesmuligheder for omfattende-gen målretning beskrevet her. Udvidet brug af denne metode vil støtte i at fremskynde hypotesetest i neurovidenskab og neurogenetics.

Introduction

Rekombinant adeno-associeret virus (AAV) vektorer er uundværlige redskaber til CNS forskning, fordi de er så effektive for transducing neuroner in vivo. AAV vektorerne er meget alsidige for at studere forskellige transgener og protein isoformer, forskellige væv, forskellige vært arter og forskellige indgiftsmåder. For eksempel, kan AAV administreres til mus af eksternt udstyr, relativt non-invasiv, intravenøs injektion til transduce neuroner i CNS som først beskrevet i Foust et al. og Duque et al. (Se JOVE papir af Gombash et al. (2014)). ^{1 , 2 , 3} dette gen levering tilgang anvendes i rotter til at effektivt udtrykke enten grøn fluorescerende proteiner (NGL) eller ALS relateret protein, transactive svar DNA-bindende protein af 43 kDa (TDP-43) i CNS. ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} arbejder i rotter er betydelig fordi rottens fysiologisk og metaboliske parametre er tættere på mennesker i forhold til mus og adfærdsmæssige og toksikologiske assays designet specielt til rotter. Desuden flere transgene rotte linjer bliver tilgængelige, kan udnyttes i AAV gen overførsel undersøgelser.

Metoder er beskrevet for ekspansiv CNS genoverførsel i rotter, og hurtig, pålidelig kvantificering af resultaterne. Omfattende CNS transduktion bruges til at efterligne symptomatologi af ALS i rotter ved at udtrykke TDP-43 i rygmarven. Metoden er hale vene injektioner af TDP-43 vektor til unge voksne rotter som anvendt i Jackson et al. ^{6 , 8 , 9} efter flere uger, TDP-43-induceret motor underskud er scoret af to metoder: undslippe rotarod som bruges i Dayton et al. og Jackson et al. og refleks ^{5 , 6 , 7 , 9} for kontrol normal god landbrugspraksis vektor, post mortem-analyse, den fluorescerende område af lillehjernen er beregnet som indekstal af transduktion effektivitet som bruges i Jackson et al. ^{6 , 8} analysen af lillehjernen har vist sig for at være en hurtig og pålidelig indeks af graden af CNS transduktion efter perifer gen levering og bør gælde for en række forskellige tilgange forsøger perifere til central genoverførsel.

Protocol

alle procedurer fulgt retningslinjerne for passende NIH. Alle procedurerne fulgt animalske protokoller, der blev godkendt ved Animal Care og brug Udvalget på LSU Health Sciences Center i Shreveport. Sprague-Dawley hunrotter henne ved 6 ugens i alder blev brugt til denne procedure.

1. afgøre doser/mængder af vektor behov for

1. vejer rotter til at blive injiceret og stoerrelsen af viral vektor behov for hvert enkelt dyr baseret på titer (fusion) af vektor forberedelse. Brug vektor doser, der tidligere har været vellykket for effektive udtryk i rotte CNS (Se Jackson mfl. ⁶).
   Bemærk: For AAV9 TDP-43 eller AAV9 normal god landbrugspraksis, en typisk dosis er mellem 3 x 10 ¹³ - 1 x 10 ¹⁴ vektor genomer/kg. De unge voksne rotter henne ved 6 ugens i alder vejer omkring 150 g.
2. Gøre tilsvarende doser pr. kg i alle dyr for systematiske sammenligninger. Sikre mængden ikke overstiger standard rådgivet injektionsvolumener (250-500 µL til 250 g rotte). En typisk Injektionsvolumen er 200 µl til en ung voksen rotte.

2. Forberede arbejde station

1. indsamle alle nødvendige forsyninger: en paraffin film square (ca. 5 x 5 cm) pr. dyr, en alkoholserviet forberedelse pr. dyr, gaze puder (2-3 pr. dyr), pipette tips og en mikropipette.
2. Forbereder den arbejdende overflade ved at rengøre overfladen med 70% ethanol. Placer en varmepude ned med temperaturen indstillet til lav (~ 37 ° C). Placer en bænk pad oven på den hede afrivningsblok.
3. Forberede gas anæstesi (isofluran). Sikre tilstrækkelig ilt og gas anæstesi under proceduren. Ren induktion kammer og anæstesi maske med 70% ethanol, og placere anæstesi maske på bænken pad.

3. Forberede vektoren

1. tø vektor ved stuetemperatur, og mærke en steril microcentrifuge tube for hvert dyr.
2. Afpipetteres volumen af AAV fastslået i trinvist passende røret 1.1 og bringe volumen op til den ønskede Injektionsvolumen (her, 200 µl) med laktat Ringer ' s løsning eller saltvand.
3. Puls vortex prøve for 1-2 s og derefter puls centrifugeres i 5 s at bringe prøven til bunden af røret.
4. Pipette den samlede Injektionsvolumen for rotten ud af røret og på kvadratet af paraffin film.
5. Placerer en 30 gauge kanyle på en 1 mL sprøjte.
6. Placer nålen med facet vender nedad i vektor på paraffin-film. Trække sig tilbage i sprøjten stemplet indtil alle virus er i nål og sprøjte. Vær omhyggelig med at undgå luftbobler i nålen, som bliver lettere med praksis.

4. Forberede rotten

1. Drej ilt op til 1 L/min og sæt isofluran anæstesi til 5%. Sikre, at gas anæstesi strømmer til induktion kammer ved at kontrollere alle tilslutningsslanger og stophane retningslinjer.
2. Placere rotten i anæstesi induktion gaskammeret ca 3 min, indtil rotten er unresponsive.
3. Sikre tilstrækkelig dybde af anæstesi ved at klemme tå. Der bør være nogen bevægelse i foden eller benet efter tå knivspids.
4. Reducere isofluran anæstesi til 2% for vedligeholdelse af anæstesi og justere hanen, så anæstesi strømmer til anæstesi masken.
5. Placere rotten ' s næse i anæstesi maske og justere rotten, så det liggende på sin side.
6. Identificerer den laterale hale vene.
   Bemærk: Lateral hale årerne ligge på cirka 10 og 2 o ' ur med dorsal toppen af halen som 12 o ' ur. Med rotten liggende på sin side, lateral hale vene bør stå op.
7. Tørre området injektion med forberedelse alkoholserviet. Injektionsstedet er to tredjedele ned på længden af halen.

5. Injicere vektor

1. fast holde halen lidt over området injektion med én finger direkte over den laterale hale vene; dette vil spile venen.
2. Med facet opad, justere nålen med synlige hale vene i den samme retning.
3. Gennembore huden over halen vene samtidig tage stor forsigtighed for at undgå den anden hånd holder halen og trykke på halen vene.
4. Trykket fra hale vene til normal blodgennemstrømning.
5. Flytter nålen ind i venen. For at sikre, at nålen har punkteret hale vene, trække tilbage lidt på stemplet. Hvis nålen er i venen, vil blodet flyde i nålen.
   1. Repositionere nålen efter behov. Derefter for at stabilisere nålen, flytte hånden over injektionsstedet til under injektionsstedet og hold i slutningen af sprøjten mod halen.
6. Langsomt tilføre hale (ca. 20 µL/s) vektoren.
   Bemærk: Venen kan miste farve som vektor strømme igennem. Tegn på at løsningen var sprøjtes uden for venen omfatter blebbing, blanchering af huden eller modstand når indsprøjte vektoren. Med praksis, ekstra vaskulære eksponering kan minimeres.
7. Efter at vektoren er blevet administreret, fjerne nål fra rotte og tryk på en gauze afrivningsblok mod injektionsstedet til at dæmme op for blødning for 30-60 s.

6. Rengør-up

1. slukke isofluran anæstesi og ilt. Overvåge rotten, indtil det kommer til bevidsthed, og derefter vende tilbage til sit bur.
2. Omhyggeligt placere alle nåle i objektbeholderen klid. Bortskaf alle andre disponible materialer, der er potentielt forurenet med AAV i en passende biologisk beholder. Rengøre arbejds-stationer med 70% ethanol.

7. Vurdere hindlimb undslippe refleks

Bemærk: Hindlimb underskud normalt opstår 2-6 uger efter TDP-43 genoverførsel, afhængigt af vektor dosis.

1. På en flad overflade klar af vragrester, med to fingre grab rotte ' s hale ca 2 cm fra kroppen. Løft rotten forsigtigt, indtil forbens hængende mens du ser den ventrale undersiden af rotten.
   1. Udføre proceduren ugentligt i hele den eksperimentelle tidsforløb efter genoverførsel (f.eks., op til 12 uger efter genoverførsel).
      Bemærk: Også score forelimb underskud på denne måde, men hindlimb underskud er mere tilbøjelige til at opstå i denne model, afhængigt af den vektor dosis anvendes.
2. Iagttage hindlimbs for 10 s. Bemærk Hvis en eller begge hindlimbs knuge mod midterlinjen under 10 s.
3. Gentag denne test for i alt tre gange med 30 s mellem forsøg. Hvis en eller begge hindlimbs er knyttet til hver af tre forsøg, viser rotten motor dysfunktion. Optage data (manuelt i noter) som enten unilateral eller bilateral hindlimb underskud til stede, hvis der er konsekvent clenching på tværs af alle tre forsøg.

8. Evaluere motorik på rotarod

1. til at konfigurere rotarod, placere en bænk pad under rotarod og angive acceleration til 4-40 omdrejninger pr. minut (rpm) over 2 min. (hastigheden stiger med ~0.3 rpm/s). For en 12 ugers tid-kursus, køre emnerne på 2, 4, 8 og 12 uger efter gen overføre.
2. Tillade rat til at acclimate til test værelse i 20 min.
3. At træne rotten hen til hjælp rotarod for første gang, først starte rotarod ved en fast hastighed på 4 rpm, derefter placere rotten på rotarod. Tillade rotte at gå til en fuld omdrejning ved 4 rpm, så start acceleration og tillade rotte at gå på rotarod, indtil det falder. Fortsætte uddannelsen, indtil rotten kan konsekvent gå til mindst 40 s. En sund, unge voksen rotte vil være let uddannet på denne måde.
   1. For en rotte med en mærkbar motor værdiforringelse, som kan forhindre rotten i at opnå en baseline latency falder 40 s, giver rotten 3-5 uddannelse forsøg før du begynder rotarod scoring.
4. Til at begynde rotarod test, placere rotten på rotarod og start acceleration af rotarod. Bemærk det tidspunkt, hvor rotten falder fra rotarod; Dette er den ventetid til at falde. Hvis rotten forbliver rotarod efter 120 s, cap session på dette tidspunkt, fjerne rotten fra rotarod og registrere et fald latenstid af 120 s.
5. Gentages prøvningen to gange i alt tre forsøg. For at minimere effekten af træthed, space forsøg mindst 5 min fra hinanden. Gennemsnitlige scores for de tre forsøg. En fejlfri voksen rotte har typisk en gennemsnitlig ventetid til at falde af > 40 s.
6. Placere rotten tilbage i buret, og rent rotarod og omkringliggende områder med 70% ethanol.

9. Kvantificering af normal god landbrugspraksis udtryk i lillehjernen

1. bedøver rotter og perfuse med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og derefter 4% PARAFORMALDEHYD. Dissekere hjernen og rygmarven og blød væv i fiksativ natten over og derefter flytte dem til en 30% rørsukkeropløsning. Efter ækvilibrering, skære 50 μm koronale sektioner på en glidende mikrotom med iskold fase ^{4 , 5 , 6}.
2. Vælger 3-6 dele af lillehjernen, der er jævnt fordelt i vermis, den centrale lap af lillehjernen. Fluorescently mærke normal god landbrugspraksis for at maksimere signalet. Brug den primære antistof for normal god landbrugspraksis på 1: 500 og bruge Alexa-488 konjugeret sekundær antistof i en fortynding på 1: 300 ^{4 , 5 , 6}.
   Bemærk: Se referencer ^{4 , 5 , 6} for flere detaljer om prøveudtagning, skæring, og farvning procedurer.
3. Photomicrograph hvert afsnit i den definerede region af interesse med en lav forstørrelse linsen ved hjælp af et mikroskop. Brug en 2,5 X mål (N.A. 0,12) og filter sæt 10, 450-490/515-565 excitation/emission). Holde kameraets indstillinger (eksponering gange, fx 2 s) den samme på tværs af prøver der skal analyseres. Gemme som en. TIF-fil.
4. Åbnes photomicrograph i programmet bredt tilgængelige Scion billede; to vinduer åbnes. Luk vinduet angivet som " indekseret farve ".
5. Vælg " indstillinger ", derefter " tæthed SliceŔ en række nuancer vil blive angivet i rødt på vinduet Look-Up Table (LUT). I vinduet bruge markøren til at udfylde særlige normal god landbrugspraksis mærkning kun og stoppe når den uspecifikke baggrund begynder at blive samlet op i billedet.
   Bemærk: Dette vil fremhæve det fluorescerende område på photomicrograph til kvantificeres. Indstillingerne skal være optimeret til at specifikt fange alle de synligt fluorescerende celler. Med praksis, kan denne metode præcist fremhæve den specifikke fluorescens.
6. Før måling fluorescerende område, først sikre, at de målinger er i de korrekte enheder (pixels). For at gøre dette, skal du klikke på " analyser ", derefter " sæt ScaleŔ den fjerde linje bør sige " enheder ". Fra drop-down listen, Vælg pixels til at måle i pixel, og klik derefter " OK ". Skifte analyseindstillinger til " omfatter interiør huller " at sikre inddragelse af hele cellen kroppen i analysen.
7. Til at måle den fluorescerende område, klik på " analyse ", og klik derefter på " foranstaltning ". Klik for at se denne værdi, " analyser " derefter klikke på " Vis ResultsŔ en resultater vindue vises. Fluorescerende område måling vil være under overskriften mærket " område ".
8. For at sikre standardisering på tværs af målingerne, ændrer ikke de fremhævede værdier i vinduet LUT.
9. Når alle målingerne er blevet registreret, gennemsnitlige værdier for hvert enkelt dyr (fra 3-6 dele pr. dyr). Brug en passende statistisk test til at sammenligne de transduced områder mellem grupperne. ⁶

Representative Results

TDP-43 induceret motor funktionshæmninger skulle opstå inden for 2-6 uger afhængig af dosis af den AAV TDP-43 anvendes (figur 1). Mislykket hale vene injektioner vil resultere i delvis eller ingen handicap; AAV skal nå blodbanen til at producere effekten. En vellykket injektion af AAV GFP vil resultere i normal god landbrugspraksis udtryk i hele hjernen og rygmarven i en vektor-dosis afhængige måde. Når du bruger stærke rekombinant initiativtageren til drev udtryk, cytomegalovirus kylling beta actin hybrid promotor, også kendt som CAG promotor, er der effektive udtryk i CNS samt flere andre væv som lever og hjerte. ^{4 , 5 , 10} i rotte CNS, når du bruger AAV9 eller AAV PHP. B vektorer, mønsteret er overvejende neuronal transduktion og kun sparsom, sporadiske glial transduktion. ^{4 , 8} da ingen kønsforskelle i transduktion effektivitet blev observeret hos rotter med omfattende metode, er kvinder typisk anvendes til intravenøs genoverførsel på grund af deres lavere vægte. ⁶

Den semi-kvantitative billedbehandling metode beskrevet er hurtige og pålidelige, fordi der er et fremragende signal / støj-forhold. En ikke-transduced prøve er sammenlignet med en transduced prøve i figur 2 med begge prøver farves med normal god landbrugspraksis antistof. Værdier, der opsamlet fra disse prøver indikere 0,3% støj (fra vaerdierne i figur 2B, D) i eksemplet ikke-transduced, som kan anses for ubetydelig. I betragtning af den fremragende signal / støj-forhold, er denne metode gyldig for hurtige sammenligninger af eksperimentelle betingelser såsom vektor typer, vektor dosis, køn, alder, etc.

Figur 1. Omfattende AAV9 TDP-43 genoverførsel til rotter forårsager progressive motor værdiforringelse. Rotarod ydeevne på 1-3 uger efter gen overførsel af enten kontrolelementet normal god landbrugspraksis eller ALS-relaterede gen TDP-43. Emnerne, der blev testet før overførsel af gener og de efterfølgende målinger blev udtrykt som forholdet til baseline tidspunkt. En normal ubehandlet rotte vil bo på rotarod fra 60-90 s under disse betingelser. Dette tal er blevet ændret fra⁶.

Figur 2. Hurtig kvantificering af normal god landbrugspraksis-positive fluorescerende område i lillehjernen efter intravenøs AAV administration til rotten. A, B) ikke-transduced stikprøve, der var farvet med normal god landbrugspraksis antistof. C, D) prøve fra en rotte modtager AAV9 normal god landbrugspraksis. B, D) The tæthed skive indstilling på Scion billede bruges til selektivt fremhæve det fluorescerende område i rød, og derefter de røde pixels tælles efter programmet. Indstillingen tæthed skive bør fremhæve alle de synlige fluorescerende celler som set i C. Det røde område udtrykt i firkantede pixel som beregnet af programmet er vist i B, D. Tidspunkt var 4 uger efter en hale vene injektion af AAV9 NGL til en ung voksen rotte i en vektor dosis på 1 x 10¹⁴ vektor genomer/kg. Skalalinjen i A er 536 µm; samme forstørrelse i A-D. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

En bred vifte af levering ruter er blevet testet for AAV vektorer: intra-parenkymalt, intra-cerebroventricular, intra-thecal, intravenøs, intranasal, intramuskulaer, osv. Hver rute kan have specifikke fordele samt ulemper. Hale vene administration af AAV til voksne rotter er en pålidelig metode til at opnå ensartede transduktion af CNS. Den perifere injektion metode undgår indførelsen af en injektion kanyle i CNS væv og er derfor minimalt invasiv. Effektiv CNS-udtryk kan opnås ved denne metode er den største fordel af teknikken. Andre praktiske fordele er, at metoden injektion er meget hurtig (ca. 10 min pr. dyr fra start til slut) og at hale vene injektioner er ikke meget teknisk og kan derfor styres hurtigt. En stor ulempe er, at en masse af høj titer vektor er nødvendig, som vil være en feasibility emne hvis AAV preps er under 1 x 10¹³ vektor genomer/ml. Med yderligere finjustering af vektor målretning evner, kunne denne tilgang være fordelagtigt for kliniske genterapi i fremtiden, i betragtning af at gen levering er af en perifer rute og dermed relativt ikke-invasiv. På den anden side mere direkte intra cerebrospinal fluid injektioner kunne være fordelagtigt i prækliniske og kliniske metoder af to grunde: mere begrænset spredning af vektoren og brug af lavere vektor doser.

I rotter med mørkere pigmentering, kan hale vene være sværere at identificere. Så anvendes alternative ruter for administration som retro-orbital injektioner og intravenøse injektioner til saphenous vene. Retro-orbital injektioner målrette en tætte kapillær seng og således svarer til en intravenøs injektion. For mus, og måske for rotter, retro-orbital metode kan være lettere end halen vene injektioner, men tre undersøgelser har vist stor konsekvens af hale vene injektioner i voksne rotter. ^{6 , 8 , 9} det meste af dette arbejde anvendes en stærk rekombinant initiativtageren til drev transgen udtryk, cytomegalovirus kylling beta actin hybrid promotor. ¹⁰ hvis eksperimentatoren ønsker at afgrænse udtryk til neuroner i CNS, en celle type-specifikke promotor kan forsøges, for eksempel synapsin initiativtageren. ^{8 , 11}

Med hensyn til billedmetoden er det en hurtig, semi-kvantitative metode til vurdering af transduktion effektivitet. Hvis udført korrekt, udbytter analysen et pålideligt skøn af det transduced område. Guld standard metoden til at tælle objekter i CNS væv kaldes Stereologi. Det tager ca. 75 min. pr. dyr til at gennemføre en stereological sonde i en region af interesse i hjernen, der henviser til, at den beskrevne metode er hurtigere på 20 min pr. dyr eller endda mindre når skaleres op. Hvis alle betingelserne er holdt lige og samme region er korrekt stikprøven, sammenhængen i dataene, der nærmer sig den store sammenhæng i Stereologi, og store grupper af prøver kan hurtigt analyseret massevis.

Der er en række yderligere tekniske noter, som berettiger yderligere diskussion. For afsnit 1 med hensyn til vektor doser, vektor doser, der kræves til effektiv transgen udtryk i rotter blev bestemt af trial and error og dosis-respons i Wang et al., Dayton et al.og Jackson et al., samt tidligere doser anvendes i mus (Foust et al. og Duque mfl). ^{1 , 2 , 4 , 5 , 6} helt sikkert en kritisk, og potentielt trafikhastighedsbegrænsning trin producerer high-titer AAV preps for at opnå de effektive doser.

For afsnit 3 bør vedrørende indlæsning vektoren i nålen, luftbobler i injektion løsning undgås så godt som muligt. En lille mængde luft bør ikke problematisk, som dette kan filtreres af lungerne, men overdrevne mængder af luft injiceres i en vene kan forårsage en venøs luft emboli potentielt resulterer i døden. ¹² hvis bobler er til stede i sprøjten, virus bør bortvises fra sprøjten, og en ny sprøjte skal indlæses. For at undgå oprettelsen af bobler, Sørg for at placere nål tæt på dråbe af vektor på parafilm med facet vender nedad. Når fleste af vektoren er blevet taget i nålen, meget langsomt udarbejde den resterende løsning. En lille luft lomme vil danne bag på sprøjten. Dette er dead space og vil ikke blive injiceret. For at sikre, at den forbliver mod bagsiden af sprøjten, holde sprøjten vandret eller spidse nedad og ikke svirp sprøjten.

For afsnit 5 om injektioner, for at sikre, at indsprøjtningen går ind i venen og ikke i vævet omkring venen, når nålen er indsat, trække sig tilbage lidt i stemplet til at skabe undertryk på nål-spids. Som nævnt, hvis nålen er i venen, blod skal strømme tilbage til nålen og kan ses i bunden af nålen. Mens indsprøjtning i venen, bør lidt modstand mærkes når kanylen er korrekt placeret. Hvis der er betydelig modstand, er det sandsynligt, at injektion kommer ind i vævet af halen, som beskrevet ovenfor. Det er også muligt at punktere gennem i venen, forårsager en "blæst vene", når den vinkel, at nålen er indsat er for stejl, når sporvidde af nålen er for stor til venen, eller når injektion hastighed er for hurtigt at lægge for meget pres på venen. En blæst vene kan forekomme under den indledende punktering af venen eller ved injektion. Hvis du vil undgå punktering venen under injektion eller under nålen blive fortrængt fra venen, skal sprøjten stabiliseres ved at holde slutningen af sprøjten mod halen som nævnt. Hvis nålen bliver fortrængt eller en anden injektion er behov for en anden grund, kan den anden injektion foretages enten til den laterale hale vene på den modsatte side eller op tættere til kroppen på samme side.

For afsnit 8, er rotarod-analysen køre på 4-ugers mellemrum under eksperimentet. Normal, ubehandlet rotter har bedre scores når de er yngre (4-6 uger gamle) end på ældre aldre. Underskud i flugt refleks afbildet som overlevelse af lemmer funktion over tid. Overlevelse kurver er analyseret af en log-rank test på prisme software.

For afsnit 9 vedrørende transduktion analyse, med praksis, bliver proceduren relativt hurtigt, at tage ca 20 min pr. dyr eller mindre. Denne analyse er også yderst pålidelig, fordi ikke-transduced væv, der er behandlet med normal god landbrugspraksis farvning procedure en dybest set ubetydelig læsning (Figur 2B), og fordi der er et stort dynamikområde til udlæsningen. De fleste af normal god landbrugspraksis fluorescens stammer fra transduced Purkinje celler, og deres store tal giver således et stort dynamikområde. Hidtil har genet overførsel effektivitet opnås ikke har medført aflæsninger at mætte over hele marken (dvs. 100% transduktion af Purkinje celler), i det mindste når genoverførslen administreres til voksne rotter. Hvis mætning af hele feltet var et problem, kan så signalet sænkes ved at anvende en lavere vektor dosis i separate dyr eller ved måling kun de svagere, native normal god landbrugspraksis fluorescens, give afkald på den farvning procedure. Bestemt kan transduktion af andre celletyper i lillehjernen også bidrage til signalet, men det meste af hvad er let synlig og optalt af programmet er klart celle organer i Purkinje cellelag og deres dendritiske træer i de molekylære lag i hele lillehjernen, baseret på deres kendte position og morfologi. En betydelig udfordring for metoden er, at luftbobler eller fluorescerende snavs kunne tælles, som vil dermed forurene aflæsninger. Sektioner og felter med denne støj anvendes ikke; ren prøver fri for uspecifik støj er påkrævet. Da normal god landbrugspraksis er en udenlandsk protein, er der ingen baggrundsstøj inden for væv, så den specifikke fluorescens kan være netop fanget og anslået. I disse undersøgelser, blev normal god landbrugspraksis mikrofotografier fanget i farve og konverteres til gråtoner ved hjælp af et billedbehandlingsprogram end Scion billede. Det ville imidlertid være mere ligetil at fange normal god landbrugspraksis i sort og hvid i første omgang til efterfølgende analyse i Scion billede. Tidligere undersøgelser analyseret transduktion af rygmarven lavere motor neuroner på en procentgrundlag, dvs. procentdelen af motoneurons udtryk for normal god landbrugspraksis. ^{4 , 6} dog analyse af lillehjernen er hurtigere, der kræver færre sektioner og synes også at være mere konsekvent og pålidelig også (for eksempel, på tværs af individuelle observatører foretager vurderingerne). Den hurtige cerebellare billedbehandling metode er således en god hurtig indeks af perifere til central genoverførsel succes. Analyser af rygmarven transduktion og eksempler på transduktion af andre steder i nervesystemet rotte er blevet rapporteret i Wang et al., Dayton et al.og Jackson et al. ^{4 , 5 , 6}

I Resumé er intravenøs indgiftsmåde minimalt invasiv; CNS kan blive ramt af en perifer administration uden at placere en nål ind i hjernen eller rygmarven. Sammen med yderligere finjustering af målretning, vil relevante prækliniske og kliniske genterapier fortsætte med at bruge intravenøs levering, mens mange myriader fremtidige typer af grundlæggende funktionelle studier i rotter kan drage fordel af den ekspansive transduktion i søgen efter at fremskynde hypotesetest af genfunktioner in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scale	Pelouze	SP5
Nalgene bucket	Thermo Scientific	12014000	4000 mL
Microcentrifuge tube	USA Scientific	1615-5500
Lactated Ringer's Solution	Baxter Healthcare	0338-0114-04
Mini vortexer	Fisher Scientific	128101
Centrifuge	Eppendorf	22624415
Laboratory film	Bemis	PM996
1-mL syringe	BD	309626	Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection
30g needle	BD	305106
Isoflurane	Piramal Healthcare	66794-013-25	Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask	Kopf Instruments	906
Gauze	Henry Schein	100-2524	2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips	USA Scientific	1111-0816
Micropipet	Gilson	4642080
Gas anesthesia vaporizer	SurgiVet	4214322	Classic T3
Gas anesthesia scavenger	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
Heating pad	Sears	17280
Bench pad	VWR	56617-006
Rotarod	Panlab/Harvard Apparatus	76-0772	4 rats/ 4 mice
70% Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 proof
70% Isopropanol	VWR	89108-160
Scion Image	Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody	Invitrogen	A11122	Primary Antibody - 1:500 dilution
AlexaFluor 488	Invitrogen	A11070	Secondary Antibody - 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope	Zeiss