שיטות וטיפים על עירוי לוריד של Adeno-הקשורים וירוס חולדות והערכה של מערכת העצבים המרכזית התמרה חושית

Summary

שיטות משלוח הגן רחב היקף מערכת העצבים המרכזית בחולדה מכוסים. בדוגמה זו, המטרה היא לחקות מחלה המשפיעה על חוט השדרה כולו. התמרה חושית רחבה יכול לשמש כדי לספק חלבון טיפולית מערכת העצבים מהמינהל, היקפי חד פעמי.

Abstract

וקטורים Adeno-הקשורים וירוס (AAV) הם ריאגנט מפתח בהנורולוגיה עבור מקובצים באשכולות חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR), optogenetics, מיקוד cre-סלומון, וכו '. מטרתו של כתב יד זה היא לסייע החוקר ניסיון ולקיבולת מערכת העצבים המרכזית (CNS) העברה גנטית בחולדה באמצעות הזרקת וריד הזנב AAV. רחב היקף הביטוי רלוונטי עבור תנאים עם פתולוגיה נפוצה, מודל עכברוש הוא משמעותי בשל גודל גדול שלה הדמיון הפיזיולוגיות לבני בהשוואה לעכברים. ביישום זה דוגמה, התמרה חושית עצביים בהיקף נרחב משמש כדי לחקות את מחלת ניוון עצבי המשפיעה על חוט השדרה כולו, נוירודגנרטיביות (ALS). התמרה היעילה של CNS רחב היקף חושית יכול לשמש גם כדי לספק חלבון טיפולית גורמים במחקרים קליניים. לאחר מרווח זמן פוסט-הזרקת ביטוי של מספר שבועות, השפעות התמרה חושית מוערכים. עבור וקטור שליטה חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כמות ה-GFP ושההתפתחות מוערך במהירות ובאמינות על-ידי תוכנית ההדמיה הבסיסיים. עבור פנוטיפים מחלות מנוע זה הן תוצאה של ALS קשורים לתגובה טרנזקטיבי חלבון ה-DNA מחייב חלבון של 43 kDa (TDP-43), הגירעונות ציון על-ידי רפלקס הבריחה rotarod. מעבר מידול המחלה, טיפול גנטי, יש מגוון יישומים אפשריים עבור מיקוד רחב היקף ג'ין המתוארים כאן. השימוש המורחב של שיטה זו יסייעו לזירוז בדיקת מדעי המח, לנוירוגנטיקה השערות.

Introduction

וקטורים וירוס adeno-הקשורים רקומביננטי (AAV) הם כלי הכרחי לחקר מערכת העצבים המרכזית כי הם כל כך יעיל עבור transducing נוירונים ויוו. וקטורים AAV הם מאוד תכליתי לימוד שונים transgenes, חלבון איזופורמים ברקמות שונות, מארח שונים מינים, מסלולים שונים של ניהול. למשל, AAV יכול להיות מנוהל על מנת עכברים על ידי ציוד היקפי, יחסית לא פולשנית, לעירוי הזרקה כדי מגלי נוירונים לאורך מערכת העצבים ראשון המתוארים Foust. et al. , Duque. et al. (ראה יופיטר נייר על-ידי. Gombash et al. (2014)). ^{1 , 2 , 3} גישה מסירה זו ג'ין משמש בחולדות לבטא בצורה יעילה גם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או מכשיר הלייזר הקשורים חלבון, התגובה טרנזקטיבי DNA מחייב חלבון של 43 kDa (TDP-43) ב מערכת העצבים. ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} עובדים אצל חולדות היא משמעותית כי הפרמטרים של החולדה הפיזיולוגיות וחילוף קרובים לבני לעומת עכברים ישנם מבחני רעילות ורגשיים שתוכננה במיוחד עבור חולדות. יתר על כן, יותר שורות עכברוש הטרנסגניים המשתפרת זה יכול להיות מנוצל AAV ג'ין העברת מחקרים.

שיטות מפורטים עבור העברה גנטית CNS מרחיבה את החולדה, מהיר, אמין כימות של התוצאות. התמרה חושית CNS רחב היקף משמש כדי לחקות את התנסותו של ALS בחולדות בהבעת TDP-43 לאורך חוט השדרה. השיטה היא זריקות וריד הזנב של וקטור TDP-43 חולדות למבוגרים צעירים כמו בשימוש. ג'קסון et al. ^{6 , 8 , 9} לאחר מספר שבועות, TDP-43-induced גירעונות מוטוריים הן שבוים על ידי שתי שיטות: לברוח רפלקס, rotarod משמש בין Dayton. ואח . ג'קסון et al. ^{5 , 6 , 7 , 9} עבור וקטור GFP שליטה, בניתוח שלאחר המוות, האזור פלורסנט של הצרבלום מחושב כמו אינדקס של התמרה חושית יעילות בשימוש ב. ג'קסון et al. ^{6 , 8} הניתוח של המוח הקטן הוכיחה להיות בעלת אינדקס מהיר ואמין של דרגת התמרה חושית CNS לאחר המסירה הגן היקפיים, צריך להיות ישים למגוון רחב של גישות ניסיון העברה גנטית ההיקפית אל מרכזי.

Protocol

כל הליכים בעקבות ההנחיות NIH המתאים. כל הנהלים בעקבות בעלי חיים פרוטוקולים שאושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה ב LSU למדעי הבריאות מרכז בשריבפורט. חולדות נקבות ספראג-Dawley רוב בגיל 6 שבועות שימשו עבור הליך זה.

1. לקבוע המינונים/אמצעי האחסון של וקטור צריך

1. שוקלים החולדות להיות מוזרק, לקבוע את כמות וקטור ויראלי הדרושים עבור כל בעל חיים המבוסס על כייל נוגדנים (ריכוז) התכשיר וקטור. להשתמש במינונים וקטור זה היו הצלחה להבעה יעיל העכברוש CNS בעבר (ראה ג'קסון et al. ⁶).
   הערה: עבור AAV9 TDP-43 או AAV9 GFP, מנה טיפוסית היא בין 3 x 10 ¹³ - 1 x 10 ¹⁴ וקטור הגנום/ק ג.... העכברושים למבוגרים צעירים רוב בגיל 6 שבועות שוקל כ-150 ג'י
2. להפוך במינון שווה ערך לכל ק ג כל החיות להשוואות שיטתית. ודא אמצעי האחסון אינו עולה על תקן הזרקה מומלץ כרכים (250-500 µL עבור מלשן 250 גרם). אמצעי אחסון הזרקת טיפוסי הוא μl 200 לחולדה למבוגרים צעירים.

2. הכנת תחנת העבודה

1. לאסוף חומרים כל הנדרש: סרט פרפין אחד מרובע (בערך 5 x 5 ס מ) לכל חיה, אלכוהול אחד משטח הכנה לכל בעל חיים, תחבושות גזה (2-3 לכל חיה), טיפים pipet, micropipette.
2. להכין את משטח העבודה על-ידי ניקוי פני השטח עם 70% אתנול. מקם כרית החימום למטה עם הטמפרטורה להגדיר נמוך (~ 37 ° C). מקם כרית ספסל על גבי כרית החימום.
3. להכין את ההרדמה גז (איזופלוריין). ודא חמצן נאותה, גז הרדמה לניתוח. לנקות את התא אינדוקציה ומסכת הרדמה עם 70% אתנול, ולמקם את מסיכת ההרדמה על משטח הספסל.

3. להכין את הווקטור

1. להפשיר את הווקטור בטמפרטורת החדר ולאחר תווית שפופרת אחת microcentrifuge סטרילי עבור כל חיה.
2. Pipet עוצמת הקול של AAV נקבע צעד 1.1 לתוך הצינור המתאים ולהביא את אמצעי האחסון עד האחסון הרצויה הזרקה (כאן, 200 μl) עם צלצול lactated ' s פתרון או תמיסת מלח.
3. דופק מערבולת המדגם עבור s 1-2, ואז דופק צנטריפוגה עבור 5 s כדי להביא את הדגימה לתחתית הצינור.
4. Pipet האחסון הכוללת הזרקה לעכבר יצאה מהשפופרת, אל הכיכר של הסרט פרפין.
5. במקום מחט מד 30 על מזרק 1 מ"ל.
6. מקום המחט עם המסגרת המשופעת כלפי מטה לתוך הווקטור על הסרט פרפין. משוך לאחור על הבוכנה המזרק עד כל הנגיף מחט, מזרק. יש להקפיד להימנע ציור בועות אוויר לתוך המחט, אשר הופך להיות יותר קל עם אימון.

4. להכין את העכברוש

1. להפוך את החמצן עד 1 ליטר/דקה והגדר את ההרדמה איזופלוריין 5%. להבטיח כי ההרדמה גז זורם אל התא אינדוקציה על-ידי בדיקת כל הצינורות מחוברים וכיוונים צימוד.
2. למקם את החולדה לתא הגזים הרדמה אינדוקציה כ 3 דק ', עד העכברוש אינו מגיב.
3. להבטיח עומק נאותה של הרדמה על ידי צובט את הבוהן. צריך להיות אין תנועה ברגל או הרגל לאחר ה"צביטה הבוהן.
4. לצמצם את ההרדמה איזופלוריין 2% לצורך תחזוקה של הרדמה ולהתאים את צימוד כך ההרדמה זורם למסיכה הרדמה.
5. למקם את העכברוש ' s האף במסכה הרדמה ולהתאים את החולדה כך הוא שוכב על צידו.
6. לזהות את הווריד הזנב לרוחב.
   הערה: הוורידים הזנב לרוחב שוכב כ 10 ו- 2 o ' שעון עם העליון הגבי של הזנב כמו 12 o ' השעון. עם העכבר שוכבת על צדה, וריד הזנב לרוחב האיש למעלה
7. למחוק את אזור ההזרקה עם משטח ההכנה אלכוהול. ההזרקה הוא שני שלישים למטה אורך הזנב.

5. הזרקת וקטור

1. בחוזקה שתחזיק את הזנב מעט מעל אזור ההזרקה עם אצבע אחת ישירות מעל הווריד הזנב לרוחב; זה להתרחב את הווריד.
2. עם שפוע פונה כלפי מעלה, ליישר את המחט עם הווריד של הזנב גלוי באותו כיוון.
3. לחדור את העור מעל וריד הזנב תוך לקיחת בקפידה רבה כדי למנוע את היד השנייה אוחזת בזנב והקשה על הווריד הזנב של.
4. לשחרור לחצים מן הווריד של זנב כדי לאפשר את זרימת הדם נורמלי.
5. להזיז את המחט לווריד. כדי להבטיח כי המחט ניקבה את הווריד הזנב, לסגת מעט על הבוכנה. אם המחט בווריד, דם יזרום לתוך המחט.
   1. מיקום מחדש המחט לפי הצורך. לאחר מכן, כדי לייצב את המחט, להזיז את היד מעל האתר הזרקה מתחת ההזרקה והחזק בסוף המזרק נגד הזנב.
6. לאט לאט להחדיר וקטור לתוך הזנב (כ-20 µL/s).
   הערה: הווריד עלול לאבד צבע כמו וקטור זורם דרכו. סימנים כי הפתרון הוזרק מחוץ הווריד כוללים blebbing, בישול לבן של העור, או התנגדות כאשר הזרקת וקטור. עם התרגול, ניתן למזער חשיפה במיוחד כלי דם-
7. לאחר מנוהל וקטור, הסר את המחט מהחולדה ולחץ על כרית גזה נגד ההזרקה כדי לסייע נטפל בדימום במשך 30-60 ס

6. ניקיון

1. בטל איזופלוריין ההרדמה וחמצן. לנטר את החולדה עד שזה יחזור להכרה, ולאחר מכן להחזיר אותו לכלוב שלו.
2. מקום בקפידה מחטים כל המכולה שרפ. השלך כל החומרים חד פעמיות אחרים כי הם מזוהמים פוטנציאלי עם AAV לתוך המיכל הביולוגי המתאים. לנקות את תחנות העבודה עם אתנול 70%-

7. להעריך את רפלקס הבריחה hindlimb

הערה: גירעונות Hindlimb נובעים בדרך כלל 2-6 שבועות לאחר העברה גנטית TDP-43, תלוי במנה וקטור.

1. על משטח שטוח ברור של פסולת, עם שתי אצבעות לתפוס את העכברוש ' s זנב כ 2 ס מ מהגוף. הרם את החולדה בעדינות עד forelimbs תלויות בזמן הצגת החלק התחתון הגחון של העכברוש.
   1. בצע ההליך שבועי במהלך ניסיוני הזמן-לאחר העברה גנטית (למשל, עד 12 שבועות לאחר העברה גנטית).
      הערה: גם הציון גירעונות forelimb באופן זה, אך hindlimb גירעונות נוטים יותר להתרחש במודל זה, תלוי במנה וקטור להשתמש.
2. לבחון את hindlimbs עבור הערה ס' 10 אם אחת או את שתיהן hindlimbs אגרפי כף יד כלפי האמצע במהלך ה 10 ס
3. לחזור על בדיקה זו עבור סכום כולל של שלוש פעמים עם 30 s בין ניסויים. אם אחת או את שתיהן hindlimbs הן קפוצות עבור כל אחד שלושה ניסויים, החולדה מראה תפקוד מוטורי. לרשום את הנתונים (באופן ידני ב- notes) כמו גם קשב hindlimb חד-צדדית או דו-צדדית הנוכחי אם יש עקביות לאגרוף על פני כל האתגרים.

8. להעריך המוטורית על rotarod

1. כדי להגדיר את rotarod, הניחו כרית ספסל מתחת rotarod והגדר האצת 4-40 סיבובים לדקה (סל ד) יותר מ 2 דקות (הקצב מגדילה ~0.3 סל ד/s). פעם בשבוע 12-קורס, להפעיל את הנושאים 2, 4, 8, 12 שבועות לאחר ג'ין להעביר.
לאפשר
2. העכברוש להסתגלות לחדר בדיקות למינימום 20
3. לאמן את החולדה להשתמש את rotarod בפעם הראשונה, תחילה להתחיל את rotarod במהירות קבוע של סל ד 4 ולאחר מכן למקם את העכברוש rotarod. לאפשר את החולדה ללכת למהפכה מלאה אחת ב 4 סל ד, ולאחר מכן להתחיל את האצת ולאפשר את החולדה ללכת על rotarod עד שהוא נופל. המשך הדרכה עד העכברוש יכולים ללכת באופן עקבי לפחות 40 s. חולדה למבוגרים בריאים, צעירים יוכשרו בקלות באופן זה.
   1. במקרה של עכברוש עם ליקוי מוטורי מורגש, אשר עלול למנוע את החולדה להשגת של השהיה בסיסית ליפול של 40 s, לספק החולדה 3-5 ניסיונות ההכשרה לפני תחילת הניקוד rotarod.
4. כדי להתחיל בדיקות rotarod, למקם את העכברוש rotarod ולהתחיל האצה של rotarod. שימו לב לשעה שבה העכברוש נופל מן rotarod; זהו ההשהיה ליפול. אם החולדה נשאר על rotarod לאחר 120 s, קאפ ההפעלה בשלב זה, להסיר את העכברוש rotarod ולהקליט עם השהיה הנפילה של 120 ש
5. לחזור על הבדיקה עוד פעמיים עבור סכום של שלושה ניסויים. כדי למזער את ההשפעה של עייפות, מרחב את ניסויים לפחות 5 דקות אחד מהשני. ממוצע הציונים של שלושה משפטי. עכברוש למבוגרים unimpaired כולל בדרך כלל של השהיה הממוצע ליפול של > 40 ס
6. למקם את החולדה חזרה לכלוב, ולנקות את rotarod והסביבה עם אתנול 70%-

9. כימות של הביטוי GFP המוח הקטן

1. עזים ומתנגד העכברושים, perfuse עם פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) ולאחר מכן 4% paraformaldehyde. לנתח את המוח ואת חוט השדרה ו לטבול הרקמות מקבע בן לילה ולאחר מכן להעביר אותם 30% סוכרוז פתרון. לאחר equilibration, לחתוך 50 חלקים הילתית μm מיקרוטום הזזה עם מקפיא שלב ^{4 , 5 , 6}-
בחר
2. ' 3-6 חלקים של המוח הקטן זה רווח אחיד vermis, גזע המוח של המוח הקטן. Fluorescently תווית GFP כדי למקסם את האות. משתמש נוגדן ראשוני עבור GFP-שבערך ולהשתמש הנוגדן משני מצומדת אלקסה-488-לדילול 1:300 ^{4 , 5 , 6}-
   הערה: ראה הפניות ^{4 , 5 ,}, ⁶, לקבלת פרטים נוספים על הדגימה, חלוקתה, צביעת נהלים.
3. Photomicrograph כל מקטע באזור מוגדר עניין עם עדשת הגדלה נמוכה באמצעות מיקרוסקופ. שימוש מטרה X 2.5 (נ. א. 0.12) ומסנן להגדיר 10, 450-490/515-565 עירור/פליטה). שמור את הגדרות המצלמה (חשיפה פעמים, למשל, 2 s) זהה מדגמים כדי להיות מנותח. שמור. קובץ TIF.
4. פתח את photomicrograph בתוכנית התמונה הנפוצה נצר; שני חלונות ייפתח. סגור החלון שצוין כמו " צבעי אינדקס ".
5. בחר " אפשרויות ", ואז " SliceŔ צפיפות מגוון רחב של גוונים תסומן בצבע אדום על החלון טבלת בדיקת מידע (LUT). בחלון, השתמש הסמן למילוי בתווית ספציפי GFP רק ולהפסיק כאשר ברקע שאינם ספציפיים מתחילה להיבחר בתמונה.
   הערה: זה ידגיש לאזור פלורסנט photomicrograph כדי ניתן לכמת. צריך ניתן למטב את ההגדרות ללכוד כל התאים בעליל פלורסנט במיוחד. עם התרגול, בשיטה זו ניתן בדיוק לסמן את קרינה פלואורסצנטית ספציפי.
6. לפני מדידת שטח פלורסנט, תחילה ודא כי המדידות שנעשו הם יחידות הנכון (פיקסלים). כדי לעשות זאת, לחץ על " ניתוח ", ואז " ScaleŔ להגדיר בשורה הרביעית צריך לומר " יחידות ". מהרשימה הנפתחת, בחר פיקסלים כדי למדוד בפיקסלים, ולאחר מכן לחץ על " אישור ". להחליף את אפשרויות ניתוח כדי " כוללים פנים חורים " כדי להבטיח הכללת כל תאי הגוף בניתוח.
לחץ על
7. כדי למדוד את השטח פלורסנט, " ניתוח " ולאחר מכן לחץ על " מדד ". כדי לראות את הערך, לחץ " ניתוח " מכן לחץ על " להראות ResultsŔ יופיע חלון תוצאות. מדידת השטח פלורסנט יהיה תחת הכותרת הנקרא " באזור ".
8. כדי להבטיח סטנדרטיזציה על פני המדידות, אינם משנים את הערכים מסומנים בחלון LUT-
9. לאחר כל המדידות תועדו, ממוצע הערכים עבור כל בעל חיים (מתוך סעיפים 3-6 לכל חיה). השתמש מבחן סטטיסטי המתאים כדי להשוות את האזורים transduced בין הקבוצות. ⁶

Representative Results

ליקויים מוטוריים המושרה TDP-43 אמור להיווצר תוך 2-6 שבועות, תלוי במנה של AAV TDP-43 בשימוש (איור 1). זריקות וריד הזנב לא מוצלח יגרום חלקית או ללא מגבלות; AAV צריך להגיע למחזור הדם כדי לייצר את האפקט. זריקה מוצלחת של AAV GFP תגרום בביטוי GFP ברחבי המוח וחוט השדרה באופן תלוי מינון וקטור. בעת שימוש האמרגן רקומביננטי חזקה לביטוי נסיעה, cytomegalovirus עוף ביתא אקטין היברידית מקדם, הידוע גם בשם מקדם החטיבה, יש ביטוי יעיל של מערכת העצבים המרכזית, כמו גם מספר רקמות אחרות כגון הכבד והלב. ^{4 , 5 , 10} . בתוך מערכת העצבים המרכזית, כאשר משתמש AAV9 או AAV PHP החולדה. B וקטורים, הדפוס הוא בעיקר עצביים התמרה חושית בלבד דליל, ספורדיים גליה התמרה חושית. ^{4 , 8} מאז אין הבדל מגדרי התמרה חושית יעילות נצפתה אצל חולדות עם השיטה בהיקף נרחב, הנקבות משמשים בדרך כלל עבור העברה גנטית תוך ורידי בשל משקלי התחתון שלהם. ⁶

שיטת הדמיה הכמותיים למחצה המתואר הוא מהיר ואמין כי יש יחס אות לרעש מעולה. מדגם שאינו transduced מושווה מדגם transduced באיור 2 עם שתי דגימות צבעונית עם הנוגדן GFP. ערכים שנאסף הדוגמיות הללו מצביעים על 0.3% רעש (מתוך הערכים המופיעים באיור 2B, D) בדוגמת שאינם transduced, אשר יכול להיחשב זניח. בהתחשב את יחס אות לרעש מעולה, שיטה זו בתוקף להשוואות מהירה של מחלות ניסיוני כמו סוגי וקטור, מינון וקטור, מגדר, גיל, וכו '.

איור 1. העברה גנטית AAV9 TDP-43 רחב היקף חולדות גורם ליקוי מוטורי מתקדמת- Rotarod ביצועים ב- 1-3 שבועות לאחר ג'ין העברה של הפקד GFP או הגן הקשורים ל- ALS TDP-43. הנושאים נבדקו לפני העברה גנטית, המדידות עוקבות שבאו לידי ביטוי כיחס לנקודת הזמן הבסיסית. עכברוש לא מטופל רגיל נשאר על rotarod מ- 60-90 s בתנאים אלה. איור זה השתנה מ⁶.

באיור 2. כימות מהירה של האזור פלורסנט GFP-חיוביות ושההתפתחות לאחר עירוי לוריד AAV לעכברוש. ב) Non-transduced מדגם הוכתם הנוגדן GFP. C, D) מדגם חולדה קבלת AAV9 GFP. B, D) נעשה שימוש באפשרות צפיפות פרוסה בתמונת נצר לסמן באופן סלקטיבי את האזור ניאון אדום ולאחר מכן הפיקסלים האדומים נספרים על-ידי התוכנית. האפשרות צפיפות פרוסה כדאי לסמן כל התאים פלורסנט גלויים כפי שניתן לראות ב- C. האזור אדום הביע פיקסלים מרובעים כמשהו מחושב על-ידי התוכנית מוצג ב', ד' נקודת הזמן היה 4 שבועות לאחר זריקה וריד הזנב של AAV9 GFP לחולדה למבוגרים צעירים במינון וקטור של עונה 1 פרק 10¹⁴ וקטור הגנום/ק"ג.... סרגל קנה מידה A הוא מיקרומטר 536; ההגדלה אותו בא-ד אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

מגוון רחב של מסלולים משלוח נבדקו עבור AAV וקטורים: אינטרה-parenchymal, אינטרה-cerebroventricular, thecal-"אינטרה", תוך ורידי, תוך-אפי, התוך שרירי, וכד'. כל המסלול ייתכן יתרונות ספציפיים, כמו גם חסרונות. מינהל וריד זנב AAV חולדות למבוגרים היא שיטה אמינה להשגת התמרה חושית עקבית של מערכת העצבים. בשיטת הזרקת היקפיים מונע המבוא של בצינורית הזרקה לתוך הרקמות CNS ולכן פולשנית. הביטוי CNS יעילה יכולה להיות מושגת על ידי שיטה זו הוא היתרון הגדול ביותר של הטכניקה. יתרונות מעשיים אחרים הם כי שיטת ההזרקה הוא מאוד מהיר (בערך 10 דקות לכל חיה מתחילתו ועד סופו), כי הזריקות וריד הזנב אינם מיומנויות טכניות גבוהות, לכן צורך לשלוט במהירות. . בהחלט, חיסרון גדול הוא הרבה וקטור כייל נוגדנים גבוה המצריך, אשר תהיה בעיית כדאיות אם AAV preps להלן עונה 1 פרק 10¹³ וקטור הגנום/ml.... עם עוד יותר עידון של וקטור מיקוד יכולות, גישה זו יכולה להיות יתרון עבור ריפוי גנטי קליניים בעתיד, נתון זה המסירה הגן על מסלול היקפי, ובכך יחסית לא פולשנית. מצד שני, יותר ישיר, זריקות הנוזל התוך cerebrospinal יכול להיות יתרון, גישות קליניות משתי סיבות: יותר ומעט התפשטות המבוססת על השימוש במינונים נמוכים וקטור.

חולדות עם פיגמנטציה כהה יותר, וריד הזנב עשוי להיות קשה יותר לזהות. אז, דרכים חלופיות של הממשל, כגון זריקות רטרו-מסלולית או זריקות תוך ורידי כדי וריד saphenous עשוי לשמש. זריקות רטרו-מסלולית היעד מיטה נימי צפופה, ובכך דומים זריקה תוך ורידי. על עכברים, ואולי עבור חולדות השיטה רטרו-מסלולית כך, יהיה קל יותר מאשר זריקות וריד הזנב, אבל שלושה מחקרים הראו עקביות נהדר מהמזרקים וריד הזנב בחולדות למבוגרים. ^{6 , 8 , 9} ביותר של עבודה זו בשימוש מקדם רקומביננטי חזקה לביטוי transgene נסיעה, cytomegalovirus עוף ביתא אקטין היברידית האמרגן. ¹⁰ אם הנסיין מבקש לתחימת ביטוי הנוירונים ב מערכת העצבים, מקדם ייחודיים לסוג התא יכול להיות ניסיון, לדוגמה מקדם synapsin. ^{8 , 11}

לגבי שיטת הדמיה, היא שיטה מהירה, כמותיים למחצה עבור הערכת היעילות התמרה חושית. אם התנהלה כראוי, וזמינותו התשואות הערכה אמינה של אזור transduced. שיטת תקן זהב עבור אובייקטים ספירה ב- CNS רקמת מכונה stereology. זה לוקח בערך 75 דקות לכל חיה לערוך בדיקה stereological באזור עניין במוח, ואילו השיטה המתוארת היא מהירה יותר ב 20 דקות לכל חיה או אפילו פחות כשמשנים. אם כל התנאים נשמרים שווים באותו האזור כראוי נדגמים, מרקם של הנתונים מתקרב מרקם מעולה של stereology, קבוצות גדולות של דגימות ניתן במהירות לנתח אותם בהמוניהם.

ישנם מספר הערות טכניות נוספות זה צו נוסף לדיון. לסעיף 1 לגבי מינונים וקטור, המנות וקטור הדרושים עבור הביטוי transgene יעילה בחולדות נקבעו על ידי משפט--שגיאה, מנה-תגובה וואנג. et al., דייטון. et al., ג'קסון. et al., כמו גם מינונים הקודמת השתמשו בעכברים (. Foust et al. , Duque ואח'). ^{1 , 2 , 4 , 5 , 6} בהחלט צעד קריטי, ואת פוטנציאל הגבלת קצב מפיק כייל גבוה preps AAV להשגת יעילות במינונים.

סעיף 3 לגבי טעינת וקטור לתוך המחט, בועות אוויר בפתרון ההזרקה להימנע הטובה ביותר האפשרית. כמות קטנה של אוויר לא צריך להיות בעייתי כמו זה וניתן לסנן על ידי הריאות, אך מוגזמת נפחי אוויר מוזרק לווריד יכול לגרום תסחיף ורידי אוויר העלול וכתוצאה מכך מוות. ¹² אם בועות נוכחים במזרק, הווירוס אמור להיות מגורש מן המזרק, מזרק חדש ייטען. כדי למנוע היצירה של בועות, הקפד למקם את המחט קרוב הירידה של וקטור על מצלמות-מיקרוסקופים עם שפוע פונה כלפי מטה. כאשר הרוב המכריע של וקטור נלקח לתוך המחט, לאט מאוד לצייר את הפתרון הנותרים. כיס אוויר קטן יהוו בירכתי המזרק. זהו שטח מת והוא לא להיות מוזרק. כדי להבטיח כי זה נשאר לכיוון החלק האחורי של המזרק, לשמור את המזרק אופקי או המחודד כלפי מטה, לא לסתור את המזרק.

סעיף 5 לגבי הזריקות, כדי להבטיח כי הזרקת נכנס את הווריד, לא רקמות המקיפים את הווריד, ברגע שהמחט הוכנס, לסגת מעט על הבוכנה כדי ליצור לחץ שלילי בקצה המחט. כפי שהוזכר, אם המחט בווריד, דם צריך לזרום בחזרה לתוך המחט, יהיה גלוי בבסיס של המחט. תוך כדי להזריק לווריד, מעט התנגדות צריך להיות מורגש כאשר המחט ממוקם כראוי. אם הוא נתקל בהתנגדות משמעותית, סביר להניח כי הזרקת הולך לתוך הרקמה של הזנב, כמתואר לעיל. זה גם אפשר לנקב דרך הווריד, גרימת "וריד מפוצץ", כאשר הזווית המחט מוחדרת הוא גבוה מדי, כאשר מד של המחט גדול מדי עבור הווריד, או כאשר מהירות הזרקת הוא מהיר מדי. יותר מדי להלחיץ הווריד. וריד פוצצו יכול להתרחש במהלך הניקוב הראשונית של הווריד או במהלך ההזרקה. כדי להימנע ניקב את הווריד במהלך ההזרקה או שיש את המחט להיות ניתק מן הווריד של, המזרק צריך להיות התייצב על-ידי החזקת בסוף המזרק נגד הזנב כאמור. אם המחט הופך רופף או זריקה שנייה יש צורך מסיבה אחרת, הזריקה השנייה יכולה להתבצע או לוריד הזנב לרוחב בצד הנגדי או למעלה קרוב אל הגוף באותו הצד.

סעיף 8, וזמינותו rotarod מנוהלת במרווחים של 4 שבועות במהלך הניסוי. . נורמלי, חולדות שלא טופלו יש ציונים טובים יותר כאשר הם צעיר (4-6 שבועות הישן) יותר בגילאים מבוגרים. לגירעונות רפלקס הבריחה מותוות כמו בהישרדות של תפקוד האיבר לאורך זמן. העקומות הישרדות מנותחים באמצעות בדיקת יומן-דרגה על תוכנה פריזמה.

לסעיף 9 לגבי הניתוח של התמרה חושית, שעם קצת תרגול, ההליך הופך יחסית מהר, לוקח בערך 20 דקות לכל בעל חיים או פחות. Assay הזה הוא גם ואמינים כיוון שאינם transduced רקמות כי הם מעובד עם GFP צביעת הליך (קריאה בעצם זניחאיור 2B), כי יש טווח דינמי רחב כדי המדידה. רוב זריחה GFP נובע תאי Purkinje transduced, לפיכך מספרם הגדול לספק טווח דינמי גדול. עד כה, לא יצרה יעילות העברת גנים מושגת המקראות עיתוני מעבר לתחום כולו (קרי, 100% התמרה חושית תאי Purkinje), לפחות בעת העברת הגן מנוהל חולדות למבוגרים. אם הרוויה של כל בעיה, אז האות תוכל להיגרע על-ידי החלת במינון נמוך וקטוריים בבעלי חיים נפרדים, או על-ידי מודדים רק את החלשים, יליד GFP פלורסצנטיות, מוותרים על ההליך מוכתמים. בהחלט התמרה חושית של סוגי תאים אחרים המוח הקטן יכול גם להיות תורם את האות, אך רוב מה ברצון גלוי, נספר על-פי התוכנית הוא בבירור הגופים תא הרבדים תאי Purkinje ועצים הדנדריטים שלהם במולקולרית שכבות ברחבי המוח הקטן, בהתבסס על המיקום הידוע שלהם ועל מורפולוגיה. אתגר משמעותי בשיטה הוא כי בועות אוויר או פסולת פלורסנט אפשר לספור, אשר ובכך לזהם את הקריאות. מקטעים ושדות עם הרעש הזה לא משמשים; דוגמאות נקי ללא רעש שאינם ספציפיים נדרשים. מאז ה-GFP הוא חלבון זר, יש בלי רעש רקע בתוך הרקמה, אז ידי קרינה פלואורסצנטית ספציפי יכול בדיוק ולהיות מוערך. במחקרים אלה, photomicrographs ה-GFP היו בשבי צבע, ואז מומרת לגווני באמצעות תוכנית הדמיה מלבד התמונה נצר. עם זאת, זה יהיה יותר ישירה ללכוד את ה-GFP בשחור-לבן במקום הראשון לניתוח עוקבות בתמונת נצר. מחקרים קודמים ניתח את התמרה חושית של חוט השדרה התחתון מוטורי לגלוקוז על בסיס אחוזים, קרי, האחוז של motoneurons לבטא GFP. ^{4 , 6} אולם, הניתוח של המוח הקטן היא מהירה יותר, הדורשים פחות סעיפים, מופיע גם להיות עקבית ומהימנה יותר מדי (לדוגמה, מעבר בודדים משקיפים הפיכת הערכותיו). שיטת הדמיה אסטרוציטומה מהירה היא לפיכך אינדקס מהירה טובה של ההצלחה של העברה גנטית ההיקפית אל מרכזי. ניתוחים של עמוד השדרה התמרה חושית, דוגמאות התמרה חושית של אתרים אחרים במערכת העצבים עכברוש דווחו וואנג. et al., דייטון. et al., ג'קסון. et al. ^{4 , 5 , 6}

לסיכום, המסלול תוך ורידי של המינהל הוא פולשנית; ניתן לפלח את מערכת העצבים המרכזית על ידי המינהל היקפיים ללא הצבת מחט לתוך במוח או בחוט השדרה. יחד עם עידון נוספת של מיקוד, טיפולים רלוונטיים ג'ין וקליני ימשיכו להשתמש משלוח תוך ורידי, בעוד רבים לסוגים בעתיד הרבות של יסוד פונקציונלי מחקרים בחולדות ייצאו נשכרים על ידי התמרה חושית ולקיבולת בחיפוש כדי לזרז בדיקת השערות של תפקוד הגן ויוו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scale	Pelouze	SP5
Nalgene bucket	Thermo Scientific	12014000	4000 mL
Microcentrifuge tube	USA Scientific	1615-5500
Lactated Ringer's Solution	Baxter Healthcare	0338-0114-04
Mini vortexer	Fisher Scientific	128101
Centrifuge	Eppendorf	22624415
Laboratory film	Bemis	PM996
1-mL syringe	BD	309626	Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection
30g needle	BD	305106
Isoflurane	Piramal Healthcare	66794-013-25	Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask	Kopf Instruments	906
Gauze	Henry Schein	100-2524	2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips	USA Scientific	1111-0816
Micropipet	Gilson	4642080
Gas anesthesia vaporizer	SurgiVet	4214322	Classic T3
Gas anesthesia scavenger	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
Heating pad	Sears	17280
Bench pad	VWR	56617-006
Rotarod	Panlab/Harvard Apparatus	76-0772	4 rats/ 4 mice
70% Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 proof
70% Isopropanol	VWR	89108-160
Scion Image	Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody	Invitrogen	A11122	Primary Antibody - 1:500 dilution
AlexaFluor 488	Invitrogen	A11070	Secondary Antibody - 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope	Zeiss