Summary
쥐에서 대규모 중앙 신경 유전자 배달 방법 적용 됩니다. 이 예제에서는 목적은 전체 척수에 영향을 미치는 질병을 모방 이다. 광범위 한 변환, 주변 관리에서 CNS에 치료 단백질을 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다.
Abstract
정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR), optogenetics, cre lox 타겟팅, 등 클러스터 Adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터는 신경 과학에 키 시는. 이 원고의 목적은 AAV의 꼬리 정 맥 주입을 통해 쥐에 광대 한 중앙 신경 시스템 (CNS) 유전자 전송을 시도 하는 탐정을 원조 하기 위하여. 대규모 식 광범위 한 병 리, 조건에 대 한 관련 이며 쥐 모델은 중요 한 그것의 큰 크기와 쥐에 비해 인 간에 게 생리 적인 유사성 때문입니다. 이 예제에서는 응용 프로그램에서 대규모 신경 전달 전체 척수, 루 경화 증 (ALS)에 영향을 미치는 신경 질환을 모방 하는 데 사용 됩니다. 효율적인 대규모 CNS 변환 전 임상 연구에서 치료 단백질 요소를 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다. 몇 주 후 주입 식 간격 후 변환의 효과 평가 됩니다. 녹색 형광 단백질 (GFP) 제어 벡터에 대 한 소 뇌에 GFP 양의 기본적인 이미징 프로그램에 의해 신속 하 고 안정적으로 추정 된다. ALS에 의해 유도 모터 질병 고기 관련 단백질 양자가 응답 43 kDa (TDP-43)의 DNA 묶는 단백질, 적자 탈출 반사와 rotarod에 의해 득점 된다. 질병 모델링 및 유전자 치료, 대규모 진 여기에 설명 된 대상에 대 한 다양 한 잠재적인 신청이 있다. 이 메서드를 사용 하 여 확장 된 가설 신경 과학에서 neurogenetics 테스트를 신속에 도움이 됩니다.
Introduction
왜냐하면 그들은 너무 신경 vivo에서 시험에 대 한 효율적인 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터 CNS 연구를 위한 필수적인 도구는. AAV 벡터는 매우 다른 transgenes 및 단백질 isoforms, 다른 조직, 다른 호스트 종, 그리고 관리의 다른 노선 공부에 대 한 다양 한. 예를 들어, AAV 관리할 수 마우스 주변 기기로, 상대적으로 비-침략 적, 처음으로 신경 통해 CNS transduce를 정 맥 주사 설명 Foust 외 에 두 끼 외. Gombash 그 외 여러분 에 의해 (참조 정돈 종이 (2014))입니다. 1 , 2 , 3 이 유전자 납품 방법은 어느 녹색 형광 단백질 (GFP)를 효율적으로 표현 하 쥐에 사용 됩니다 또는 ALS 관련 단백질, 양자가 응답 CNS에서 43 kDa (TDP-43)의 DNA 묶는 단백질. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 중요 한는 쥐에서 일 쥐의 생리 및 대사 매개 변수는 마우스에 비해 인 간에 게 가까이 있으며 행동 및 독물학 분석 실험 쥐를 위해 특별히 설계 된 때문입니다. 또한, 더 많은 유전자 변형 쥐 라인 제공 되고있다는 AAV 유전자 전달 연구에 이용 될 수 있다.
메서드는 쥐, 그리고 결과의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 정량화에 광대 한 CNS 유전자 이동에 대 한 자세한. 대규모 CNS 변환 척수 전체 TDP-43으로 표현 하 여 쥐에서 ALS의 징후를 모방 하는 데 사용 됩니다. 방법은 TDP-43 벡터 잭슨 외 에 사용으로 젊은 성인 쥐의 꼬리 정 맥 주사 6 , 8 , 9 몇 주 후, TDP-43-유도 모터 적자는 승리 두 가지 방법으로: 반사와 데이 턴 외 에 잭슨 그 외 여러분 사용 rotarod 탈출 5 , 6 , 7 , 9 사후 분석, 제어 GFP 벡터에 대 한 소 뇌의 형광 영역으로 계산 됩니다 변환 효율 잭슨 외 에서 사용 되는 인덱스 6 , 8 소 뇌의 분석 주변 유전자 납품 후 CNS 변환의 정도의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 색인 것을 입증 했다 고 주변 중앙 유전자 전송을 시도 하는 접근의 다양 한에 적용 해야 합니다.
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Protocol
모든 절차에 따라 적절 한 NIH 지침. 모든 절차는 동물 관리 및 사용 위원회 위조에 LSU 건강 과학 센터에 의해 승인 된 동물 프로토콜을 따 랐 다. 여성 Sprague-Dawley 쥐 나이의 6 주에는이 절차에 대 한 사용 되었다.
1. 필요한 벡터의 복용량/볼륨 결정
- 무게 벡터 준비 titer (농도)를 기반으로 하는 주입 각 동물에 필요한 바이러스 성 벡터의 크기를 결정 하 쥐. 이전 쥐 CNS에에서 효율적인 식 성공 했습니다 벡터 복용량을 사용 하 여 (잭슨 외를 참조 하십시오. 6).
참고: AAV9 TDP-43 또는 AAV9 GFP, 전형적인 복용량은 3 × 10 13-1 x 10 14 벡터 게놈/kg 사이. 나이의 6 주에 젊은 성인 쥐 무게 약 150 g. - 체계적인 비교에 대 한 모든 동물에 kg 당 동등한 복용량을 확인합니다. 볼륨 표준 권고 주입 볼륨 (250 g 쥐 250-500 µ L)를 초과 하지 않는 확인 하십시오. 전형적인 주입 볼륨은 젊은 성인 쥐에 200 μ.
2. 준비 작업 역
- 필요한 모든 용품을 수집: 한 파라핀 영화 동물, 동물, 거 즈 패드 (2-3 동물 당) 당 하나의 알코올 준비 패드 당 (약 5 x 5 cm) 사각 피펫으로 팁, 그리고는 micropipette.
- 70% 에탄올으로 표면 청소 작업 면을 준비 합니다. (~ 37 ° C) 낮은 설정 온도 아래로 열 패드를 놓습니다. 벤치 패드 난방 패드 위에 놓습니다.
- 가스 마 취 (isoflurane) 준비합니다. 적절 한 산소와 절차에 대 한 마 취 가스를 확인 합니다. 70% 에탄올, 유도 약 실 및 마 취 마스크를 청소 하 고 벤치 패드에 마 취 마스크를 놓습니다.
3. 벡터를 준비
- 벡터 실 온에서 해 동 하 고 각 동물에 대 한 살 균 microcentrifuge 튜브 라벨.
- 피펫으로 AAV의 볼륨에 결정 1.1 적절 한 관을 원하는 주입 볼륨 (여기, 200 μ)까지 볼륨 lactated 벨소리가지고 ' s 솔루션 또는 염 분.
- 소용돌이 1-2에 대 한 샘플 펄스와 다음 펄스 5 원심 분리기 튜브의 하단에 샘플을가지고 s.
- 피펫으로 튜브와 파라핀 영화의 광장에 쥐에 대 한 총 주입 볼륨.
- 1 mL 주사기 30 게이지 바늘 위.
- 는 파라핀 영화에 벡터에 아래로 향하게 하는 경사와 바늘을 놓습니다. 때까지 모든 바이러스 바늘과 주사기 주사기 플런저에 다시 당겨. 연습 쉽게 되는 바늘으로 공기 방울 그리기 않도록 주의 하십시오.
4. 쥐를 준비
- 1 L/min까지 산소 고 isoflurane 마 취 5%로 설정. 모든 연결 호스 및 자 지의 방향을 확인 하 여 가스 마 취 유도 챔버를 흐르는입니다 확인 하십시오.
- 쥐 응답 하지 않는 때까지 약 3 분, 가스 마 취 유도 실에서 쥐를 장소.
- 는 발가락을 곤란 하 게 하 여 마 취의 적절 한 깊이 확인 합니다. 발가락 핀치 후 발 또는 다리에 운동 되어야 합니다.
- Isoflurane 마 취 마 취의 유지 보수에 대 한 2%로 감소 하 고는 자 지를 조정 하는 마 취는 마 취 마스크를 흐르는.
- 쥐 장소 ' s 마 취 마스크에서 코와 그것의 측면에 거짓말은 쥐를 조정.
- 식별 측면 꼬리 정 맥.
참고: 약 10 2 o에서 측면 꼬리 정 맥 거짓말 ' 12 꼬리의 지 느 러 미 상단 시계 o ' 시계. 쥐의 측면에 누워와 측면 꼬리 정 맥 한다 직면 자책점 - 는 알코올 준비 패드 주입 영역을 닦으십시오. 주사 부는 꼬리의 길이 아래로 2/3.
5. 벡터를 주입
- 단단히 잡고 꼬리 약간 한 손가락으로 주입 영역 위에 측면 꼬리 정 맥에 직접;이 정 맥을 팽창 합니다.
- 빗면 위로 향하도록 정렬 같은 방향으로 보이는 꼬리 정 맥으로 바늘.
- 을 피하기 위해 다른 한편으로는 꼬리를 잡고 고 꼬리 정 맥에 큰 관심을 복용 하는 동안 꼬리 정 맥을 통해 피부를 피어스.
- 정상 혈액 흐름 수 있도록 꼬리 정 맥에서 압력을 풀어.
- 정 맥에 바늘을 이동합니다. 바늘 꼬리 정 맥 구멍은 되도록 뒤로 당겨 약간 플런저 합니다. 정 맥에 바늘 있으면 바늘으로 혈액 흐름 것입니다.
- 조정 필요에 따라 바늘
- 입니다. 바늘을 안정, 사출 사이트 아래에 주사 부 위에 손을 이동 그리고 꼬리에 대 한 주사기의 끝을 잡고.
참고: 정 맥은 그것을 통해 벡터 흐름으로 색상을 잃을 수 있습니다. 징후는 솔루션 혈관 밖에 주입 했다 포함 blebbing, 벡터를 주입 하는 경우는 피부, 또는 저항의 창백. 연습으로, 여분 혈관 노출 최소화 될 수 있다.
6. 정리
- 해제는 isoflurane 마 취와 산소. 의식, 차릴 때까지 쥐를 모니터링 하 고 다음 그것의 감 금에 반환.
- 신중 하 게 sharps 컨테이너에 모든 바늘을 배치합니다. 잠재적으로 오염 된 AAV 적절 한 생물 용기에 다른 모든 일회용 재료의 처분. 70% 에탄올과 작업 역 청소.
7. 평가 hindlimb 탈출 반사
참고: Hindlimb 적자 일반적으로 발생 하는 벡터 복용량에 따라 TDP-43 유전자 이동 후 2-6 주.
- 두 손가락으로 파편의 평면 클리어에는 쥐를 잡아 ' s는 몸에서 약 2 cm 꼬리. 앞 발은 쥐의 복 부 아래쪽을 보는 동안 걸려 때까지 쥐를 부드럽게 들어올립니다.
- 수행 주간 과정에 걸쳐 실험 시간-유전자 이동 후 절차 (예를 들어, 유전자 이동 후 12 주까지).
참고:이 방법으로 또한 점수를 forelimb 적자 하지만 hindlimb 적자는이 모델을 사용 하는 벡터 복용량에 따라에서 발생할 가능성이 높습니다.
- 수행 주간 과정에 걸쳐 실험 시간-유전자 이동 후 절차 (예를 들어, 유전자 이동 후 12 주까지).
- 하나 또는 둘 모두 hindlimbs 10 동안 중간 선 향해 닥 10 미 메모는 hindlimbs 관찰 s.
- 반복 30 세 번의 총에 대 한이 테스트 시험 사이 s. 하나 또는 둘 모두 hindlimbs는 3 개의 시험의 각각에 대 한 꽉, 쥐 모터 역 기능을 보이고 있다. 경우에 모든 3 개의 시험에서 떨림 일관 된 어느 일방 또는 양자 hindlimb 적자 존재로 (주)에서 수동으로 데이터를 기록.
8. 평가 rotarod에 모터 기능
- rotarod, 설정 하는 rotarod 아래 벤치 패드를 배치 하 고 2 분 이상 (속도 증가 ~0.3 rpm/s) 4-40 분당 회전 (rpm)를 가속 설정. 12 주 시간-과정, 2, 4, 8에서 주제를 실행 하 고 유전자 후 12 주 전송.
- 허용 20 분에 대 한 테스트 룸에 두었던 쥐
- 는 rotarod 처음으로 사용 하 여 쥐를 훈련 하는 먼저 4 rpm의 설정된 속도에서 rotarod 시작 다음는 rotarod에 쥐를 놓고. 쥐 4 rpm에서 한 전체 혁명에 대 한 걸 다음 가속을 시작 하 고 쥐 그것 떨어지 때까지 rotarod에 걸을 수 있도록. 쥐 적어도 40에 대 한 지속적으로 걸을 수 있을 때까지 훈련을 계속 s. 건강 한, 젊은 성인 쥐 쉽게 이러한 방식으로 훈련 될 것 이다.
- 눈에 띄는 모터 손상 된 쥐의 경우는 기준 대기 시간 40의가을 달성에서 쥐를 되지 않을 수 있습니다 s, 쥐 rotarod 득점을 시작 하기 전에 3-5 교육 시도 제공.
- Rotarod 테스트를 시작 하는 쥐에는 rotarod 놓고는 rotarod의 가속을 시작. 참고 rotarod;에서 쥐가는 시간 이것은을에 대기 시간 이다. 쥐 120 후는 rotarod에 남아 경우 s,이 시점에서 세션 모자는 rotarod에서 쥐를 제거 하 고 120의가 대기 시간을 기록 s.
- 테스트 3 재판의 총에 대 한 두 번 더 반복 합니다. 피로의 효과 최소화 하기 위해 떨어져 재판 적어도 5 분 간격. 3 시험의 점수를 평균 한다. 손상 되지 않은 성인 쥐 일반적으로의을에 평균 대기 시간을가지고 > 40 s.
- 장에 다시 쥐를 놓고 rotarod 및 70% 에탄올과 주변 지역 청소.
9. 소 뇌에 GFP 식의 정량화
- Anesthetize 쥐 및 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 다음 4% paraformaldehyde perfuse. 두뇌 및 척수를 dissect 하 고는 정착 액에 담가 하룻밤 조직 30% 자당 해결책에 그들을 이동. 평형, 후에 동결 단계 4 , , 5 6와 슬라이딩 톰 50 μ m 코로나 섹션 컷.
- 는 Vermis, 소 뇌의 중앙 엽에에서 균등 하 게 배치 하는 소 뇌의 3-6 섹션을 선택 합니다. 신호를 최대화 하기 위해 GFP 레이블을 붙일. 1: 500에 GFP에 대 한 1 차적인 항 체를 사용 하 고 알 렉 사-488 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여 1:300 4 , , 5 6의 희석에.
참고: 참조 참조 4 , , 5 6 자세히는 샘플링에 대 한 단면, 그리고 절차를 얼룩. - 낮은 배율 렌즈 현미경을 사용 하 여 관심의 정의 된 영역에 각 섹션을 photomicrograph. 2.5 X 목표 (0.12 없음)를 사용 하 여 필터 설정 10, 450-490/515-565 여기/방출). 카메라 설정 (노출 시간, 예를 들어, 2 s) 샘플 분석을 통해 동일. 다른 이름으로 저장 한. TIF 파일.
- 널리 귀 공자 이미지 프로그램에는 photomicrograph를 열고; 2 개의 창이 열립니다. 닫기 창으로 표시 " 인덱스 색상 ".
- 선택 " 옵션 ", 다음 " 밀도 SliceŔ 그늘의 범위는 룩 업 테이블 (LUT) 창에 빨간색으로 표시 됩니다. 창에서 커서를 사용 하는 특정 GFP 라벨만 입력 하 고 일반적인 배경 이미지에 뽑 시작 중지.
참고:이 측정할 수를 photomicrograph에 형광 영역을 강조 표시 됩니다. 설정을은 구체적으로 모든 가시 형광 셀을 잡으려고 최적화 되어야 합니다. 연습으로,이 방법은 정확 하 게 특정 형광 강조 수 있습니다. - 형광 영역을 측정 하기 전에 먼저 올바른 단위 (픽셀)는 측정 인지 확인. 이렇게 하려면 " 분석 ", 다음 " 설정 ScaleŔ 네 번째 줄 라고 한다 " 단위 ". 픽셀 픽셀 단위로 측정을 클릭을 선택 드롭-다운 목록에서 " 확인 ". 분석 옵션을 설정/해제 " 인테리어 구멍 포함 " 분석에서 몸 전체 세포의 포함 되도록.
- 형광 면적 측정 클릭 " 분석 "을 클릭 하 고 " 측정 ". 이 값을 표시 하려면 " 분석 " 클릭 " 표시 ResultsŔ 결과 창이 나타납니다. 라는 제목 아래 형광 영역 측정 될 것입니다 " 지역 ".
- 측정에 걸쳐 표준화를 위해 LUT 창에서 강조 표시 된 값을 변경 하지 마십시오.
- 모든 측정 기록 되었습니다, 일단 평균 (동물 당 3-6 절)에서 각 동물에 대 한 값입니다. 적절 한 통계 테스트를 사용 하 여 그룹 간의 transduced 영역 비교. 6
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Representative Results
TDP-43 유도 모터 장애 AAV TDP-43 사용 (그림 1)의 복용량에 따라 2-6 주 이내에 발생 한다. 실패 한 꼬리 정 맥 주사 될 부분 또는 없음; AAV 효과 생산 하기 위해 혈 류를 도달 해야 합니다. AAV GFP의 성공적인 주입 벡터 복용량 의존 방식으로 뇌와 척수에 걸쳐 GFP 식에서 발생 합니다. 드라이브 식, 세포 치킨 베타 걸 하이브리드 발기인, CAG 발기인 라고도 강한 재조합 발기인을 사용 하는 경우 CNS 간, 심장 등 다른 여러 조직에 효율적인 표현이 이다. 4 , 5 , 10 내 쥐 CNS, AAV9 또는 AAV PHP를 사용 하는 경우. B 벡터, 패턴은 주로 신경 전달만 스파스, 산발적 glial 변환. 4 , 8 변환 효율에 성별 차이가 대규모 방법으로 쥐에서 관찰 되었다, 이후 여성 일반적으로 사용 됩니다 그들의 낮은 무게 때문에 정 맥 유전자 이동. 6
설명 하는 반 정량 이미징 방법을 신속 하 고 신뢰할 수 있는 우수한 신호 대 잡음 비율 때문에입니다. GFP 항 체로 얼룩진 두 샘플 그림 2에서 transduced 샘플 비 불리고 샘플 비교 합니다. 값이이 샘플에서 수집 무시할 간주 될 수 있습니다 비 불리고 샘플에서 ( 그림 2B, D에에서 나열 된 값)에서 0.3% 잡음을 나타냅니다. 우수한 신호 대 잡음 비율을 감안할 때,이 메서드는 벡터 형식, 벡터 복용량, 성별, 나이, 등 실험 조건의 빠른 비교에 대 한 유효 합니다.
그림 1입니다. 쥐에 대규모 AAV9 TDP-43 유전자 이동 진보적인 모터 장애 발생. 진 후 1 ~ 3 주에 Rotarod 성능 제어 GFP 또는 ALS 관련 유전자 TDP-43의 전송. 유전자 이동 이전 시험 과목 그리고 후속 측정 기준 시간 포인트에 비율으로 표현 되었다. 정상적인 치료 쥐가이 조건 하에서 60-90 s에서 rotarod에 있을 것입니다. 이 그림6에서 수정 되었습니다.
그림 2입니다. 쥐에 정 맥 AAV 관리 후 소 뇌에 GFP-긍정적인 형광 영역의 급속 한 정량화. GFP 항 체 물 이었다는 A, B) 비 불리고 샘플 C, D) AAV9 GFP를 받은 쥐에서 샘플. B, D) 귀 공자 이미지에는 밀도 슬라이스 옵션은 선택적으로 빨간색, 형광 영역을 강조 표시를 사용 하 고 다음 빨강 픽셀 프로그램에 의해 계산 됩니다. C에서 본 밀도 슬라이스 옵션 모든 보이는 형광 셀을 강조 해야 합니다. 프로그램에 의해 계산으로 정사각형 픽셀 표현 빨간색 영역 B, d.에에서 표시 됩니다. 시간 포인트는 벡터 1 x 1014 벡터 게놈/kg의 복용량에 젊은 성인 쥐에 AAV9 GFP의 꼬리 정 맥 주사 후 4 주 이었다. A에서 눈금 막대는 536 µ m; A.에 동일한 확대 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
다양 한 전달 경로 AAV 벡터에 대 한 테스트 되었습니다: 내부 parenchymal 내부-cerebroventricular, 내부 thecal, 정 맥, intranasal, 내부 근육, 등. 각 경로 특정 장점 뿐만 아니라 단점으로 할 수 있습니다. AAV의 성인 쥐의 꼬리 정 맥 행정은 CNS의 일관 된 변환 달성 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법입니다. 주변 주입 방법 CNS 조직으로는 주입 정 맥의 소개를 방지 하 고 최소 침 습 이므로. 이 방법으로 얻을 수 있는 효율적인 CNS 식 기법의 가장 큰 장점은입니다. 다른 실용적인 장점은 주입 방법은 매우 빨리 처음부터 끝까지 동물 당 (약 10 분)와 꼬리 정 맥 주사는 매우 기술 및 따라서 신속 하 게 마스터 수 있습니다. 물론, 주요 단점은 AAV preps 1 x 1013 벡터 게놈/ml 미만입니다 경우 타당성 문제를 될 것입니다 높은 titer 벡터의 많은 필요 하다는 점입니다. 추가 기능을 대상으로 하는 벡터의 구체화,이 이렇게 유리한 임상 유전자 치료는 미래에 대 한 주어진 유전자 배달 주변 경로가 고 따라서 상대적으로 비-침략 적 될 수 있습니다. 다른 한편으로, 더 많은 두 가지 이유로 내 cerebrospinal 액체 주사 전 임상 및 임상 접근에 유리한 수 직접: 벡터의 확산과 낮은 벡터 복용량의 사용 제한.
어두운 착 색 쥐, 꼬리 정 맥 더 식별 하기 어려울 수 있습니다. 그래서, 복고풍 궤도 주사 등 saphenous 정 맥을 정 맥 주사 관리의 대체 경로 사용할 수 있습니다. 복고풍 궤도 주사 조밀한 모 세관 침대를 대상 하 고 따라서 정 맥 주사와 유사. 마우스, 그리고 아마도 쥐도, 복고풍 궤도 메서드 수 있습니다 꼬리 정 맥 주사, 보다 쉽게 하지만 3 연구의 꼬리 정 맥 주사 큰 일관성 성인 쥐에. 6 , 8 , 9 이 작품의 대부분을 드라이브 transgene 식, 세포 치킨 베타 걸 하이브리드 발기인 강한 재조합 발기인 사용. 10 는 실험 식을 CNS에 있는 신경 세포를 구분 하고자 하는 경우 셀 형식이 특정 발기인 수 시도, 예: synapsin 발기인. 8 , 11
이미징 방법에 관하여 변환 효율 추정을 위한 빠르고, 반 정량적 방법 이다. 올바르게 실시 하는 경우 분석 결과 생성 transduced 영역의 신뢰할 수 있는 예상 합니다. 세 개체 CNS 조직에 대 한 표준 방법 stereology를 이라고 합니다. 반면 설명 방법은 빠른 동물 또는 심지어 20 분 덜 때 두뇌의 지역에서 stereological 조사를 실시 하는 동물 당 약 75 분 소요 됩니다. 모든 조건이 동일한 보관 됩니다 동일한 지역 제대로 샘플링 하는 경우 데이터의 일관성 접근 stereology의 훌륭한 일관성 그리고 샘플의 분석 될 수 있다 신속 하 게 한꺼번에.
추가 토론을 보증 하는 추가 기술 노트의 여러 가지가 있습니다. 벡터 복용에 관한 섹션 1, 쥐에 효율적인 transgene 식에 필요한 벡터 복용량 재판 및 오류와 왕 외., 데이 턴 외., 및 잭슨 그 외 여러분, 복용량 응답에 의해 결정 되었다 뿐만 아니라 쥐 (Foust 외. 고 두 끼 외)에 사용 되는 이전 복용량. 1 , 2 , 4 , 5 , 6 확실히 중요 한, 및 잠재적으로 속도-제한 단계는 생산 효과적인 복용량을 달성 하기 위해 높은 titer AAV preps.
섹션 3에 관한 바늘, 주입 솔루션에서 공기 방울에 벡터 로드 피해 야 한다 가능한 한 최고의. 공기의 작은 양을 해서는 안됩니다 문제가이 폐에 의해 밖으로 필터링 할 수 있습니다 하지만 과도 한 볼륨은 혈관에 주입 하는 공기의 잠재적으로 죽음의 결과로 정 맥 공기 색 전 증을 일으킬 수 있습니다. 12 거품 주사기에 경우에, 바이러스는 주사기에서 추방 한다 그리고 새로운 주사기를 로드 해야 합니다. 거품의 생성을 피하기 위해, 아래로 경사와는 parafilm에 벡터의 드롭 가까이 바늘을 위치 해야 합니다. 벡터의 대부분 바늘으로 채택 되는, 아주 천천히 그릴 때 나머지 솔루션을. 작은 공기 주머니는 주사기 뒤 형성할 것 이다. 죽은 공간 이며 주입 하지 않습니다. 그것은 주사기의 뒤쪽으로 유지 되도록 주사기 수평 또는 지적 아래로 유지 하 고 주사기를 터치 하지 마십시오.
섹션 5는 주사에 관한 주사 바늘 삽입 되 면, 정 맥 주변 조직 하지 정 맥으로가 되도록 뒤로 당겨 약간 플런저 바늘 끝에 부정적인 압력을 만들려고 합니다. 언급 했 듯이, 정 맥에 바늘 있으면, 혈액 다시 바늘에 흐름 해야 고 바늘의 기지에서 볼 수 있을 것입니다. 정 맥으로 주입 하는 동안 작은 저항 때 바늘 적절 하 게 배치 하는 느꼈다 한다. 상당한 저항을 발생 하는 경우 위에서 설명한 대로 주사는 꼬리의 조직으로가 가능성이 높습니다. 그것은 또한 "날 려 정 맥", 또는 주입 속도가 너무 빨리 너무 많은 압박을 정 맥에 바늘의 계기는 정 맥에 대 한 너무 큰 경우 바늘 삽입 각도가 너무 가파른 경우 발생 하는 정 맥을 통해 펑크 수 있습니다. 날 려 정 맥 주사 또는 정 맥의 초기 펑크 발생할 수 있습니다. 정 맥 주사 하는 동안 puncturing 또는 정 맥에서 dislodged 될 바늘을 방지 하려면 듯이 꼬리에 대 한 주사기의 끝을 잡고 주사기를 안정화 해야 합니다. 바늘 제거 된다 또는 다른 이유로 두 번째 주입이 필요, 경우 중 같은 쪽에 몸에 가까이 또는 반대 측에 측면 꼬리 정 맥에 두 번째 주사를 만들 수 있습니다.
섹션 8 rotarod 분석 결과 실험 기간 동안 4 주 간격으로 실행 됩니다. 보통, 치료 쥐 들은 젊은 (4-6 주 이전) 보다 더 오래 된 나가에 더 나은 점수를 있다. 이스케이프 반사에서 적자 생존 시간이 지남에 사지 기능으로 그려집니다. 생존 곡선 로그-순위 테스트 프리즘 소프트웨어에 의해 분석 된다.
변환 분석 연습,에 관한 섹션 9에 대 한 절차는 비교적 빠르고, 약 20 분 또는 그이 하 동물 당 복용 된다. 이 분석 결과 매우 신뢰할 수 있는 때문에 또한 불리고 비 조직은 기본적으로 무시할 수 읽기 (GFP 절차 얼룩 처리그림 2B) 및 판독에 광대 한 동적 범위 때문에. GFP 형광의 대부분 불리고 Purkinje 세포에서 파생 하 고 그들의 큰 숫자는 큰 동적 범위를 제공 하는 따라서. 지금까지 유전자 전송 효율 달성 하지 포화 (즉, 100% 변환 Purkinje 세포의), 전체 분야에 걸쳐 적어도 때 읽기 인해 유전자 이동 성인 쥐에 관리 된다. 채도 전체 필드의 문제가 있다면, 다음 신호 수 낮출 수 별도 동물에 낮은 벡터 복용량을 적용 하거나만 약한, 네이티브 GFP 형광, 얼룩 절차 forgoing 측정. 확실히 다른 종류의 세포 소 뇌에서 변환 수 또한에 기여 수 신호, 하지만 무엇 쉽게 볼 수 있으며 프로그램에 의해 계산 이며 명확 하 게 Purkinje 세포 층에서 셀 시체는 분자에 그들의 수지상 나무의 대부분 그들의 알려진된 위치 및 형태에 따라 소 뇌에 걸쳐 레이어. 방법에 중요 한 과제는 기포 또는 형광 성 파편 수 계산에 따라서 오염 수치입니다. 섹션 및이 잡음을 가진 필드는 사용 되지 않습니다; 깨끗 한 샘플 일반적인 잡음의 무료가 필요 합니다. GFP는 외국 단백질 이기 때문에, 그래서 특정 형광 수 있습니다 정확 하 게 캡처하고 추정, 조직 내의 배경 소음이입니다. 이러한 연구에서 GFP photomicrographs 색상에 있었고 귀 공자 이미지 이외의 이미징 프로그램을 사용 하 여 회색 음영으로 변환 됩니다. 그러나, 그것은 처음에 귀 공자 이미지에 후속 분석을 위해 흑인과 백인 GFP를 잡으려고 더 간단 것입니다. 이전 연구는 척수 낮은 모터 뉴런 motoneurons GFP 표현 즉, 비율, 비율 기준 변환 분석. 4 , 그러나 6 , 소 뇌의 분석 더 빠르고, 적은 부분을 요구 하 고 또한 더 일관 되 고도 (예: 개별 관측 평가 만들기에 걸쳐) 신뢰할 수 있는 것 처럼 보인다. 급속 한 소 뇌 이미징 방법 이렇게 주변 중앙 유전자 이동의 성공의 좋은 빠른 인덱스 이다. 척추 코드 변환 및 쥐 신 경계에서 다른 사이트의 변환의 예의 분석 왕 외., 데이 턴 외., 및 잭슨 그 외 여러분 보고 되었습니다. 4 , 5 , 6
요약 하면, 관리의 정 맥 경로 최소 침 습; CNS 두뇌 또는 척수에 바늘을 삽입 하지 않고 주변 관리 대상 될 수 있습니다. 대상의 추가 수정, 함께 관련 전 임상 및 임상 유전자 치료 계속 사용할 것입니다 정 맥 배달, 무수 한 미래의 유형의 쥐에 기본적인 기능 연구에 많은 탐구에 광대 한 변환으로 활용할 수 있는 반면 가설의 유전자 기능 vivo에서 신속 하 게.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 ALS 협회, Karyopharm 치료제, Inc., Meira GTx, 토마스 Lawson을 우리는 감사에서 ALS 연구에 대 한 자선 기부에 의해 투자 되었다. 우리 감사 Elysse 과수원과도 나 Burney 조언과 훈련. JAS 거짓말 재단이 지원 하 고 건강의 국가 학회 GM103418를 부여 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scale | Pelouze | SP5 | |
| Nalgene bucket | Thermo Scientific | 12014000 | 4000 mL |
| Microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Lactated Ringer's Solution | Baxter Healthcare | 0338-0114-04 | |
| Mini vortexer | Fisher Scientific | 128101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22624415 | |
| Laboratory film | Bemis | PM996 | |
| 1-mL syringe | BD | 309626 | Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection |
| 30g needle | BD | 305106 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | Isoflurane USP 250 mL |
| Anesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Gauze | Henry Schein | 100-2524 | 2" x 2" (5cm x 5cm) |
| Pipet tips | USA Scientific | 1111-0816 | |
| Micropipet | Gilson | 4642080 | |
| Gas anesthesia vaporizer | SurgiVet | 4214322 | Classic T3 |
| Gas anesthesia scavenger | SurgiVet | 32373B10 | Enviro-PURE |
| Heating pad | Sears | 17280 | |
| Bench pad | VWR | 56617-006 | |
| Rotarod | Panlab/Harvard Apparatus | 76-0772 | 4 rats/ 4 mice |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2401 | 140 proof |
| 70% Isopropanol | VWR | 89108-160 | |
| Scion Image | Scion Corporation | ||
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Invitrogen | A11122 | Primary Antibody - 1:500 dilution |
| AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11070 | Secondary Antibody - 1:300 dilution |
| Axioskop 40 microscope | Zeiss |
References
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- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).
- Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).
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