Summary
Эта рукопись представляет методы для анализа морфометрических и клеточные изменения в пределах нижней челюсти мыщелка грызунов.
Abstract
Височно-нижнечелюстного сустава (ВНЧС) имеет способность адаптироваться к внешним воздействиям, и загрузки изменения могут повлиять на позицию мыщелок, а также структурные и клеточные компоненты нижнечелюстной мыщелкового хряща (MCC). Эта рукопись описывает методы для анализа этих изменений и метод для изменения загрузки ВНЧС мышей (т.е., при сжатии статического ВНЧС загрузки). Структурной оценки, показанные здесь является простой морфометрические подход, который использует программное обеспечение Digimizer и выполняется в рентгенограммы мелких костей. Кроме того анализ сотовых изменения ведущие к изменениям в выражение коллагена, костного ремоделирования, деление клеток, и описан протеогликана распределения в MCC. Количественная оценка этих изменений в гистологических срезах - подсчитывая позитивные флуоресцентные пикселей с помощью программного обеспечения и измерения расстояния отображение изображений и окрашенных области с Digimizer - также продемонстрировал. Методы, показанный здесь, не ограничиваются мышиных височно-нижнечелюстного сустава, но могут быть использованы дополнительные кости небольших экспериментальных животных и в других регионах endochondral окостенения.
Introduction
ВНЧС является уникальный несущие сустава, расположен в регионе краниофациальных и формируется костная. MCC ВНЧС имеет важное значение для функции сустава, включая движение беспрепятственный челюсти а masticating, выступая, но часто подвержена дегенеративные заболевания, включая1остеоартрита. ВНЧС имеет способность адаптироваться к внешние раздражители и загрузки изменений, ведущих к структурной и клеточные изменения компонентов MCC2,3,,45. Свойства несущих МСС можно объяснить взаимодействие между его составляющих, включая воду, коллагена сети и плотно упакованные протеогликаны. MCC имеет четыре различных клеточных зонах, которые выражают различные типы белков коллагена и не коллаген: 1) поверхностные или суставной зоны; 2) пролиферативную зоны, состоящий из недифференцированных мезенхимальных клеток и что отвечает на загрузку требования; 3 prehypertrophic зона, состоящая из зрелых хондроцитов, выражая коллаген типа 2; и 4) гипертрофических зона, регионе, где гипертрофических хондроцитов, выражая коллаген типа 10 умирают и пройти кальцификации. Минерализованных регион богат протеогликаны, которые обеспечивают устойчивость к сжимающей силы6.
Существует непрерывная минерализации в зоне гипертрофических MCC, где происходит переход от chondrogenesis к остеогенез, гарантируя надежную минерального состава субхондральной кости нижней челюсти мыщелка7. Клеточные изменения в районах unmineralized и минерализованных в конечном итоге привести к морфологических и структурных изменений в нижней челюсти мыщелка и нижней челюсти. Поддержание гомеостаза всех клеточных регионов MCC и минерализации в субхондральной части имеют важное значение для здоровья, несущая способность и целостности ВНЧС.
Несколько модель трансгенные мыши коллагена (как описано в Утега и др.) 8 представляет собой прекрасный инструмент для использования понять изменения в выражении коллагена, потому что все трансгенов выражаются в MCC. Для углубленной оценки гистологических гистологические пятна используются для изучения матрицы осаждения, минерализации, пролиферации клеток и апоптоз, а также выражения протеина в различных клеточных слоев MCC.
В этой рукописи, гистологические и морфометрического анализа используются для оценки сотовой и структурные изменения в MCC и субхондральной кости нижней челюсти мыщелка мышей. Кроме того описан метод количественной оценки клетки, для анализа флуоресцентные гистологические изображения и для отображения световой микроскоп слайды. При сжатии статического ВНЧС, загрузки метод, который вызывает сотовой и морфологические изменения в MCC и субхондральной кости9, также иллюстрируется для проверки наших методов.
Методы, описанные здесь может использоваться для определения морфометрических и гистологические изменения в нижней челюсти мыщелка и нижняя челюсть грызунов или для анализа других регионов endochondral окостенения и морфология дополнительных минерализованных тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Комитет институционального ухода за животными центра здоровья университета Коннектикута одобрил все животные процедуры.
1. при сжатии статического ВНЧС загрузки: Рот, взломали
Примечание: Четыре week-old трансгенных мышей укрывательство флуоресцентные репортеров для коллагена (Col2a1XCol10a1), любезно предоставленных д-р Дэвид Роув (Университет штата Коннектикут), были использованы для экспериментов, описанных в этой рукописи (n = 8; 4 кобеля и 4 суки). Col2a1 голубой (синий) трансген выражается в клетках в prehypertrophic зоне MCC, а Col10a1 вишня (красный) клетки присутствуют в гипертрофических региона8 (рис. 1). Мышей были поровну разделены на две группы: 1) загружен группа, где мышей были подвергнуты при сжатии статического ВНЧС загрузки (описано в шаге 2) и 2) в контрольной группе, где мышей получил никакого вмешательства.
Рисунок 1. Представитель сагиттальной мыщелка двойной коллаген флуоресцентные репортер мыши (Col2a1XCol10a1). Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Изготовить Спрингс usingbeta титанового сплава брекетах (0,017 x 0,025 дюйма)(Рисунок 2).
- Анестезировать экспериментальных животных, внутрибрюшинного введения смеси кетамин (90 мг/кг массы тела) и ксилазина (13 мг/кг веса тела).
- Аккуратно откройте рот мышей и вставьте Спрингс, привлечение петли в верхней и нижней челюсти резцы (рис. 2B и C).
- Побудить сжатия статических ВНЧС загрузки, сохраняя пружины в резцов наркотизированных мышей, за 1 ч. Повторите эту процедуру на 5 дней.
- Внутрибрюшинно придать мышей с 5-ethnyl-2'-дезоксиуридина (EdU; 30 мг/кг веса тела) для анализа распространения клеток 2 дней и за 1 день до эвтаназии.
Рисунок 2. При сжатии статического ВНЧС загрузки: рот заставил открытая модель. (A) весной изготовлены из 0,017 х 0,025 бета титанового сплава дуга. (B) загружен мышь с весны. (C) рентгенограмме о загрузке и управления мышей показаны различия в позиционировании нижней челюсти. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
2. Нижняя челюсть диссекции и фиксация
- В конечной точке процедур, вынужден открыть рот усыпить экспериментальных животных утвержденным методом.
- Вскрыть мандибулы, резки мышечной вложения без соскабливания хряща мыщелка.
- Место уборка мандибулы в формалина 10% за 24 часа для фиксации.
Предупреждение: Формалин является раздражающее; носите соответствующие средства индивидуальной защиты.
3. рентгеновских изображений и морфометрические измерения
- Мандибулы в плоский контейнер (например, в 55 мм х 16 мм Петри) и принять рентгенограммы образцов, используя систему кабинета рентгеновской 26 кв для 5 s.
Примечание: Место линейки шкалы перед сохранением изображения. - Выполняют морфометрические измерения мандибулы, с помощью программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов).
Примечание: Перед выполнением любых измерений, используйте линейку шкалы на рентгенограмме для определения блока. Этот шаг важен для правильно измерить анатомические структуры. Нажмите на кнопку «Единица» (рис. 3А). - Выберите Анатомические точки, с помощью «стиль маркера 2» в программе обработки изображений (рис. 3B). Чтобы следовать метод, описанный в этом документе, выберите следующее (рис. 3B):
- Выберите condylion (пункт 1), наиболее задней точки нижней челюсти мыщелка;
- Выберите процесс резца (пункт 2);
- Выберите точку глубочайшее в сигмовидной паз (пункт 3);
- Выберите глубокая точка в вогнутость нижнечелюстной ветви (пункт 4);
- Выберите наиболее передней точки мыщелкового суставной поверхности (пункт 5); и
- Выберите наиболее задней точки мыщелкового суставной поверхности (пункт 6).
- После выбора точки анатомические, выполняют морфометрические измерения с помощью инструмента «длина», но для длины головы мыщелка, используйте средство «перпендикулярная линия» от точки (3) и (4) (рис. 3C).
- Измерьте длину нижней челюсти, от condylion (1) к процессу резца (2).
- Измерьте длину мыщелка головы - перпендикулярное расстояние от condylion (1) к линии проследить глубокая точка в вогнутость нижнечелюстной ветви (4) от глубокая точка на сигмовидной паз (3).
- Измерьте ширину головы мыщелка - расстояние от наиболее девяностодневного срока наиболее задней точки мыщелкового суставной поверхности (5-6).
- Копировать измерения из списка «измерения» на правой стороне экрана (рис. 3C).
Рисунок 3 . Представление морфометрические измерения нижней челюсти. (A) использовать линейку рентгенограмме для определения группы (кружил в красный цвет, шкалы бар: 10 мм). (B) выберите Анатомические точки с помощью «стиль маркера 2» (обведено красным). 1) Condylion; 2) процесс резцов; 3) глубокая точка на сигмовидной лётка; 4) глубокая точка в вогнутость нижнечелюстной ветви; 5) большинство передней точки мыщелкового суставной поверхности; 6) задней точки мыщелкового суставной поверхности. Линейки: 10 mm.(C) выполнять измерения с «Длина» и «перпендикулярно» инструменты (обведено красным). Измерения от точки 1 к 2: длина нижней челюсти; от точки 5-6: мыщелкового ширина; перпендикуляр от точки 1 к 4 - 3: мыщелкового головы длина. Сохранить измерения из списка «измерения». Шкалы бар = 10 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
4. мыщелка встраивание
Примечание: После взятия радиографические изображения, мандибулы можно врезать и секционного для гистологического анализа.
- Место undecalcified мандибулы (которые были исправлены в шаге 2.3) в 30% сахарозы в ФБР на ночь до внедрения.
- Вскрыть любой избыток мягких тканей и тщательно вырезать нижней челюсти мыщелка.
- Налить некоторые вложения смолы (достаточно, чтобы покрыть образец) в одноразовых пластиковых форм и место поверхности медиального мыщелка против базы плесень, позиционирование образца параллельно в нижней части формы.
- Исправьте образца в правильное место с куском сухого льда.
- Заполните форму с внедренными смолы и место плесень с фиксированной выборки в холодных 2-метил Бутан, который может быть предварительно охлажденные в морозильной камере-20 ° C или ° C-80 или сухого льда.
- Храните образцы при-20 ° C или при температуре-80 ° C до секционирование.
5. мыщелка сагиттальной разрезания и подготовки слайд
- Создайте замороженных сагиттальной разделы мыщелков (5-7 мкм) и передать образцы слайдов с помощью ленты передачи метода10,11.
- Придерживайтесь гистологических срезах, переданы ленты с помощью УФ отверждаемыми метод10.
6. гистологические окрашивание и микроскопических изображений
Примечание: Большинство гистологические окрашивания выполняется, как описано в разделе гистологические бумаги Даймент et al10.
- Для базового сканирования, первым шагом является изображение для Col2a1 и Col10a1 трансгенов, как описано в Даймент et al10 .
- Место coverslips на вершине слайды в 30% глицерина и PBS. Выполнение базовых изображений ofthesectionswitha флуоресцентный микроскоп и соответствующие фильтры.
- Выполняют окрашивание флуоресцентные тартрата стойкие кислой фосфатазы (ловушка).
Примечание: Ловушка выражается гемопоэтических клеток, в том числе кости, resorbing клетки, остеокласты12. Это пятно призвана анализировать MCC и субхондральной кости ремоделирования.- Удалите coverslip слайдов путем замачивания их в PBS. Вымойте слайды в PBS три раза за 5 мин.
- Подготовьте ЛОВУШКУ буфера 1 путем растворения ацетат натрия безводный (9.2 g) и натрия тартрата L двуосновной дигидрат (11,4 г) в 1 Л дистиллированной воды. Отрегулируйте пэ-аш до 4.2 с уксусной кислотой и хранить ЛОВУШКУ буфера 1 на 4 ° C.
- Подготовьте ЛОВУШКУ буфера 2, свежезаваренным растворяя нитрита натрия (40 мг) в 1 мл дистиллированной воды.
- Подготовьте ЛОВУШКУ субстрата буфера (непосредственно перед окрашивание), смешивая 7,5 мл буфер 1 и 150 мкл буфера 2. Это решение (200 мкл) применить к каждому слайду 10 мин при комнатной температуре.
- Подготовка ЛОВУШКУ реакции буфера путем смешивания 1.840 мл буфера субстрата и 23 мкл флуоресцентные субстрата (см. Таблицу материалов).
Примечание: Флуоресцентные substrategeneratesayellowfluorescentsignal ЛОВУШКУ активности. - Удалите избыток ЛОВУШКУ субстрата буфера, нежно закупорить решение.
- Инкубируйте слайды с 200 мкл буфера реакции ловушка для 5 мин под черный свет лампы источника УФ.
- Вымойте слайды в PBS три раза за 5 мин.
- Место coverslips на слайды в 30% глицерина в PBS и выполнять микроскопических изображений10.
- Выполняют окрашивание распространения клеток.
Примечание: В этот assay, модифицированных тимидина аналоговые 5-ethynyl-2'-дезоксиуридина (EdU) включена в недавно синтезированных ДНК: делящиеся клетки помечены с флуоресцентной краской.- После обработки изображений для ловушки, удалите coverslips и мыть слайды в PBS три раза за 5 мин. Следуйте инструкциям из комплекта распространения клеток 5-ethynyl-2'-дезоксиуридина пятно Гистологические срезы.
- Подготовить реакции коктейль, добавив 430 мкл 1 X буфер реакции, 20 мкл рабочего раствора CuSO4, 1.2 мкл Люминесцентную краску и 1 X 50 мкл буфера добавка (суммарный объем 500 мкл является достаточно для одного слайда).
Примечание: Производитель рекомендует добавить ингредиенты в порядке, описанном здесь. - Инкубируйте слайды с подготовленной коктейли на 30 минут при комнатной температуре, в защищенном от света.
- Вымойте слайды в PBS три раза за 5 мин.
- Место coverslips на вершине слайды в 30% глицерина в PBS с 1:1,000 DAPI.
Примечание: DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) является синий флуоресцентный ядерной пятно, что привязывается к AT-богатых регионов в ДНК.
- Выполняют окрашивание толуидиновый синий (ТБ).
Примечание: ТБ пятнать показывает распределение протеогликана на MCC.- Промывайте indistilledwater слайды для удаления coverslips.
- После удаления coverslips, мыть слайды в дистиллированной воде 3 раза за 5 минут до полного удаления соли из PBS.
- Подготовить ТБ рабочего буфера, сделав решение (растворить 28.4 g натрия фосфат двухосновной в 1 Л дистиллированной воды) и решение B (растворить 27,6 g в 1 Л дистиллированной воды монокальций фосфат натрия). Mix 94,7 мл раствора A с 5,3 мл раствора развести B. это решение 1:1 в дистиллированной воде сделать 200 мл 0,1 м работает буфер. Исправьте рН 8.0 добавлением гидроксида натрия до тех пор, пока pH является фиксированным.
- Подготовка 1% акций ТБ: Смешайте 1 g ТБ в 100 мл дистиллированной воды.
- Подготовка рабочего раствора ТБ путем смешивания 40 мл 0,1 М рабочего буфера в 3 мл 1% акций ТБ.
- Инкубируйте слайды в рабочем растворе ТБ для 14-17 s.
Примечание: Это пятно имеет очень время чувствительной; Время инкубации может потребоваться скорректировать для предотвращения overstaining. - Вымойте слайды в дистиллированной воде 3 раза за 5 мин.
- Место coverslips на вершине слайды в 30% глицерина в дистиллированной воде. Выполнение визуализации10световой микроскоп.
Примечание: Сделать не coverslip слайды витражи для ТБ в глицерин + PBS. PBS вымывает этот тип пятно.
7. флуоресцентные гистологические количественная оценка
- Выполнять гистологические количественной флуоресцентных изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов).
Примечание: Основной принцип гистологические количественной оценки в этом методе является разделить количество флуоресцентные точек интереса на общее количество пикселей области интересов и умножить полученное число на 100, в результате чего процент положительных пикселей в рамках этого региона. - Выполните количественная оценка выражения Col10a1 в MCC сагиттальной секций мыщелков.
- При количественной оценке всех типов клеток и пятна, используя этот метод, выберите область, чтобы быть количественно. Откройте гистологические изображения в программное обеспечение анализа изображений и выберите область, используя «Лассо инструмент (L)» (рис. 4A). Для анализа, описанный здесь выберите регион MCC только; После выбора области, общее количество пикселей будет показан в поле «Гистограмма» на экране программного обеспечения (рис. 4A). Сохраните количество пикселов в области интереса.
- Выберите Col10a1 красные пиксели, используя средство выборки. Нажмите «Выбрать» на верхней панели, а затем «Цветовой диапазон». Нажмите на «инструмент «Пипетка», «выберите образец цвета для пикселя интерес в изображении и нажмите кнопку «ОК». Всех областях положительные для выбранного пикселя цвета будет выбран (Рисунок 4B). Скопируйте количество флуоресцентные пикселей (показан в поле «Гистограмма» экрана) и вставьте их в электронную таблицу или статистического программного обеспечения для анализа.
- Разделите количество пикселей, флуоресцентный над количество пикселей области интересов и умножить это число на 100: флуоресцентные пикселей / пикселы в области, представляющей интерес * 100.
Примечание: Другой тип клеток, таких как голубой Col2a1, может быть определена количественно с этим же методом, но синий пикселей должен быть выбран вместо Col10a1 красный пикселей.
Рисунок 4 . Представление трансген количественной оценки Col10a1. (A) выберите область интереса с «Лассо» (L). Для Col10a1-положительных клеток выберите весь нижнечелюстной хряща. Сохраните количество пикселей в поле «гистограмма». (B) выберите пиксель интереса, в данном случае, красной флуоресцентной Col10a1 пикселей. Обратите внимание, что только красный пикселов в области интересов будет выбран. Сохраните количество красных точек из окна «гистограмма». Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Выполните количественная оценка ЛОВУШКУ активности в MCC и субхондральной кости.
- Следуйте процедуре, описанной в шаге 8.2, но вместо только выбора области MCC, выберите области хряща и субхондральной кости (рис. 5A).
- Для анализа активности ЛОВУШКУ выберите желтый пикселей, порожденных ELF97 субстрат, как описано в шаге 8.2.2 (рис. 5B); копировать количество положительных пикселей; и вставьте их в электронную таблицу или статистического программного обеспечения для анализа.
- Получите процент ловушка позитивных пикселей путем деления количество желтых точек на общее количество пикселей в регионе субхондральной кости и умножения на 100.
Рисунок 5 . Представление флуоресцентные ЛОВУШКУ количественной оценки. (A) выберите область интересов (нижнечелюстной хряща и субхондральной кости) и сохранить количество пикселей этого региона. (B) выберите желтый флуоресцентный пикселей, представляющие ЛОВУШКУ активности. Обратите внимание, что только ловушка позитивных пикселей будет выбрать. Сохраните количество выделенных пикселов. Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Выполните количественная оценка EdU положительных клеток.
- EdU окрашенных слайды counterstained с DAPI, поэтому вместо подсчета общее количество пикселей в регионе интереса, выберите DAPI-позитивных пикселей для вычисления доли EdU позитивных пикселей. Выберите область интереса, как описано в пункте 8.2, но не сохранять общее количество пикселей. Выберите DAPI синий пиксель в качестве пробы цвета, как описано в шаге 8.2.2; копировать количество пикселей, DAPI-позитивные (рисA); и вставьте их в электронную таблицу или статистического программного обеспечения для анализа.
- Далее выберите EdU положительных пикселей (Жёлтый флуоресцентный пикселей) и сохранить количество пикселей в поле «гистограмма» (Рисунок 6B).
- Вычислить процент EdU пикселей путем деления числа EdU позитивных пикселей на количество пикселей DAPI-позитивных и умножения полученного числа на 100.
Рисунок 6 . Представление EdU количественной оценки. (A) выберите пролиферативной регион MCC (наружный слой хряща). Выберите DAPI-позитивных пикселей и сохранить количество пикселей. (B) выберите EdU положительных пикселей (желтый флуоресцентный) и сохранить количество пикселей. Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
8. Количественная оценка толщины хряща и протеогликана распределения
- Анализ толщины хряща (расстояние картирование) и толуидиновый синий окрашенных области с помощью программного обеспечения Digimizer изображения.
Примечание: Используйте линейку шкалы в гистологической изображения для определения единицы (рисA). - Выполните измерение отображение расстояния.
Примечание: Измерения расстояния сопоставления обеспечит толщины хряща на нижней челюсти мыщелка. В метод, описанный здесь выбраны пять регионов MCC, давая в среднем Общая толщина MCC. Исследователь может выбрать для измерения трех различных регионах, или даже одного региона в середине MCC.- С помощью инструмента «длина», Измерьте длину хряща от внешней поверхности до конца толуидиновый синий окрашенных области (рис. 7Б) в пяти регионах, или как много мест как предпочтительный.
- Копировать измерения длины из списка «измерения».
Примечание: Программное обеспечение также предоставляет в среднем измерений (рис. 7Б).
- Измерьте толуидиновый синий окрашенные области.
Примечание: В измерении толуидиновый синий окрашенные области, области протеогликана в MCC будет получен.- Выберите инструмент «область» и контур толуидиновый синий окрашенных области (рис. 7C).
- Скопировать области измерения из списка «измерения».
Рисунок 7 : Представление протеогликана распределения количественной оценки. (A) использовать линейку гистологические изображения определить устройство, нажав на кнопку «единица» (кружил в красный цвет., блок выбран: 500 мкм). (B) измерения толщины хряща в разных местах, используя средство «Длина» (обведено красным). Сохраните измерения из списка «измерения» в верхней правой панели. Программное обеспечение также предоставляет «статистика» в нижней правой панели, таким образом среднее и SD измерений могут быть получены непосредственно. (C) Измерьте толуидиновый синий окрашенных области с помощью инструмента «область» (обведено красным). Обведите область интересов и сохранить измерение из списка «измерения». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описательная статистика были выполнены для изучения распределения морфометрические измерения (длина нижней челюсти, мыщелкового длина, мыщелкового ширина) и гистологический анализ. Результаты были сопоставлены между загруженной группы (то есть, мышей подвергали сжимающей нагрузки с весны титана бета) и контрольной группы (т.е., соответствия управления мышей, которые не получают какой-либо процедуры). Статистически значимых различий между средствами были определены непарных t тест и p значение < 0,05 считается статистически значимой.
Морфометрические измерения, как описано в шаге 4 и на рисунке 3, были проведены в мандибулы о загрузке и группы контроля. Загружен группа представила с длиной значительного повышения нижней челюсти (загружен: 16.62 ± 0,23 мм против управления: 16.21 ± 0,2 мм; p < 0,05) и длина головы мыщелка (загружен: 4,6 мм, SD 0,08 мм против управления: 4,4 мм; SD 0,06; p < 0,05) по сравнению с контрольной группой. Тем не менее, не было никакого существенного различия в мыщелка ширина между группами (загружается: 3.06 ± 0,12 мм против управления: 2,9 ± 0,11; p = 0,09).
Количественная оценка распределения коллагена, с помощью метода, описанного в шаге 8, показали значительно увеличилась Col10a1 выражение в MCC мыщелков загруженной группы по сравнению с контролем (загружается: 21% ± 4,46% против управления: 7,50% ± 2.03%; p < 0,005; Рисунок 8 A и D). С другой стороны, было не статистически разница в Col2a1 выражении между загружен и контрольных групп (загружается: 4,85% ± 1,95% против управления: 2.92% ± 1,89%; p = 0,13; Рисунок 8 B и E). Кроме того, анализ ЛОВУШКУ активности показали увеличение ловушка инфицированных регионов в регионе субхондральной мыщелков загруженных мышей (загрузки: 5.28% ± 1,45% против управления: 2,41% ± 1,39%; p < 0,05; Рисунок 8 C и F). Аналогичным образом, мы наблюдали рост клеточной пролиферации, как свидетельствует увеличение EdU положительных клеток в MCC загруженной группы по сравнению с контролем мышей (загружается: 6,23% ± 1,89% против управления: 1,90% ± 1.03%; p < 0,05; Рисунок 9 A и C).
Протеогликана распределения в MCC о загрузке и управления мышей была количественно оценена путем оценки толуидиновый синий окрашенных области и расстояние карта, как описано в шаге 9 и Рисунок 7. Мы нашли значительно увеличили расстояние сопоставления в MCC мыщелков загруженной группы по сравнению с контролем (загружен: 210.22 мкм ± 4.11 мкм против управления: 187.36 мкм ± 8,64 мкм; p < 0,005; Рисунок 9 B и D). Однако, протеогликана окрашенных области отличается не статистически между загружен и контрольных групп (загружен: 203,897.93 µm2 ± 10,171.00 µm2 против управления: 202,875.09 µm2 ± 33,419.09 µm2; p = 0,94; Рисунок 9 B и E)
Рисунок 8 : Представитель результаты: (A) Col10a1-положительных клеток в сагиттальной разделах MCC мыщелков от управления и загружен мышей. Есть увеличение числа Col10a1-положительных клеток в группе загружен (D). (B) Col2a1-положительных клеток в управления и загружен мышей. Нет никакой разницы в Col2a1-положительных клеток между группами (E). (C) ЛОВУШКУ, окрашивание мыщелков управления и загружен мышей. Повышенная активность ЛОВУШКУ в группе загрузки по сравнению с контролем (F). Гистограммы (D-F) представляют собой средства ± SD для n = 4 в группе. ** Значительная разница между элементом управления и загруженных групп (p < 0,005). Шкалы бар = 200µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9:представитель результаты: (A) EdU окрашивание мыщелков управления и загружен мышей. Увеличение пролиферации в группе загруженного в лице увеличение EdU положительных клеток (C). (B) толуидиновый синий пятнать в мыщелков управления и загружен мышей. Увеличение толщины хряща в загруженной мышей, как показано увеличение расстояния сопоставления в экспериментальной группе (D). Никакой разницы в протеогликана окрашенных области между элементом управления и загруженных групп ((E)). Гистограммы (C-E) представляют собой средства ± SD для n = 4 в группе. ** Значительная разница между элементом управления и загруженных групп (p < 0,005). Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта рукопись описал методы морфометрические измерения и клеточного анализа мышиных нижнечелюстной мыщелков и мандибулы. Радиографические морфометрические измерения может также использоваться для анализа других костей от небольших экспериментальных животных. Кроме того клеточного анализа (клетки количественной оценки и картирования расстояние хряща) не ограничиваются грызунов нижней челюсти мыщелка, но может использоваться для количественной оценки гистологических срезах многочисленных тканей.
Трансгенные мыши модели, выражая флуоресцентные журналисты являются отличными инструментами для визуально понять изменения в экспрессии генов. Двойной коллаген флуоресцентные репортер модель мыши (Col2a1XCol10a1), используется в настоящем докладе был особенно хорошо подходит для изучения MCC, поскольку трансгенов выражаются в регионе prehypertrophic и гипертрофических MCC так что распределение коллагена может быть вычислено. Если исследователь не имеют доступа к трансгенные мыши модели, выражая флуоресцентные репортеров, другие методы анализа выражения гистологические белков, например иммунофлюоресценции, может использоваться.
Для морфометрических измерений важный шаг, прежде чем принимать кабинета рентгенограмме изображения для удаления всех мягких тканей челюсти или костей для анализа. Чрезмерным мышцы или мягких тканей, придает кости может подменить реальный измерений структур. Важно быть в курсе ограничений системы кабинета рентгенограмме. Как каждый рентгеновский это представление 2-мерных, 3-мерной структуры, и дублирования структур и артефакты должны толковаться тщательно. Кроме того позиционирование костей в радиографический кабинета должна быть последовательной.
Клеточных количественной оценки путем подсчета числа положительных пикселов является эффективным методом для гистологической количественной оценки в регионе ячейки богатых, как MCC, но ограничение этого подхода является, что она не обеспечивает точное количество клеток. Кроме того поскольку он измеряет только пикселы выбраны, рекомендуется для количественной оценки всех изображений интереса, с использованием того же пикселя «выборки» чтобы избежать количественной точек разной интенсивности при анализе различных изображений.
Общая кусок советы при количественной оценки гистологических срезах является анализ нескольких последовательных разделы каждого образца (в этой рукописи, три последовательных секций были проанализированы для каждого мыщелка), поскольку обычно наблюдаются вариации в пределах каждого образца.
Методология, упомянутых в наших экспериментах простой, легкий в использовании и может использоваться в любом исследовании минерализованных тканей, в котором репортер используются мышей. С существующей методологии это позволяет визуализировать клетки, которые запятнана ловушки (Col2a1 или Col10a1) или Эду (Col1a1 или Col2a1) визуализации Сопредседатель локализации клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют без финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-р Дэвид Роув за любезно предоставленную трансгенных мышей и Li-Chen для гистологической помощи.
Исследования в этой публикации было поддержано Национального Института стоматологии и челюстно-лицевой исследования национальных институтов здоровья под награду номер K08DE025914 и Американской ассоциации ортодонтические фондом для Sumit Yadav.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MX20 Radiography System | Faxitron X-Ray LLC | ||
| Digimizer Image software | MedCalc Software | ||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Manual microscope Axio Imager Z1 | Carl Zeiss | 208562 | |
| yellow fluorescent protein filter - EYFP | Chroma Technology Corp | 49003 | |
| cyan fluorescent protein filter - ECFP | Chroma Technology Corp | 49001 | |
| red fluoresecent protein filter - Cy5 | Chroma Technology Corp | 49009 | |
| sodium acetate anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
| sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ELF97 substrate | Thermo Fisher Scientific | E6600 | |
| ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit | Life Technologies | C10339 | includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Scientific | D1306 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems Incorporated | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Research Products International | P32080-100T | |
| CNA Beta III Nickel-Free Archwire | Ortho Organizers, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. |
References
- LeResche, L. Epidemiology of Temporomandibular Disorders: Implications for the Investigation of Etiologic Factors. Crit Rev Oral Biol Med. 8 (3), 291-305 (1997).
- Chen, J., et al. Altered functional loading causes differential effects in the subchondral bone and condylar cartilage in the temporomandibular joint from young mice. Osteoarthr Cartil. 17 (3), 354-361 (2009).
- Pirttiniemi, P., Kantomaa, T., Sorsa, T. Effect of decreased loading on the metabolic activity of the mandibular condylar cartilage in the rat. Eur J Orthod. 26 (1), 1-5 (2004).
- Chavan, S. J., Bhad, W. A., Doshi, U. H. Comparison of temporomandibular joint changes in Twin Block and Bionator appliance therapy: a magnetic resonance imaging study. Prog Orthod. 15 (57), (2014).
- Dutra, E. H., et al. Cellular and Matrix Response of the Mandibular Condylar Cartilage to Botulinum Toxin. PLoS ONE. 11 (10), 0164599 (2016).
- Benjamin, M., Ralphs, J. R. Biology of fibrocartilage cells. Int Rev Cytol. 233, 1-45 (2004).
- Shen, G., Darendeliler, M. A. The Adaptive Remodeling of Condylar Cartilage- A Transition from Chondrogenesis to Osteogenesis. J Dent Res. 84 (8), 691-699 (2005).
- Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
- Kaul, R., et al. The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage. PLoS ONE. 11 (7), 0160121 (2016).
- Dyment, N. A., et al. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J Vis Exp. , e54468 (2016).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).
- Hayman, A. R. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).
