En morfometrisk og cellulære analysemetode for den Murine Mandibular kondyl

Summary

Dette manuskript præsenterer metoder til at analysere morfometrisk og cellulære ændringer inden for den mandibular kondyl på gnavere.

Abstract

Kæbeleddet (TMJ) har kapacitet til at tilpasse sig ydre stimuli, og indlæsning af ændringer kan påvirke placeringen af condyles, samt de strukturelle og cellulære komponenter af den mandibular kondylære brusk (MCC). Dette manuskript beskriver metoder til at analysere disse ændringer og en metode til at ændre lastning af TMJ i mus (dvs., trykstyrke statisk TMJ indlæsning). Den strukturelle evaluering illustreret her er en simpel morfometrisk tilgang, der bruger Digimizer software og er udført i røntgenbilleder af små knogler. Derudover analyse af cellulære ændringer fører til ændringer i kollagen udtryk, knoglen remodeling, celledeling, og proteoglycan distribution i MCC er beskrevet. Kvantificering af disse ændringer i histologiske sektioner - ved at tælle de positive fluorescerende pixel ved hjælp af software og måle afstanden kortlægning billedet og farves område med Digimizer - er også vist. De metoder, der er vist her er ikke begrænset til murine TMJ, men kunne være brugt på ekstra knogler af små eksperimentelle dyr og i andre regioner af endochondral ossifikation.

Introduction

I TMJ er en unik bærende fælles beliggende i regionen kraniofacial og er dannet af fibrocartilage. MCC i TMJ er afgørende for ledfunktion, herunder uhindret kæbe bevægelse mens taler og masticating, men det er almindeligt påvirket af degenerative sygdomme, herunder slidgigt¹. I TMJ har kapacitet til at tilpasse sig ydre stimuli og lastning ændringer, fører til strukturel og cellulære ændringer til komponenterne i MCC^2,3,4,5. De bærende egenskaber af MCC kan forklares af vekselvirkninger mellem dets bestanddele, herunder vand, kollagen-netværk og tæt pakket proteoglycaner. The MCC har fire forskellige cellulære zoner, der udtrykker forskellige typer af kollagen og ikke-kollagen proteiner: 1) den overfladiske eller artikulære zone; 2) den proliferativ zone, der består af udifferentierede mesenchymale celler og der reagerer på lastning krav; 3) den prehypertrophic zone, der består af modne chondrocytter udtryk for kollagen type 2; og 4) den hypertrofisk zone, den region, hvor de hypertrofisk chondrocytter udtryk for kollagen type 10 dør og gennemgå forkalkning. Ikke-mineraliseret regionen er rig på proteoglycaner, som giver resistens over for trykstyrke styrker⁶.

Der er løbende mineralisering på Hypertrofiske zone af MCC, hvor overgangen fra chondrogenesis til osteogenesis opstår, garantere subchondral knogle af mandibular kondyl⁷robust mineral struktur. Cellulære ændringer i regionerne unmineralized og mineraliseret i sidste ende føre til morfologiske og strukturelle ændringer i mandibular kondyl og underkæben. Opretholdelsen af homøostase i alle cellulære regioner af MCC og mineralisering af subchondral del er afgørende for sundhed, bæreevne og integritet af TMJ.

Flere kollagen transgene musemodel (som beskrevet af Utreja et al.) ⁸ er et fantastisk værktøj til at bruge til at forstå ændringer i kollagen udtryk, fordi alle transgener udtrykkes i MCC. For en dybdegående histologisk vurdering, er histologiske pletter brugt til at studere matrix deposition, mineralisering, celleproliferation, og apoptose samt protein udtryk på de forskellige cellelag af MCC.

I dette bruges manuskript, histologiske og morfometrisk analyser til at evaluere cellulære og strukturelle ændringer i MCC og subchondral knoglen af den mandibular kondyl på mus. Derudover er en celle kvantificering metode, til at analysere fluorescerende histologiske billeder og for kortlægning af lys objektglas, beskrevet. Trykstyrke statisk TMJ lastning metode, som forårsager cellulære og morfologiske ændringer på MCC og subchondral knogle⁹, er også illustreret for at validere vores metoder.

De metoder, der beskrives her kan bruges til at bestemme morfometrisk og histologiske forandringer i mandibular kondyl og underkæben af gnavere eller at analysere andre regioner af endochondral ossifikation og morfologi af yderligere mineraliseret væv.

Protocol

Institutionelle animalsk omhu Udvalget af University of Connecticut Health Center godkendt alle animalske procedurer.

1. trykstyrke statisk TMJ lastning: Mund tvunget åben

Bemærk: Fire-uge-forhenværende Transgene mus husly fluorescerende journalister for kollagen (Col2a1XCol10a1), venligst leveret af Dr. David Rowe (University of Connecticut), blev brugt til eksperimenter beskrevet i dette manuskript (n = 8, 4 hanner og 4 hunner). Col2a1 cyan (blå) transgenet udtrykkes i celler på MCC prehypertrophic zone, mens Col10a1 kirsebær (rød) celler er til stede i hypertrofisk region⁸ (figur 1). Mus blev ligeledes opdelt i to grupper: 1) den indlæste gruppe, hvor mus blev udsat for trykstyrke statisk TMJ indlæsning (beskrevet i trin 2) og 2) kontrolgruppe, hvor mus fik ingen intervention.

Figur 1. Repræsentant sagittal af kondyl på en dobbelt-kollagen fluorescerende reporter mus (Col2a1XCol10a1). Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

1. Fremstil springs usingbeta titanium legering archwires (0.017 x 0,025 in) (figur 2A).
2. Bedøver de forsøgsdyr ved en intraperitoneal injektion af en blanding af ketamin (90 mg/kg legemsvægt) og xylazin (13 mg/kg legemsvægt).
3. Forsigtigt åbne munden af mus og indsætte fjedre, engagerende sløjfer i maxillary og mandibular fortænderne (figur 2B og C).
4. Fremkalde kompressionskraft statisk TMJ indlæsning ved at holde fjedrene i fortænderne bedøvede musenes for 1 h. Gentag denne procedure for 5 dage.
5. Injicere musene med 5-ethnyl-2'-deoxyuridine (EdU; 30 mg/kg legemsvægt) intraperitoneal for celle spredning analyse 2 dage og 1 dag før aktiv dødshjælp.

Figur 2. Trykstyrke statisk TMJ lastning: mund tvunget åben model. (A) foråret fabrikeret af 0.017 x 0,025 beta titanium legering archwire. (B) indlæst mus med foråret. (C) røntgenbillede af indlæst og kontrol mus viser forskelle i placeringen af mandiblen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

2. mandiblen dissektion og fiksering

1. På slutpunktet af procedurerne tvunget åben mund, aflive de eksperimentelle dyr på en godkendt måde.
2. Dissekere hvaltænder ved at skære den muskulære vedhæftede fil uden skrabning brusk fra kondyl.
3. Placer de rensede hvaltænder i 10% formalin i 24 timer til fiksering.
   Forsigtig: Formalin er et irritationsmoment; bære passende personlige værnemidler.

3. X-ray Imaging og morfometrisk målinger

1. Placere hvaltænder i en flad container (f.eks. en 55 mm x 16 mm petriskål) og tage røntgenbilleder af prøverne ved hjælp af et kabinet x-ray system på en 26 kV for 5 s.
   Bemærk: Placer en skalalinjen før du gemmer billeder.
2. Udføre morfometrisk målinger af hvaltænder bruger et billede analyse software (Se Tabel af materialer).
   Bemærk: Inden du udfører nogen målinger, bruge skalalinjen på røntgenbillede for at bestemme enheden. Dette trin er vigtigt at ordentligt måle de anatomiske strukturer. Klik på knappen "Enhed" (fig. 3A).
3. Vælg de anatomiske punkter ved hjælp af "markør stil 2" i billedbehandlingsprogrammer (fig. 3B). For at følge metoden beskrevet i dette dokument, skal du vælge følgende punkter (fig. 3B):
   1. Vælg condylion (punkt 1), den mest bageste punkt af den mandibular kondyl;
   2. Vælg chopper proces (punkt 2);
   3. Vælg det dybeste punkt på den sigmoid notch (punkt 3);
   4. Vælg det dybeste punkt i konkavitet af den mandibular ramus (punkt 4);
   5. Vælg den mest forreste punkt af den kondylære artikulære overflade (punkt 5); og
   6. Vælg den mest posterior kondylære artikulær overfladen (punkt 6).
4. Efter at vælge de anatomiske punkter, udføre morfometrisk målinger ved hjælp af værktøjet "længde", men kondyl hoved længde, værktøjet "vinkelrette linje" fra point (3) og (4) (figur 3C).
   1. Måle den mandibular længde, fra condylion (1) til chopper proces (2).
   2. Måle kondyl hoved længde - den vinkelrette afstand fra condylion (1) til en linje, spores fra det dybeste punkt på den sigmoid notch (3) til det dybeste punkt i hule af den mandibular ramus (4).
   3. Måle kondyl hoved bredde - afstand fra mest foran det mest bageste punkt, den kondylære artikulære overflade (5-6).
   4. Kopiere målinger fra listen"måling" på højre side af skærmen (figur 3C).

Figur 3 . Repræsentation af morfometrisk målinger af mandiblen. (A) bruge skalalinjen af røntgenbillede for at bestemme enheden (cirklet i rød, skalalinjen: 10 mm). (B) vælge de anatomiske punkter ved hjælp af "markør stil 2" (rød cirkel). 1) Condylion; 2) chopper proces; 3) dybeste punkt på den sigmoid notch; 4) dybeste punkt i hule af den mandibular ramus; 5) mest forreste punkt af den kondylære artikulære overflade; 6) mest bageste punkt i den kondylære artikulære overflade. Skalalinjen: 10 mm.(C) udføre målinger med "længde" og "vinkelret" værktøjer (rød cirkel). Målinger fra punkt 1 til 2: mandibular længde; fra punkt 5 til 6: kondylære bredde; vinkelret fra punkt 1 til 4 - 3: kondylære hovedet længde. Gemme målinger fra "måling liste." Skalalinjen = 10 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

4. kondyl indlejring

Bemærk: Efter at have taget de radiografiske billeder af hvaltænder kan indlejret og sectioned for histologiske analyse.

1. Placer undecalcified hvaltænder, (der er fastsat i trin 2.3) i 30% saccharose i PBS natten før indlejring.
2. Dissekere eventuelle overskydende blødt væv og skær forsigtigt den mandibular kondyl.
3. Hæld nogle indlejring harpiks, (nok til at dække prøven) i engangs plast forme og placere den mediale overflade af kondyl mod bunden af mug, positionering prøven parallelt med bunden af formen.
4. Fix modellen i det rigtige sted med et stykke af tøris.
5. Fyld formen med indlejring harpiks og placere formen med fast prøve i kolde 2-methyl-butan, som kan være pre kølet i et-20 ° C eller-80 ° C fryser eller tøris.
6. Opbevares ved-20 ° C eller på-80 ° C enheder indtil skæring.

5. kondyl Sagittal afsnitsinddeling og dias forberedelse

1. Oprette frosne sagittal sektioner af condyles (5-7 µm) og overføre prøverne til det pågældende dias ved hjælp af tape overførsel metode^10,11.
2. Overholde de histologiske afsnit overført til båndet ved hjælp af UV-helbredes metode¹⁰.

6. histologiske farvning og mikroskopisk billeddannelse

Bemærk: De fleste af de histologiske farvning er udført som beskrevet i den histologiske sektion af papiret af Dyment al.¹⁰.

1. Til baseline scanning, er det første skridt at billede til Col2a1 og Col10a1 transgener, som beskrevet af Dyment al.¹⁰ .
   1. Placer coverslips oven på diasene i 30% glycerol og PBS. Udføre baseline imaging ofthesectionswitha fluorescerende mikroskop og passende filtre.
2. Udføre fluorescerende tartrat-resistente sur fosfatase (FÆLDE) farvning.
   Bemærk: TRAP er udtrykt ved hæmatopoietisk celler, herunder knogle resorbing celler, osteoklaster¹². Formålet med denne plet er at analysere MCC og subchondral knogle remodellering.
   1. Fjern coverslip dias ved iblødsætning dem i PBS. Vask dias i PBS tre gange i 5 min.
   2. Forberede FÆLDE buffer 1 ved at opløse natriumacetat vandfri (9,2 g) og natrium L-tartrat dibasiske dihydrat (11,4 g) i 1 L destilleret vand. PH indstilles til 4.2 med eddikesyre og gemme den FÆLDE buffer 1 ved 4 ° C.
   3. Forberede FÆLDE buffer 2 af frisk opløse natriumnitrit (40 mg) i 1 mL destilleret vand.
   4. Forberede FÆLDE substratbuffer (lige før farvning) ved at blande 7,5 mL af buffer 1 og 150 µL af buffer 2. Gælde denne løsning (200 µL) for hvert lysbillede i 10 min ved stuetemperatur.
   5. Forberede FÆLDE reaktion buffer ved at blande 1.840 mL med substratbuffer og 23 µL af fluorescerende substrat (Se Tabel af materialer).
      Bemærk: Den fluorescerende substrategeneratesayellowfluorescentsignal til FÆLDE aktivitet.
   6. Fjern overskydende FÆLDE substratbuffer ved forsigtigt pipettering løsningen.
   7. Glassene inkuberes med 200 µL af TRAP reaktion buffer i 5 min i en UV-kilde pære sort lys.
   8. Vask dias i PBS tre gange i 5 min.
   9. Placer coverslips på dias i 30% glycerol i PBS og udføre mikroskopisk billeddannelse¹⁰.
3. Udføre celle spredning farvning.
   Bemærk: I denne analyse, den modificerede thymidine analog 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) er indarbejdet i nyligt syntetiserede DNA: delende celler er mærket med et fluorescerende farvestof.
   1. Efter imaging til FÆLDE, fjerne coverslips og vaske dias i PBS tre gange i 5 min. Følg trinene fra 5-ethynyl-2'-deoxyuridine celle spredning kit til at plette de histologiske sektioner.
   2. Forberede en reaktion cocktail ved at tilføje 430 µL 1 X reaktion buffer, 20 µL af CuSO₄, 1,2 µL af fluorescerende farvestof og 50 µL 1 X buffer tilsætningsstof (en samlet maengde paa 500 µL er nok for ét dias).
      Bemærk: Producenten anbefaler tilføje ingredienser i den rækkefølge, der er beskrevet her.
   3. Glassene inkuberes med de forberedte cocktails i 30 min. ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
   4. Vask dias i PBS tre gange i 5 min.
   5. Placer coverslips oven på diasene i 30% glycerol i PBS med 1:1,000 DAPI.
      Bemærk: DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) er en blå fluorescerende nukleare plet, der binder sig til ATT-rige regioner i DNA.
4. Udføre toluidin blå (TB) farvning.
   Bemærk: TB farvning afslører proteoglycan distribution på MCC.
   1. Skyl dias indistilledwater for at fjerne coverslips.
   2. Efter fjernelse af coverslips, vask dias i destilleret vand tre gange for 5 min hver til helt at fjerne salte fra PBS.
   3. Forberede TB arbejder buffer ved at gøre løsning en (opløse 28.4 g natrium fosfat dibasiske i 1 L destilleret vand) og løsning B (opløses 27,6 g natrium fosfat monobasic i 1 L destilleret vand). Mix 94,7 mL af opløsning A med 5,3 mL af opløsning B. Dilute denne løsning 1:1 i destilleret vand at gøre 200 mL af 0,1 M arbejder buffer. Rette til pH 8,0 ved at tilføje natriumhydroxid, indtil pH-værdien er faste.
   4. Forberede 1% stock TB: Bland 1 g af TB i 100 mL destilleret vand.
   5. Forberede TB brugsopløsning ved at blande 40 mL af 0,1 M arbejder buffer i 3 mL 1% stock TB.
   6. Glassene inkuberes i TB brugsopløsning for 14-17 s.
      Bemærk: Denne plet er meget tid følsomme; i inkubationstiden kan skal justeres for at forhindre overstaining.
   7. Vask dias i destilleret vand tre gange i 5 min.
   8. Placer coverslips oven på diasene i 30% glycerol i destilleret vand. Udføre lysmikroskop imaging¹⁰.
      Bemærk: Må ikke coverslip dias farvet for TB i glycerol + PBS. PBS udvasker denne type af pletten.

7. fluorescerende histologiske kvantificering

1. Udfører histologiske kvantificering af fluorescerende billeder ved hjælp af et billede analyse software (Se Tabel af materialer).
   Bemærk: Det grundlæggende princip om histologiske kvantificering i denne metode er at opdele antallet af fluorescerende pixel af renter af det samlede antal pixels i området af interesse og formere opnåede antallet af 100, hvilket resulterer i en procentdel af positive pixels inden for dette område.
2. Udføre kvantificering af Col10a1 udtryk i MCC sagittal sektioner af condyles.
   1. Når kvantificere alle typer af celler og pletter ved hjælp af denne metode, skal du vælge området til kvantificeres. Åbn de histologiske billeder i et billede analyse software og vælg området ved hjælp af "Lasso Tool (L)" (figur 4A). Til analysen beskrives her, Vælg MCC regionen kun; efter at vælge området, vises det samlede antal pixel i boksen "Histogram" på skærmen af software (figur 4A). Gemme antallet af pixels i området af interesse.
   2. Vælg Col10a1 røde pixels ved hjælp af stikprøver. Klik på "Vælg" på toppanelet, og derefter "Farveområde." Klik på "pipetteværktøjet," Vælg prøven farve for pixel af interesse i billedet, og klik på "OK". Alle områder positive for den valgte pixelfarve vil blive valgt (fig. 4B). Kopiere antallet fluorescerende pixel (vist i boksen "Histogram" af skærmen) og indsætte dem i et regneark eller en statistisk software til analyse.
   3. Opdele antallet af fluorescerende pixels over antallet af pixels i området af interesse og ganger dette antal med 100: fluorescerende pixels / pixel i interesseområde * 100.
      Bemærk: Andre typer af celler, såsom blå Col2a1, kan kvantificeres med denne samme metode, men de blå pixels bør vælges i stedet for Col10a1 røde pixels.

Figur 4 . Repræsentation af transgenet Col10a1 kvantificering. (A) Vælg område af interesse med "Lasso Tool" (L). For Col10a1-positive celler, skal du vælge hele mandibular brusk. Gemme antallet af pixels fra boksen "histogram". (B) vælge pixel af interesse, i dette tilfælde de røde fluorescerende Col10a1 pixel. Bemærk, at kun de røde pixels i området af interesse vil blive udvalgt. Gemme antallet af røde pixels fra boksen "histogram". Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

3. Udføre kvantificering af TRAP aktivitet i MCC og subchondral knoglen.
   1. Følg fremgangsmåden i trin 8.2, men i stedet for kun at markere området MCC, Vælg de brusk og subchondral knogle regioner (figur 5A).
   2. Vælg de gule pixel genereret af ELF97 substrat, for FÆLDE aktivitet analyse, som beskrevet i trin 8.2.2 (figur 5B); kopiere antallet positive pixel; og indsætte dem i et regneark eller en statistisk software til analyse.
   3. Opnå procentdelen af TRAP-positive pixel ved at dividere antallet af gule pixel af det samlede antal pixel i regionen subchondral knogle og multiplikation med 100.

Figur 5 . Repræsentation af fluorescerende FÆLDE kvantificering. (A) Vælg område af interesse (mandibular brusk og subchondral knogle) og gemme antallet af pixel i denne region. (B) vælge gul fluorescerende pixels, som repræsenterer FÆLDE aktivitet. Bemærk at kun TRAP-positive pixels vil være sluttet. Gemme antallet af markerede pixel. Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

4. Udføre kvantificering af EdU-positive celler.
   1. EdU-farvede dias er counterstained med DAPI, så i stedet for at tælle det samlede antal pixel i det pågældende område, skal du vælge DAPI-positive pixels til at beregne procentdelen af EdU-positive pixels. Vælg område af interesse, som beskrevet i trin 8.2, men Gem ikke det samlede antal pixel. Vælg DAPI blå pixel som farveprøven, som beskrevet i trin 8.2.2; kopiere antallet DAPI-positive pixel (fig. 6A); og indsætte dem i et regneark eller en statistisk software til analyse.
   2. Næste, vælge EdU-positive pixels (gul fluorescerende pixel) og gemme antallet af pixels i boksen "histogram" (fig. 6B).
   3. Beregne procentdelen af EdU pixel ved at dividere antallet af EdU-positive pixels med antallet af DAPI-positive pixels og multiplicere opnåede antallet af 100.

Figur 6 . Repræsentation af EdU kvantificering. (A) Vælg den proliferative region af MCC (det yderste lag af brusk). Vælg DAPI-positive pixels og gemme antallet af pixels. (B) vælge EdU-positive pixels (gul fluorescerende) og gemme antallet pixel. Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

8. kvantificering af brusk tykkelse og Proteoglycan Distribution

1. Analysere brusk tykkelse (afstand kortlægning) og toluidin blå-farvede område ved hjælp af Digimizer Image software.
   Bemærk: Brug skalalinjen i det histologiske billede til at bestemme enhed (fig. 7A).
2. Udføre en kortlægning afstandsmåling.
   Bemærk: Kortlægning afstandsmåling vil give tykkelsen af brusk på den mandibular kondyl. I metoden beskrevet her, er fem regioner af MCC valgt, giver et gennemsnit af den samlede tykkelse af MCC. Forskeren kan vælge at måle tre forskellige regioner eller endda en enkelt region midt i MCC.
   1. Du bruger værktøjet "længde", måle længden af brusk fra ydre overflade til slutningen af den toluidin blå-farvede område (fig. 7B) i fem regioner eller i så mange steder som foretrukne.
   2. Kopiere længde målinger fra "måling liste."
      Bemærk: Softwaren indeholder også et gennemsnit af målinger (fig. 7B).
3. Måle toluidin blå-farvede område.
   Bemærk: Ved maaling af toluidin blå-farvede område, området proteoglycan i MCC vil opnås.
   1. Vælg værktøjet "område" og kontur toluidin blå-farvede område (figur 7C).
   2. Kopier området målinger fra "måling liste."

Figur 7 : Repræsentation af proteoglycan distribution kvantificering. (A) bruge skalalinjen af det histologiske billede til at bestemme enheden ved at klikke på knappen "enhed" (cirklet i rød, enhed: 500 µm). (B) måle tykkelsen af brusk i forskellige steder ved hjælp af værktøjet "længde" (rød cirkel). Gemme målinger fra listen"måling" i øverste højre panel. Softwaren indeholder også "Statistik" i nederste højre panel, så middelværdi og SD af målingerne kan fås direkte. (C) måle toluidin blå-farvede område ved hjælp af værktøjet "område" (rød cirkel). Cirkel område af interesse og gemme måling på "måling listen." Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Representative Results

Beskrivende statistik blev udført for at undersøge fordelingen af morfometrisk målinger (mandibular længde, kondylære længde, kondylære bredde) og histologiske analyser. Resultater blev sammenlignet mellem gruppen indlæst (dvs. mus underkastes trykstyrke ladning med beta titanium foråret) og kontrolgruppe (dvs., matchende kontrol mus, der ikke har modtaget nogen procedure). Statistisk signifikante forskelle mellem midler blev bestemt af uparret t-test, og en p-værdi af < 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant.

Morfometrisk målinger, som beskrevet i trin 4 og figur 3, der blev udført i hvaltænder den indlæst og kontrolgrupper. Gruppen indlæst præsenteret med væsentligt øget mandiblen længde (indlæst: 16.62 ± 0,23 mm versus kontrol: 16.21 ± 0,2 mm; p < 0,05) og kondyl hoved længde (indlæst: 4,6 mm, SD 0,08 mm versus kontrol: 4,4 mm; SD 0,06; p < 0,05) i forhold til kontrolgruppen. Ikke desto mindre, der var ingen signifikant forskel i kondyl bredde mellem grupper (indlæst: 3,06 ± 0,12 mm versus kontrol: 2,9 ± 0,11; p = 0,09).

Kvantificering af kollagen distribution ved hjælp af metoden beskrevet i trin 8 afslørede betydeligt øget Col10a1 udtryk i MCC af condyles af gruppen indlæst i forhold til kontrol (indlæst: 21% ± 4,46% versus kontrol: 7,50% ± 2,03%; p < 0,005; Figur 8 A og D). På den anden side var der ikke statistisk forskel i Col2a1 udtryk mellem den indlæst og kontrol grupper (indlæst: 4,85% ± 1,95% versus kontrol: 2,92% ± 1.89%, p = 0,13; Figur 8 B og E). Derudover analyse af TRAP aktivitet viste øget TRAP-positive regioner i regionen subchondral af condyles indlæst mus (indlæst: 5.28 ± 1,45% versus kontrol: 2,41% ± 1,39%; p < 0,05; Figur 8 C og F). Ligeledes, vi observeret øget celleproliferation, som angivet af øget EdU-positive celler i MCC af gruppen indlæst i forhold til kontrol mus (indlæst: 6.23 ± 1.89% versus kontrol: 1,90% ± 1,03%; p < 0,05; Figur 9 A og C).

Proteoglycan distribution i MCC af indlæst og kontrol mus var kvantificeres ved at evaluere toluidin blå-farvede område og afstand kortet, som beskrevet i trin 9 og figur 7. Vi fundet signifikant øget afstand kortlægning i MCC af condyles af gruppen indlæst i forhold til kontrol (indlæst: 210.22 µm ± 4.11 µm versus kontrol: 187.36 µm ± 8,64 µm; p < 0,005; Figur 9 B og D). Området proteoglycan-farvede var dog ikke statistisk forskel mellem den indlæst og kontrol grupper (indlæst: 203,897.93 µm² ± 10,171.00 µm² versus kontrol: 202,875.09 µm² ± 33,419.09 µm²; p = 0,94; Figur 9 B og E)

Figur 8 : Repræsentative resultater: (A) Col10a1-positive celler i afsnittene sagittal i MCC af condyles fra kontrol og indlæst mus. Der er øget antal Col10a1-positive celler i gruppen indlæst (D). (B) Col2a1-positive celler i kontrol og indlæst mus. Der er ingen forskel i Col2a1-positive celler mellem grupper (E). (C) FÆLDE farvning i condyles kontrol og indlæst mus. Øget FÆLDE aktivitet i gruppen indlæst i forhold til kontrol (F). Histogrammer (D-F) repræsenterer middel ± SD for n = 4 pr. gruppe. ** Signifikant forskel mellem kontrol og lastede grupper (p < 0.005). Skalalinjen = 200µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 9:repræsentative resultater: (A) EdU farvning i condyles kontrol og indlæst mus. Øget celleproliferation i gruppen indlæst celler repræsenteret ved øget EdU-positive (C). (B) toluidin blå farvning i condyles kontrol og indlæst mus. Øget brusk tykkelse i de indlæste mus, som det fremgår af øget afstand kortlægning i den eksperimentelle gruppe (D). Ingen forskel i proteoglycan-farvede område mellem kontrol og lastede grupper (E). Histogrammer (C-E) repræsenterer middel ± SD for n = 4 pr. gruppe. ** Signifikant forskel mellem kontrol og lastede grupper (p < 0.005). Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Dette manuskript beskrevet metoder for morfometrisk måling og cellulære analyse af murine mandibular condyles og hvaltænder. Radiografisk morfometrisk målingerne kan også bruges til at analysere andre knogler fra små forsøgsdyr. Derudover den cellulære analyse (celle kvantificering og brusk afstand kortlægning) er ikke begrænset til de gnaver mandibular kondyl, men kan bruges til at kvantificere histologiske sektioner af talrige væv.

Transgene musemodeller udtrykker fluorescerende journalister er fremragende værktøjer til visuelt at forstå ændringer i genekspression. Den dobbelt-kollagen fluorescerende reporter musemodel (Col2a1XCol10a1) anvendes i denne rapport var specielt egnet til undersøgelse af MCC, da transgener udtrykkes i regionen prehypertrophic og hypertrofisk i MCC så at kollagen distribution kunne evalueres. Hvis forskeren ikke har adgang til en transgene musemodel udtrykker fluorescerende journalister, kan andre analysemetoder histologiske protein udtryk, såsom immunofluorescens, anvendes.

Morfometrisk målinger er det afgørende skridt før du tager kabinet røntgenbillede billeder til at fjerne alle bløde væv af mandiblen eller af knoglerne, der skal analyseres. Overdreven muskel eller blødt væv knyttet til knoglerne kunne maskere de egentlige målinger af strukturerne. Det er vigtigt at være opmærksom på begrænsningerne i kabinet røntgenbillede system. Ligesom hver x-ray, det er en 2-dimensional repræsentation af en 3-dimensionelle struktur og overlapning af strukturer og artefakter skal fortolkes nøje. Derudover bør positionering af knoglerne i Radiografisk kabinettet være konsekvente.

Den cellulære kvantificering ved at tælle antallet af positive pixels er en effektiv metode til histologisk kvantificering i en celle-rige region som MCC, men begrænsningen af denne tilgang er at det ikke giver det præcise antal celler. Hertil kommer, da det kvantificerer kun pixel valgt, anbefales det at kvantificere alle billeder af interesse ved hjælp af den samme "stikprøven" pixel for at undgå kvantificering af pixels med forskellige intensiteter, når du analyserer forskellige billeder.

Et generelt råd når kvantificere histologiske sektioner er at analysere flere serielle afsnit af hver prøve (i dette manuskript, tre seriel afsnit blev analyseret for hver kondyl), da variationer inden for hver prøve er normalt observeret.

Den metode, der er nævnt i vores eksperimenter er enkel, let at bruge, og kan bruges i enhver mineraliseret væv undersøgelse i hvilken reporter mus bliver brugt. Med den nuværende metode er det muligt at visualisere de celler, der er farvet for TRAP (Col2a1 eller Col10a1) eller EdU (Col1a1 eller Col2a1) ved at visualisere Co lokaliseringen af celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MX20 Radiography System	Faxitron X-Ray LLC
Digimizer Image software	MedCalc Software
Shandon Cryomatrix embedding resin	Thermo Scientific	6769006
Manual microscope Axio Imager Z1	Carl Zeiss	208562
yellow fluorescent protein filter  - EYFP	Chroma Technology Corp	49003
cyan fluorescent protein filter - ECFP	Chroma Technology Corp	49001
red fluoresecent protein filter - Cy5	Chroma Technology Corp	49009
sodium acetate anhydrous	Sigma-Aldrich	S2889
sodium L-tartrate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	228729
sodium nitrite	Sigma-Aldrich	237213
ELF97 substrate	Thermo Fisher Scientific	E6600
ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit	Life Technologies	C10339	includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Scientific	D1306
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S3264
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	71505
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260
Adobe Photoshop	Adobe Systems Incorporated
Phosphate buffered saline tablets (PBS)	Research Products International	P32080-100T
CNA Beta III Nickel-Free Archwire	Ortho Organizers, Inc.
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc.