Summary
ويعرض هذه المخطوطة أساليب لتحليل شكلي والتغييرات الخلوية داخل اللقمة الفك السفلي من القوارض.
Abstract
الصدغي (المفصل الفكي) لديها القدرة على التكيف مع المؤثرات الخارجية، وتحميل التغييرات يمكن أن يؤثر على موقف condyles، فضلا عن المكونات الهيكلية والخلوية الغضروف اللقمة الفك السفلي (MCC). ويصف هذه المخطوطة أساليب لتحليل هذه التغيرات وأسلوب لتغيير تحميل المفصل الفكي في الفئران (أي الضغط ثابت المفصل الفكي تحميل). التقييم الهيكلي المبين هنا هو اتباع نهج شكلي بسيط يستخدم برنامج ديجيميزير ويتم إجراؤها في الصور الشعاعية للعظام الصغيرة. وباﻹضافة إلى ذلك، تحليل الخلوية التغييرات مما يؤدي إلى تغييرات في التعبير الكولاجين، يعيد البناء العظام، وانقسام الخلية، ويرد وصف لتوزيع بروتيوغليكان في لجنة التنسيق الإداري. التحديد الكمي لهذه التغييرات في الأقسام النسيجي-عن طريق العد بكسل الفلورسنت إيجابية باستخدام صورة البرامج وقياس المسافة التعيين والملون المنطقة مع ديجيميزير-ويتجلى أيضا. الأساليب الموضحة هنا لا تقتصر على المفصل الفكي مورين، ولكن يمكن أن تستخدم في عظام إضافية من الحيوانات التجريبية الصغيرة، وفي مناطق أخرى من التحجر endochondral.
Introduction
المفصل الفكي مشترك الحاملة فريد من نوعه يقع في منطقة الجمجمة ويتكون من فيبروكارتيلاجي. لجنة التنسيق الإداري المفصل الفكي ضروري لوظيفة مشتركة، بما في ذلك حركة الفك دون عوائق أثناء حديثة والمضغ، لكن عموما فإنه يتأثر بالأمراض التنكسية، بما في ذلك هشاشة العظام1. وقد المفصل الفكي القدرة على التكيف مع المؤثرات الخارجية وتحميل التغييرات، مما يؤدي إلى تغيرات هيكلية والخلوية للعناصر في لجنة التنسيق الإداري2،3،،من45. ويمكن تفسير الخصائص الحاملة من لجنة التنسيق الإداري بالتفاعلات بين مكوناته، بما في ذلك المياه، وشبكة الكولاجين، والمزدحمة بروتيوجليكانس. لجنة التنسيق الإداري قد المناطق الأربع الخلوية المميزة التي تعبر عن أنواع مختلفة من بروتينات الكولاجين وغير الكولاجين: 1) منطقة سطحية أو مفصلي؛ 2) منطقة التكاثري، تتألف من خلايا غير متمايزة الوسيطة، وأن يستجيب لتحميل الطلبات؛ 3) منطقة بريهايبرتروفيك، ويتألف من chondrocytes ناضجة معربا عن نوع الكولاجين 2؛ و 4) المنطقة، المنطقة حيث نوع chondrocytes الضخامي الإعراب عن الكولاجين يموت 10 الضخامي والخضوع تكلس. المنطقة غير المعادن غنية في بروتيوجليكانس التي توفر مقاومة لقوى ضاغطة6.
يوجد التمعدن مستمرة في منطقة الضخامي من لجنة التنسيق الإداري، حيث يحدث الانتقال من تشوندروجينيسيس إلى تكون العظم، تضمن هيكل عظم سوبتشوندرال اللقمة الفك السفلي7المعدنية قوية. التغيرات الخلوية في منطقتي أونمينيراليزيد وغضاريف تؤدي في نهاية المطاف إلى التغييرات البنيوية والهيكلية في اللقمة الفك السفلي والفك السفلي. الحفاظ على التوازن جميع المناطق الخلوية من لجنة التنسيق الإداري وتمعدن الجزء سوبتشوندرال ضرورية لصحة وقدرة الحاملة، وسلامة المفصل الفكي.
نموذج الفأر وراثيا الكولاجين متعددة (كما وصفها اتريا et al.) 8 أداة عظيمة لاستخدام لفهم التغيرات في التعبير الكولاجين لأنه يعبر عن جميع المتسلسلات في لجنة التنسيق الإداري. لإجراء تقييم متعمق النسيجي، تستخدم البقع النسيجي لدراسة ترسب مصفوفة، التمعدن، وتكاثر الخلايا، والمبرمج، فضلا عن التعبير البروتين في طبقات مختلفة من الخلية من لجنة التنسيق الإداري.
في هذه المخطوطة، غذائها وتحليلات شكلي تستخدم لتقييم التغيرات الخلوية والهيكلية في عظم لجنة التنسيق الإداري وسوبتشوندرال من اللقمة الفك السفلي من الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف أسلوب القياس الكمي خلية، لتحليل الصور النسيجي الفلورسنت ورسم الخرائط شرائح المجهر الخفيفة،. ويتضح أيضا المفصل ثابت ضاغطة الفكي تحميل الأسلوب، الذي يسبب التغييرات الخلوية ومورفولوجي في لجنة التنسيق الإداري وسوبتشوندرال العظام9، للتحقق من صحة أساليب عملنا.
يمكن استخدام الأساليب المذكورة هنا لتحديد شكلي وتغييرات نسيجية في اللقمة الفك السفلي والفك السفلي من القوارض أو لتحليل مناطق أخرى من endochondral التحجر ومورفولوجية الأنسجة غضاريف إضافية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت اللجنة على مؤسسات الرعاية الحيوانية من مركز الصحة في جامعة كونيتيكت جميع الإجراءات الحيوان.
1-تحميل المفصل الفكي ثابتة الضغط: الفم أجبرت مفتوحة
ملاحظة: استخدمت الفئران المعدلة وراثيا عمرها أربع الأسبوع إيواء الصحفيين الفلورسنت للكولاجين (Col2a1XCol10a1)، يرجى قدمها الدكتور ديفيد رو (جامعة كونيتيكت)، للتجارب الموصوفة في هذه المخطوطة (n = 8؛ 4 من الذكور و 4 من الإناث). يتم التعبير عن التحوير (الأزرق) Col2a1 السماوي في الخلايا في منطقة بريهايبرتروفيك من لجنة التنسيق الإداري، في حين Col10a1 الكرز الخلايا (أحمر) موجودة في منطقة الضخامي8 (الشكل 1). وقد تساوت الفئران إلى مجموعتين: 1) مجموعة المحملة، حيث تعرض الفئران للمفصل الفكي الثابتة ضاغطة تحميل (هو موضح في الخطوة 2) و 2) مجموعة عنصر التحكم، حيث تلقت الفئران دون أي تدخل.
الشكل 1. الممثل السهمي من اللقمة بالماوس مراسل الفلورسنت مزدوجة-الكولاجين (Col2a1XCol10a1)- شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- اختﻻق الينابيع أوسينجبيتا التيتانيوم سبيكة أرتشويريس (في بين 0.017 × 0.025) (الشكل 2أ).
- تخدير الحيوانات التجريبية بحقنه داخل خليط من الكيتامين (90 ملغ/كغ وزن الجسم) وإكسيلازيني (13 مغ/كغ وزن الجسم).
- افتح الفم للفئران برفق وإدراج الينابيع، الانخراط في الحلقات في القواطع فكي علوي والفك السفلي (الشكل 2ب وج).
- حمل ضاغطة تحميل المفصل الفكي الثابتة عن طريق الحفاظ على الينابيع في القواطع الفئران أنيسثيتيزيد حاء 1 كرر هذا الإجراء لمدة 5 أيام.
- حقن الفئران مع 5-اثنيل-2 '--ديوكسيوريديني (إيدو؛ 30 مغ/كغ وزن الجسم) إينترابيريتونيلي لخلية تحليل انتشار أيام 2 و 1 يوم قبل القتل الرحيم.
الرقم 2. ضاغطة تحميل المفصل الفكي ثابت: الحمى القلاعية أجبرت نموذج مفتوح. (أ) فصل الربيع ملفقة من بين 0.017 × 0.025 أرتشويري سبائك التيتانيوم بيتا. (ب) الماوس المحملة مع الربيع. (ج) الأشعة لتحميلها والفئران التحكم عرض الاختلافات في تحديد المواقع للفك السفلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
2-الفك السفلي تشريح والتثبيت
- في نقطة نهاية الإجراءات القسري-فتح الفم، euthanize الحيوانات التجريبية بطريقة معتمدة.
- تشريح في mandibles بقطع المرفق العضلات دون إلغاء غضروف اللقمة.
- ضع mandibles تنظيفها في الفورمالين 10% ح 24 للتثبيت.
تنبيه: الفورمالين مصدر إزعاج؛ ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
3-الأشعة السينية التصوير والقياسات شكلي
- مكان مانديبليس في وعاء مسطح (مثلاً، 55 مم × 16 مم طبق بيتري) وأخذ الصور الشعاعية العينات باستخدام نظام مجلس الوزراء بالأشعة سينية في 26 كيلو فولت 5 s.
ملاحظة: وضع شريط مقياس قبل حفظ الصور. - إجراء قياسات شكلي مانديبليس استخدام برنامج تحليل صورة (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: قبل إجراء أي قياسات، استخدام مقياس شريط الأشعة لتحديد الوحدة. تعد هذه الخطوة هامة لقياس الهياكل التشريحية بشكل صحيح. انقر فوق الزر "وحدة" (الشكل 3أ). - قم بتحديد النقاط التشريحية استخدام "علامة النمط 2" في برامج التصوير (الشكل 3ب). اتباع الطريقة الموضحة في هذه الورقة، قم بتحديد النقاط التالية (الشكل 3ب):
- حدد كونديليون (النقطة 1)، النقطة الأكثر الخلفي من اللقمة الفك السفلي؛
- حدد عملية القاطعة (النقطة 2)؛
- حدد أعمق نقطة في الشق سينية (النقطة 3)؛
- حدد أعمق نقطة في تقعر راموس الفك السفلي (النقطة 4)؛
- حدد النقطة الأكثر الأمامي من سطح مفصلي اللقمة (النقطة 5)؛ و
- حدد النقطة الأكثر الخلفي من سطح مفصلي اللقمة (النقطة 6).
- بعد تحديد النقاط التشريحية، إجراء شكلي القياسات باستخدام أداة "طول"، ولكن على طول رأسه اللقمة، استخدم الأداة "خط عمودي" من النقاط (3) و (4) (الشكل 3ج).
- قياس طول الفك السفلي، من كونديليون (1) لعملية القاطعة (2).
- قياس طول الرأس اللقمة-المسافة العمودية من كونديليون (1) إلى خط تتبع من أعمق نقطة في الشق سينية (3) إلى أعمق نقطة في التقعر من راموس الفك السفلي (4).
- قياس عرض الرأس اللقمة-المسافة من الأكثر عرفت النقطة الأكثر الخلفي من سطح مفصلي اللقمة (5-6).
- نسخ القياسات من قائمة "قياس" على الجانب الأيمن من الشاشة (الشكل 3ج).
الشكل 3 . تمثيل شكلي قياسات الفك السفلي. (أ) استخدام شريط المقياس الخاص الأشعة لتحديد الوحدة (دائري بشريط أحمر، مقياس: 10 ملم). (ب) تحديد النقاط التشريحية استخدام "علامة النمط 2" (دائري باللون الأحمر). 1) كونديليون؛ 2) القاطعة العملية؛ 3) أعمق نقطة في الشق سينية؛ 4) أعمق نقطة في التقعر من راموس الفك السفلي؛ 5) النقطة الأمامية معظم سطح مفصلي اللقمة؛ 6) نقطة الخلفي معظم سطح مفصلي اللقمة. شريط المقياس:(ج) إجراء قياسات 10 مم. "الطول" وأدوات "عمودي" (دائري باللون الأحمر). القياسات من النقطة 1 إلى 2: طول الفك السفلي؛ نقطة من 5 إلى 6: عرض اللقمة؛ خط عمودي من النقطة 1 إلى 4-3: طول الرأس اللقمة. حفظ قياسات من قائمة "القياس". شريط مقياس = 10 مم- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4-اللقمة التضمين
ملاحظة: بعد أخذ الصور الشعاعية، mandibles يمكن تضمينها ومقطوع للتحليل النسيجي.
- ضع مانديبليس أونديكالسيفيد (التي تم إصلاحها في الخطوة 2، 3) في السكروز 30% في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها قبل الدمج.
- تشريح أي الأنسجة اللينة الزائدة وقطع اللقمة الفك السفلي بعناية.
- من أجل بعض راتنج التضمين (ما يكفي لتغطية العينة) في قوالب البلاستيك القابل للصرف ووضع السطح الآنسي من اللقمة ضد قاعدة العفن، الموضع العينة موازية للجزء السفلي من القالب.
- إصلاح العينة في المكان الصحيح مع قطعة من الثلج الجاف.
- ملء القالب مع تضمين الراتنج ووضع القالب مع عينة الثابتة في البرد 2-الميثيل-غاز البوتان، التي يمكن أن تكون مبردة مسبقاً في ثلاجة-20 درجة مئوية أو-80 درجة مئوية أو في الثلج الجاف.
- تخزين العينات في-20 درجة مئوية أو في-80 درجة مئوية حتى تمزيقها.
5-اللقمة السهمي تمزيقها وإعداد الشرائح
- إنشاء المقاطع السهمي المجمدة من condyles (5-7 ميكرومتر) ونقل العينات إلى الشريحة باستخدام10،أسلوب نقل الشريط11.
- تلتزم الأقسام النسيجي نقله إلى الشريط باستخدام أسلوب الأشعة فوق البنفسجية10.
6-نسيجية تلطيخ والتصوير المجهري
ملاحظة: يتم تنفيذ معظم تلطيخ نسيجية كما هو موضح في المقطع النسيجي ورقة ديمينت et al10.
- لمسح خط الأساس، الخطوة الأولى الصورة ل Col2a1 و Col10a1 المتسلسلات، كما وصفها ديمينت et al10 .
- ضع كوفيرسليبس على أعلى الشرائح في والغليسيرول 30% وبرنامج تلفزيوني. تنفيذ خط الأساس التصوير أوفثيسيكتيونسويثا مجهر فلوري وعوامل التصفية المناسبة.
- أداء تلطيخ الفلورسنت طرطرات مقاومة حمض الفوسفاتيز (TRAP).
ملاحظة: يتم التعبير عن فخ من الخلايا المكونة للدم، بما في ذلك عظم ريسوربينج الخلايا، الآكلة12. والغرض من هذا وصمة عار تحليل لجنة التنسيق الإداري ويعيد البناء العظم سوبتشوندرال.- إزالة ساترة الشرائح التي نقع عليها في برنامج تلفزيوني. يغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 5 دقائق.
- إعداد فخ المخزن المؤقت 1 بتذويب خلات الصوديوم اللامائية (9.2 g) والصوديوم طرطرات ل مائي ثنائي هيدرات (11.4 ز) في 1 لتر ماء المقطر. ضبط درجة الحموضة إلى 4.2 مع حمض الخليك وتخزين المخزن المؤقت فخ 1 في 4 درجات مئوية.
- إعداد فخ العازلة 2 بتذويب طازجة نتريت الصوديوم (40 مغ) في 1 مل ماء المقطر.
- إعداد فخ الركازة المخزن المؤقت (قبل تلطيخ) عن طريق خلط 7.5 مل من المخزن المؤقت 1 و 150 ميليلتر من المخزن المؤقت 2. ينطبق هذا الحل (200 ميليلتر) لكل شريحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد فخ رد فعل المخزن المؤقت عن طريق خلط مل 1.840 من الركازة المخزن المؤقت وميليلتر 23 من الركازة الفلورسنت (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: سوبستراتيجينيراتيساييلووفلوريسسينتسيجنال الفلورية للنشاط فخ. - إزالة الزائدة فخ الركازة العازلة بلطف بيبيتينج الحل.
- احتضان الشرائح مع 200 ميليلتر من فخ رد فعل المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق تحت الأشعة فوق البنفسجية مصدر لمبة ضوء أسود.
- يغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 5 دقائق.
- ضع كوفيرسليبس على الشرائح في والغليسيرول 30% في برنامج تلفزيوني والقيام بالتصوير المجهري10.
- أداء تلطيخ انتشار الخلايا.
ملاحظة: في هذا التحليل، thymidine تعديل التناظرية 5-اثينيل-2 '--ديوكسيوريديني (إيدو) أدمجت في الحمض النووي المركبة حديثا: تقسيم الخلايا المسماة بصبغة فلورسنت.- بعد تصوير لفخ، إزالة كوفيرسليبس ويغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل. اتبع الخطوات من الطقم انتشار الخلية 5-اثينيل-2 '--ديوكسيوريديني وصمة عار المقاطع النسيجي.
- إعداد رد فعل المخزن المؤقت ميليلتر 1 X رد فعل المخزن المؤقت، 20 ميليلتر من CuSO4، ميليلتر 1.2 من صبغة الفلورسنت، و 50 ميليلتر من 1 X كوكتيل بإضافة 430 المضافة (إجمالي حجم 500 ميليلتر ما يكفي لشريحة واحدة).
ملاحظة: توصي الشركة المصنعة بإضافة المكونات بالترتيب الموضح هنا. - احتضان الشرائح مع الكوكتيل المعدة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
- يغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 5 دقائق.
- ضع كوفيرسليبس على أعلى الشرائح في والغليسيرول 30% في برنامج تلفزيوني مع 1:1,000 DAPI.
ملاحظة: DAPI (4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي) هو وصمة عار نووية نيون أزرق الذي يربط بين المناطق الغنية في الحمض النووي.
- القيام بتلوين أزرق تولويدين (السل).
ملاحظة: تلطيخ السل يكشف توزيع بروتيوغليكان في لجنة التنسيق الإداري.- أشطف إينديستيليدواتير الشرائح لإزالة كوفيرسليبس.
- بعد إزالة كوفيرسليبس، يغسل الشرائح في ماء مقطر ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل تماما لإزالة الأملاح من برنامج تلفزيوني.
- إعداد المخزن المؤقت العامل السل بجعل الحل (حل 28.4 غرام فوسفات الصوديوم مائي في 1 لتر ماء المقطر) وحل ب (حل ز 27.6 من فوسفات الصوديوم مونوباسيك في 1 لتر ماء المقطر). ميكس 94.7 مل من محلول A مع 5.3 مل الحل ديلوت باء هذا الحل 1:1 في الماء المقطر لجعل 200 مل من 0.1 متر يعمل المخزن المؤقت. تصحيح الرقم الهيدروجيني إلى 8.0 بإضافة هيدروكسيد الصوديوم حتى يتم إصلاح درجة الحموضة.
- إعداد المخزون 1% تيرابايت: مزيج ز 1 تيرابايت في 100 مل ماء المقطر.
- إعداد السل العامل الحل عن طريق خلط 40 مل من المخزن المؤقت للعامل 0.1 متر في 3 مل أسهم 1% تيرابايت.
- احتضان الشرائح في الحل العامل السل ل s 14-17.
ملاحظة: هو وصمة عار هذا الوقت جداً حساسة؛ فترة حضانة المرض قد تحتاج إلى تعديل لمنع أوفيرستينينج. - يغسل الشرائح في ماء مقطر ثلاث مرات لمدة 5 دقائق.
- ضع كوفيرسليبس على أعلى الشرائح في والغليسيرول 30% في ماء مقطر. أداء الخفيفة الميكروسكوب التصوير10.
ملاحظة: لا لا ساترة الشرائح الملون للسل في الجلسرين + برنامج تلفزيوني. برنامج تلفزيوني يغسل بها هذا النوع من وصمة عار.
7-الفلورسنت الكمي النسيجي
- إجراء النسيجي الكمي للصور الفلورية باستخدام برنامج تحليل صورة (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: هو المبدأ الأساسي للقياس الكمي النسيجي باستخدام هذا الأسلوب لتقسيم عدد البكسل الفلورسنت للفائدة على إجمالي عدد وحدات البكسل لمجال الاهتمام ومضاعفة عدد الحصول على 100، أسفر عن نسبة مئوية من الإيجابية بكسل داخل تلك المنطقة. - إجراء التحديد الكمي للتعبير Col10a1 في لجنة التنسيق الإداري لأقسام condyles السهمي.
- عند التحديد الكمي لجميع أنواع الخلايا والبقع باستخدام هذا الأسلوب، حدد المساحة التي يمكن تحديدها كمياً. افتح الصور النسيجي في برنامج تحليل صورة، وحدد المجال باستخدام "ﻻسو أداة (ل)" (الشكل 4أ). لتحليل ووصف هنا، حدد منطقة لجنة التنسيق الإداري فقط؛ بعد تحديد المنطقة، سيظهر إجمالي عدد وحدات البكسل في مربع "المدرج التكراري" على الشاشة للبرنامج (الشكل 4أ). حفظ عدد وحدات البكسل في مجال الاهتمام.
- حدد بكسل Col10a1 الحمراء باستخدام أداة أخذ العينات. انقر فوق "تحديد" في أعلى اللوحة ثم "نطاق اللون". انقر فوق "أداة الشافطة،" حدد العينة اللون بكسل الاهتمام في الصورة، وانقر فوق "موافق". جميع المجالات الإيجابية للون البكسل المختار سيتم تحديده (الشكل 4ب). نسخ عدد البكسل الفلورسنت (كما هو موضح في مربع "المدرج التكراري" من الشاشة) ولصقها في جدول البيانات أو البرامج الإحصائية للتحليل.
- تقسيم عدد البكسل الفلورسنت على عدد وحدات البكسل لمجال الاهتمام وضرب هذا الرقم 100: نيون بكسل/بكسل في مجال اهتمام * 100.
ملاحظة: يمكن تحديده كمياً أي نوع آخر من الخلايا، مثل Col2a1 الأزرق، مع هذا الأسلوب نفسه، ولكن يجب أن يكون محدداً بكسل زرقاء بدلاً من بكسل Col10a1 الأحمر.
الشكل 4 . تمثيل للتحوير الكمي Col10a1. (أ) تحديد مجال الاهتمام باستخدام "أداة ﻻسو" (L). بالنسبة للمناعة Col10a1 الخلايا، حدد غضروف الفك السفلي كله. حفظ عدد البكسل من مربع "المدرج التكراري". (ب) تحديد بكسل الاهتمام، في هذه الحالة، بكسل Col10a1 نيون أحمر. علما أن سوف يتم تحديده فقط بكسل الأحمر ضمن مجال الاهتمام. حفظ عدد البكسل حمراء من مربع "المدرج التكراري". شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- إجراء التحديد الكمي لنشاط فخ في عظم لجنة التنسيق الإداري وسوبتشوندرال.
- اتبع الإجراء الموضح في الخطوة 8، 2، ولكن بدلاً من تحديد مجال التنسيق الإداري فقط، حدد منطقة العظام الغضروف وسوبتشوندرال (الشكل 5ألف).
- لتحليل النشاط فخ، حدد بكسل الصفراء التي تم إنشاؤها بواسطة الركيزة ELF97، كما هو موضح في الخطوة 8.2.2 (الشكل 5ب)؛ نسخ عدد البكسل الإيجابية؛ ولصقها في جدول البيانات أو البرامج الإحصائية للتحليل.
- الحصول على النسبة المئوية لفخ المصابات بكسل بتقسيم عدد البكسل الأصفر بإجمالي عدد وحدات البكسل في منطقة العظم سوبتشوندرال وضرب 100.
الشكل 5 . تمثيل الفلورسنت فخ الكمي. (أ) تحديد مجال الاهتمام (الفك السفلي عظم الغضروف وسوبتشوندرال) وحفظ عدد وحدات البكسل لهذه المنطقة. (ب) تحديد بكسل نيون الصفراء، الذي يمثل النشاط فخ. لاحظ أن تحديد فقط فخ المصابات بكسل. حفظ عدد البكسل المحدد. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- إجراء التقدير الكمي للخلايا إيجابية إيدو.
- هي كونتيرستاينيد الملطخة إيدو الشرائح مع DAPI، وحدد ذلك بدلاً من حساب إجمالي عدد وحدات البكسل في منطقة اهتمام، بكسل DAPI الإيجابية لحساب النسبة المئوية للايجابية إيدو بكسل. تحديد مجال الاهتمام كما هو موضح في الخطوة 8، 2، ولكن لا تقم بحفظ العدد من بكسل. حدد بكسل DAPI الأزرق كلون العينة، كما هو موضح في الخطوة 8.2.2؛ نسخ عدد البكسل DAPI الإيجابية (الشكل 6ألف)؛ ولصقها في جدول البيانات أو البرامج الإحصائية للتحليل.
- بعد ذلك، حدد بكسل إيجابية إيدو (بكسل نيون أصفر) وحفظ عدد وحدات البكسل في مربع "المدرج التكراري" (الشكل 6ب).
- لحساب النسبة المئوية بكسل إيدو بتقسيم عدد البكسل إيدو مصابات بعدد البكسل DAPI-إيجابية وضرب عدد الحصول على 100.
الرقم 6 . التمثيل الكمي إيدو. (أ) حدد منطقة التكاثري (الطبقة الخارجية الغضروف) لجنة التنسيق الإداري. حدد DAPI المصابات بكسل وحفظ عدد البكسل. (ب) حدد إيدو المصابات بكسل (أصفر الفلورسنت) وحفظ عدد البكسل. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
8-التحديد الكمي لسمك الغضاريف وتوزيع بروتيوغليكان
- تحليل سمك الغضاريف (تعيين المسافة) ومنطقة الملون أزرق تولويدين باستخدام البرمجيات الصورة ديجيميزير.
ملاحظة: استخدام شريط المقياس في صورة نسيجية لتحديد الوحدة (الشكل 7أ). - القيام بقياس مسافة رسم خرائط.
ملاحظة: سوف توفر خرائط قياس المسافة سمك الغضروف في اللقمة الفك السفلي. في الأسلوب الموصوفة هنا، يتم تحديد خمس مناطق من لجنة التنسيق الإداري، إعطاء متوسط سمك الشاملة للجنة التنسيق الإداري. قد يختار الباحث لقياس ثلاث مناطق مختلفة، أو حتى منطقة واحدة في منتصف لجنة التنسيق الإداري.- باستخدام أداة "الطول"، قياس طول الغضروف من السطح الخارجي لنهاية تولويدين الملون الأزرق منطقة (الشكل 7ب) في خمس مناطق، أو في العديد من المواقع المفضلة.
- نسخ قياسات الطول من قائمة "القياس".
ملاحظة: يوفر البرنامج أيضا متوسط القياسات (الشكل 7ب).
- قياس المنطقة الملون أزرق تولويدين.
ملاحظة: في قياس منطقة الملون أزرق تولويدين، منطقة بروتيوغليكان في لجنة التنسيق الإداري سيتم الحصول على.- حدد أداة "المنطقة" وكفاف منطقة الملون أزرق تولويدين (الشكل 7ج).
- نسخ قياسات المجال من قائمة "القياس".
الشكل 7 : تمثيل بروتيوغليكان التوزيع الكمي. (أ) استخدام شريط مقياس الصورة نسيجية لتحديد الوحدة عن طريق النقر فوق الزر "وحدة" (دائري باللون الأحمر للوحدة المحددة: 500 ميكرومتر). (ب) قياس سمك الغضروف في مواقع مختلفة باستخدام أداة "طول" (دائري باللون الأحمر). حفظ القياسات من قائمة "القياس" في اللوحة اليسرى العليا. كما يوفر البرنامج "الإحصاءات" في اللوحة اليسرى السفلي، حيث يعني و SD من القياسات يمكن الحصول عليها مباشرة. (ج) قياس المنطقة الملون أزرق تولويدين باستخدام أداة "المنطقة" (دائري باللون الأحمر). ضع دائرة حول مجال الاهتمام وحفظ القياس من قائمة "القياس". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إحصاءات وصفية أجريت لدراسة توزيع القياسات شكلي (طول الفك السفلي، طول اللقمة، عرض اللقمة) والتحليل النسيجي. وقورنت النتائج بين مجموعة المحمل (أي، الفئران تعرض لتحميل ضاغطة مع الربيع التيتانيوم بيتا) والسيطرة على المجموعة (أي، مطابقة مكافحة الفئران التي لم تتلق أي إجراء). تحددها فروق معتد بها إحصائيا بين وسائل اختبار t مزاوج، وقيمة p من < يعتبر 0.05 يعتد به إحصائيا.
وأجريت قياسات شكلي، كما هو موضح في الخطوة 4، و الرقم 3، في mandibles لتحميل ومجموعات التحكم. مجموعة تحميل عرض مع طول الفك السفلي زيادة كبيرة (تحميل: ± 16.62 0.23 مم مقابل التحكم: 16.21 ± 0.2 مم؛ ف < 0.05) وطول الرأس اللقمة (تحميل: 4.6 ملم، SD 0.08 مم مقابل التحكم: 4.4 مم؛ SD 0.06؛ ف < 0.05) بالمقارنة مع مجموعة المراقبة. ومع ذلك، كان هناك لا اختلاف كبير في العرض اللقمة بين المجموعات (تحميل: 3.06 ± 0.12 ملم مقابل التحكم: 2.9 ± 0.11; p = 0.09).
التحديد الكمي لتوزيع الكولاجين باستخدام الطريقة الموضحة في الخطوة 8 كشفت إلى حد كبير زيادة التعبير Col10a1 في لجنة التنسيق الإداري condyles الفريق محملة بالمقارنة مع عنصر التحكم (تحميل: 21% ± 4.46% مقابل التحكم: 7.50% ± 2.03%; p < 0.005؛ الشكل 8 ألف ودال). من ناحية أخرى، كان هناك لا إحصائيا الفرق في التعبير Col2a1 بين تحميل والتحكم في مجموعات (تحميل: 4.85% ± 1.95% مقابل التحكم: 2.92% ± 1.89%; p = 0.13؛ الشكل 8 ) (ه). وبالإضافة إلى ذلك، أظهر تحليل النشاط فخ زيادة إيجابية فخ المناطق في منطقة سوبتشوندرال condyles الفئران تم تحميلها (تحميل: 5.28% ± 1.45% مقابل التحكم: 2.41% ± 1.39%; p < 0.05؛ الشكل 8 ج وو.) وبالمثل، لاحظنا انتشار الخلايا زيادة، كما يتضح من زيادة إيدو-إيجابية الخلايا في لجنة التنسيق الإداري الفريق محملة بالمقارنة مع الفئران التحكم (تحميل: 6.23% ± 1.89% مقابل التحكم: 1.90 ± 1.03%; p < 0.05؛ الرقم 9 ألف وجيم).
وكان كمياً توزيع بروتيوغليكان في لجنة التنسيق الإداري لتحميلها ومكافحة الفئران بتقييم منطقة تولويدين ملطخة باللون الأزرق وخريطة المسافة، كما هو موضح في الخطوة رقم 9 و رقم 7. وجدنا تعيين المسافة زيادة كبيرة في لجنة التنسيق الإداري condyles الفريق محملة بالمقارنة مع التحكم (تحميل: ميكرومتر ± 4.11 مكم 210.22 مقابل التحكم: 187.36 مكم ± 8.64 ميكرومتر؛ ف < 0.005؛ الرقم 9 ب ود.) بيد المنطقة الملون بروتيوغليكان لم يكن مختلفاً إحصائيا بين تحميل والتحكم في مجموعات (تحميل: 203,897.93 مكم2 ± 10,171.00 مكم2 مقابل التحكم: مكم 202,875.09 ± 33,419.092 ميكرومتر2; p = 0.94؛ الرقم 9 ) (ه)
الشكل 8 : نتائج الممثل: (أ) الخلايا Col10a1-الإيجابية في الفروع السهمي من لجنة التنسيق الإداري condyles من التحكم وتحميل الفئران. وهناك زيادة في إعداد الخلايا Col10a1-الإيجابية في تحميل المجموعة (د). (ب) Col2a1-إيجابية الخلايا في التحكم وتحميل الفئران. لا يوجد فرق في الخلايا Col2a1 الإيجابية بين المجموعات (ه). (ج) تعويض تلطيخ في condyles التحكم وتحميل الفئران. زيادة النشاط الفخ في المجموعة محملة بالمقارنة مع التحكم (F). رسوم بيانية (د-و) تمثل وسائل ± SD ل n = 4 كل مجموعة- * * الاختلاف بين السيطرة والمجموعات المحملة (ف < 0.005). شريط المقياس = 200µm- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 9:نتائج الممثل: (أ) إيدو تلطيخ في condyles التحكم والفئران المحملة. تكاثر الخلايا زيادة في تحميل المجموعة، كما تمثله إيدو مصابات بزيادة الخلايا (ج). (ب) تولويدين الأزرق تلطيخ في condyles التحكم وتحميل الفئران. زيادة سمك الغضاريف في الفئران تم تحميلها, كما هو موضح بالخرائط زيادة نصف القطر في المجموعة التجريبية (د). لا يوجد فرق في المنطقة الملون بروتيوغليكان بين عنصر التحكم وتحميل مجموعات (ه). رسوم بيانية (ج-ه) تمثل وسائل ± SD ل n = 4 كل مجموعة- * * الاختلاف بين السيطرة والمجموعات المحملة (ف < 0.005). شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ووصف هذه المخطوطة أساليب لقياس شكلي والتحليل الخلوي مورين condyles الفك السفلي و mandibles. يمكن أيضا استخدام القياسات شكلي الشعاعي لتحليل العظام الأخرى من الحيوانات التجريبية الصغيرة. وباﻹضافة إلى ذلك، تحليل الخلوية (خلية القياس الكمي وتعيين المسافة الغضروف) لا تقتصر على اللقمة الفك السفلي القوارض، ولكن يمكن استخدامها لتحديد حجم مقاطع نسيجية لانسجة عديدة.
النماذج المعدلة وراثيا الماوس معربا عن الصحفيين الفلورسنت أدوات ممتازة فهم التغيرات في التعبير الجيني بصريا. الطراز الماوس مراسل الفلورسنت مزدوجة-الكولاجين (Col2a1XCol10a1) المستخدمة في هذا التقرير مناسبة خاصة لدراسة لجنة التنسيق الإداري، منذ المتسلسلات يتم التعبير عنها في منطقة بريهايبرتروفيك والضخامي من لجنة التنسيق الإداري حتى أن توزيع الكولاجين يمكن تقييمها. إذا لم يكن لدى الباحث الوصول إلى نموذج الفأر وراثيا معربا عن الصحفيين الفلورسنت، يمكن استخدام أساليب أخرى لتحليل التعبير البروتين النسيجي، مثل الفلورة،.
للقياسات شكلي، خطوة حاسمة قبل التقاط صور الأشعة مجلس الوزراء لإزالة جميع الأنسجة الرخوة للفك السفلي أو من العظام ليتم تحليلها. يمكن أن تخفي العضلات المفرطة أو الأنسجة اللينة التي تعلق على العظام القياسات الحقيقية للهياكل. من المهم أن تكون على علم قيود نظام الأشعة مجلس الوزراء. مثل كل الأشعة السينية، تمثيل ثنائي الأبعاد لهيكل ثلاثي الأبعاد، والتداخل بين الهياكل، والقطع الأثرية ينبغي أن يفسر بعناية. وبالإضافة إلى ذلك، تحديد المواقع من العظام في مجلس الوزراء الشعاعي ينبغي أن تكون متسقة.
التحديد الكمي الخلوية عن طريق العد عدد البكسل إيجابية طريقة فعالة للقياس الكمي النسيجي في منطقة الغنية بالخلية مثل لجنة التنسيق الإداري، ولكن الحد من هذا النهج أنه لا يوفر العدد الدقيق للخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لأنه يقد فقط بكسل محدد، من المستحسن لتحديد كافة الصور من اهتمام باستخدام نفس "عينات" بكسل لتجنب التحديد الكمي لوحدات البكسل كثافات مختلفة عند تحليل الصور المختلفة.
قطعة عام المشورة عند التحديد الكمي للمقاطع النسيجي تحليل عدة مقاطع المسلسل لكل عينة (في هذه المخطوطة، وجرى تحليل ثلاثة مقاطع المسلسل لكل اللقمة)، حيث عادة ما يلاحظ الاختلافات داخل كل عينة.
المنهجية المذكورة في تجاربنا بسيطة وسهلة الاستخدام، ويمكن استخدامها في أي دراسة الأنسجة غضاريف في المراسل التي تستخدم الفئران. مع المنهجية الحالية، فإنه من الممكن تصور الخلايا التي ملطخة لفخ (Col2a1 أو Col10a1) أو إيدو (Col1a1 أو Col2a1) بتصور التعريب المشارك من الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفين قد لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
الكتاب يود أن يشكر الدكتور ديفيد رو يرجى توفير الفئران المحورة وراثيا وتشن لي لمساعدة النسيجي.
وأيد البحث عنها في هذا المنشور من المعهد الوطني لطب الأسنان والجمجمة البحثية "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة رقم K08DE025914، والرابطة الأمريكية لمؤسسة "تقويم الأسنان" إلى ياداف سوميت.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MX20 Radiography System | Faxitron X-Ray LLC | ||
| Digimizer Image software | MedCalc Software | ||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Manual microscope Axio Imager Z1 | Carl Zeiss | 208562 | |
| yellow fluorescent protein filter - EYFP | Chroma Technology Corp | 49003 | |
| cyan fluorescent protein filter - ECFP | Chroma Technology Corp | 49001 | |
| red fluoresecent protein filter - Cy5 | Chroma Technology Corp | 49009 | |
| sodium acetate anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
| sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ELF97 substrate | Thermo Fisher Scientific | E6600 | |
| ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit | Life Technologies | C10339 | includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Scientific | D1306 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems Incorporated | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Research Products International | P32080-100T | |
| CNA Beta III Nickel-Free Archwire | Ortho Organizers, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. |
References
- LeResche, L. Epidemiology of Temporomandibular Disorders: Implications for the Investigation of Etiologic Factors. Crit Rev Oral Biol Med. 8 (3), 291-305 (1997).
- Chen, J., et al. Altered functional loading causes differential effects in the subchondral bone and condylar cartilage in the temporomandibular joint from young mice. Osteoarthr Cartil. 17 (3), 354-361 (2009).
- Pirttiniemi, P., Kantomaa, T., Sorsa, T. Effect of decreased loading on the metabolic activity of the mandibular condylar cartilage in the rat. Eur J Orthod. 26 (1), 1-5 (2004).
- Chavan, S. J., Bhad, W. A., Doshi, U. H. Comparison of temporomandibular joint changes in Twin Block and Bionator appliance therapy: a magnetic resonance imaging study. Prog Orthod. 15 (57), (2014).
- Dutra, E. H., et al. Cellular and Matrix Response of the Mandibular Condylar Cartilage to Botulinum Toxin. PLoS ONE. 11 (10), 0164599 (2016).
- Benjamin, M., Ralphs, J. R. Biology of fibrocartilage cells. Int Rev Cytol. 233, 1-45 (2004).
- Shen, G., Darendeliler, M. A. The Adaptive Remodeling of Condylar Cartilage- A Transition from Chondrogenesis to Osteogenesis. J Dent Res. 84 (8), 691-699 (2005).
- Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
- Kaul, R., et al. The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage. PLoS ONE. 11 (7), 0160121 (2016).
- Dyment, N. A., et al. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J Vis Exp. , e54468 (2016).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).
- Hayman, A. R. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).
