Summary
Dit manuscript presenteert methoden voor het analyseren van Morfometrische en cellulaire veranderingen binnen de mandibulaire condyle van knaagdieren.
Abstract
Het kaakgewricht (TMJ)-gewricht heeft de capaciteit aan te passen aan externe prikkels, en laden van wijzigingen kan invloed hebben op de positie van condyles, alsook de structurele en cellulaire componenten van de mandibulaire Condylaire kraakbeen (MCC). Dit manuscript wordt beschreven methoden voor het analyseren van deze veranderingen en een methode voor het wijzigen van het laden van de TMJ in muizen (dat wil zeggen, druksterkte statische TMJ laden). De structurele evaluatie geïllustreerd hier is een eenvoudige Morfometrische-aanpak die gebruikt de Digimizer-software en wordt uitgevoerd in de röntgenfoto's van kleine beenderen. Bovendien, de analyse van cellulaire verandert leiden tot wijzigingen in collageen expressie, bot remodelleren, celdeling en Proteoglycaan distributie in het MCC wordt beschreven. De kwantificering van deze wijzigingen in histologische afdelingen - door het tellen van de positieve fluorescerende pixels met behulp van software en het meten van de afstand toewijzing image & gekleurd gebied met Digimizer - wordt ook aangetoond. De methoden die hier worden weergegeven zijn niet beperkt tot de lymfkliertest TMJ, maar kon worden gebruikt op de extra botten van kleine proefdieren en in andere regio's van endochondral ossificatie.
Introduction
Het TMJ is een unieke dragende gezamenlijke gelegen craniofaciale regio en van fibrokraakbeen wordt gevormd. De MCC van de TMJ is essentieel voor gemeenschappelijke functie, met inbegrip van de onbelemmerde kaak verkeer tijdens het spreken en masticating, maar het wordt meestal beïnvloed door degeneratieve ziekten, met inbegrip van artrose1. Het TMJ heeft de capaciteit aan te passen aan externe stimuli en laden, wijzigingen leiden tot structurele en cellulaire veranderingen aan de componenten van de MCC2,3,4,5. De dragende eigenschappen van de MCC kunnen worden verklaard door de interactie tussen de onderdelen daarvan, met inbegrip van water, het collageen-netwerk, en de dichtbevolkte verpakt proteoglycans. De MCC heeft vier verschillende cellulaire zones die uitdrukking geven aan verschillende soorten collageen en niet-collageen eiwitten: 1) de oppervlakkige of articulaire zone; 2) de proliferatieve zone, samengesteld uit ongedifferentieerde mesenchymale cellen en die reageert op het laden van eisen; 3) de prehypertrophic zone, samengesteld uit volwassen chondrocyten uiting van collageen type 2; en 4) de hypertrofische zone, de regio waar de hypertrofische chondrocyten uiting van collageen type 10 sterven en het ondergaan van verkalking. De niet-gemineraliseerde regio is rijk aan proteoglycans waarmee de weerstand tegen druksterkte krachten6.
Er is continu mineralisatie in de hypertrofische zone van de MCC, waar de overgang van chondrogenesis naar osteogenesis optreedt, de robuuste minerale structuur van het subchondrale bot van de mandibulaire condyle7te garanderen. Cellulaire veranderingen in de unmineralized en gemineraliseerde gebieden uiteindelijk leiden tot morfologische en structurele veranderingen in de mandibulaire condyle en onderkaak. Onderhoud van de homeostase van alle cellulaire regio's van de MCC en de mineralisatie van de subchondrale gedeelte zijn essentieel voor de gezondheid, de draagkracht en de integriteit van de TMJ.
De meerdere collageen transgeen muismodel (zoals beschreven door Utreja et al.) 8 is een geweldig hulpmiddel gebruiken om wijzigingen in collageen expressie begrijpen omdat alle transgenen zijn uitgedrukt in de MCC. Voor een diepgaande histologische evaluatie, worden histologisch vlekken gebruikt om te studeren matrix depositie, mineralisatie, celproliferatie, en apoptose, evenals eiwit expressie in de cel van de verschillende lagen van de MCC.
In dit worden manuscript, histologisch en Morfometrische analyses gebruikt voor het evalueren van de cellulaire en structurele veranderingen in het MCC en subchondrale bot van de mandibulaire condyle van muizen. Daarnaast wordt een cel kwantificering, voor het analyseren van fluorescerende histologische beelden en voor het toewijzen van lichte Microscoop dia's, beschreven. De druksterkte statische TMJ laden methode, waardoor cellulaire en morfologische veranderingen op het MCC en subchondrale bot9, wordt ook geïllustreerd voor het valideren van onze methoden.
De hier beschreven methoden kunnen worden gebruikt om te bepalen Morfometrische en histologische veranderingen in de mandibulaire condyle en onderkaak van knaagdieren of andere regio's in endochondral ossificatie en de morfologie van extra gemineraliseerde weefsels te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures afgekeurd op het institutionele dierenverzorgers Comité van het gezondheidscentrum van de Universiteit van Connecticut.
1. druksterkte statische TMJ laden: Mond opengebroken
Opmerking: Transgene muizen vier weken oude herbergen fluorescerende verslaggevers voor collageen (Col2a1XCol10a1), beschikbaar gesteld door Dr David Rowe (Universiteit van Connecticut), werden gebruikt voor de experimenten beschreven in dit manuscript (n = 8; 4 reutjes en 4 teefjes). Het Col2a1 cyaan (blauw) transgenic wordt uitgedrukt in cellen in de prehypertrophic zone van de MCC, terwijl de Col10a1 kersen (rood) cellen aanwezig in de hypertrofische region8 (Figuur 1). Muizen werden verdeeld in twee groepen: 1) de geladen groep, waar muizen werden onderworpen aan druksterkte statische TMJ laden (beschreven in stap 2) en 2) de controlegroep, waar muizen geen interventie ontvangen.
Figuur 1. Vertegenwoordiger Sagittaal van de condyle van een dubbel-collageen fluorescerende verslaggever muis (Col2a1XCol10a1). Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Fabriceren springs usingbeta titanium legering archwires (0,017 x 0,025 inch)(Figuur 2).
- Anesthetize van de proefdieren door een intraperitoneale injectie van een mengsel van ketamine (90 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazine (13 mg/kg lichaamsgewicht).
- Voorzichtig open de monding van de muizen en plaats van de veren, boeiende de lussen in de keelholte en mandibulaire snijtanden (Figuur 2B en C).
- Druksterkte statische TMJ laden veroorzaken doordat de veren in de snijtanden van de narcose muizen voor 1 h. Herhaal deze procedure voor 5 dagen.
- Injecteer de muizen met 5-ethnyl-2'-deoxyuridine (EdU; 30 mg/kg lichaamsgewicht) intraperitoneally voor cel proliferatie analyse 2 dagen en 1 dag vóór de euthanasie.
Figuur 2. Druksterkte statische TMJ laden: mond gedwongen open model. (A) voorjaar vervaardigd van 0.017 x 0,025 bèta titanium legering archwire. (B) geladen muis met veer. (C) radiografie van geladen en controle muizen met verschillen in de positionering van de onderkaak. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
2. de onderkaak dissectie en fixatie
- Aan het eindpunt van de procedures van gedwongen-open mond, euthanaseren de proefdieren door een erkende methode.
- Ontleden de kaken door het snijden van de gespierde bijlage zonder schaven van het kraakbeen van de condyle.
- Plaats de schoongemaakte kaken in 10% formaline voor 24u voor fixatie.
Let op: Formaline is een irriterend; Draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen.
3. X-ray Imaging en Morfometrische metingen
- Plaats de kaken in een platte container (bijvoorbeeld een 55 mm x 16 mm petrischaal) en het nemen van röntgenfoto's van de monsters met behulp van een kabinet röntgensysteem op een 26 kV voor 5 s.
Opmerking: Plaats een bar van de schaal voor het opslaan van de afbeeldingen. - Uitvoeren van metingen van de Morfometrische van de kaken met behulp van de software van de analyse van een afbeelding (Zie de Tabel van de materialen).
Opmerking: Voordat u enige metingen uitvoert, via de schaal balk op de radiografie bepalen van de eenheid. Deze stap is belangrijk voor het goed meten van de anatomische structuren. Klik op de knop "Eenheid" (Figuur 3A). - Selecteer de anatomische punten met behulp van "stijl van de markeringen 2" in de denkbaar software (Figuur 3B). Volg de methode die wordt beschreven in dit document en selecteert u de volgende punten (Figuur 3B):
- Selecteer de condylion (punt 1), het meest achterste punt van de mandibulaire condyle;
- Selecteer de snijtand proces (punt 2);
- Selecteer het diepste punt bij de sigmoid inkeping (punt 3);
- Selecteer het diepste punt in de uitholling van de mandibulaire ramus (punt 4);
- Selecteer de meest voorste punt van de Condylaire gewrichtsoppervlak (punt 5); en
- Selecteer de meest posterieure punt van het Condylaire gewrichtsoppervlak (punt 6).
- Na het selecteren van de anatomische punten, Morfometrische metingen met behulp van de "lengte" tool uitvoeren, maar voor de condyle hoofd lengte, gebruik de "loodrecht" lijn van punten (3) en (4) (Figuur 3C).
- Meet de lengte van de mandibulaire, vanaf de condylion (1) aan de snijtand proces (2).
- Meet de condyle hoofd lengte - de loodrechte afstand van het condylion (1) op een lijn die getraceerd vanaf het diepste punt bij de sigmoid inkeping (3) naar het diepste punt in de uitholling van de mandibulaire ramus (4).
- De hoofd breedte van het condyle - de afstand van de meeste anterior to de meest posterieure punt van het Condylaire gewrichtsoppervlak (5-6) te meten.
- Kopieer de metingen van de "lijst" aan de rechterkant van het scherm (Figuur 3C).
Figuur 3 . Vertegenwoordiging van metingen van de Morfometrische van de onderkaak. (A) de bar van de schaal van de radiografie gebruiken om te bepalen van de eenheid (omcirkeld in het rood, schaal bar: 10 mm). (B) Selecteer de anatomische punten met behulp van "stijl van de markeringen 2" (omcirkeld in het rood). 1) Condylion; 2) snijtand proces; 3) diepste punt bij de sigmoid inkeping; 4) diepste punt in de uitholling van de mandibulaire ramus; 5) meest voorste punt van de Condylaire gewrichtsoppervlak; 6) meest achterste punt van het Condylaire gewrichtsoppervlak. Schaal bar: 10 mm.(C) uitvoeren metingen met de "lengte" en "loodrecht" hulpmiddelen (omcirkeld in het rood). Metingen vanaf punt 1 tot en met 2: mandibulaire lengte; vanaf punt 5 tot en met 6: Condylaire breedte; loodrecht uit punt 1 tot en met 4 - 3: Condylaire hoofd lengte. Opslaan van metingen van de "meting lijst." Schaal bar = 10 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
4. condyle insluiten
Opmerking: Na de radiografische opnamen, de kaken kunnen worden ingesloten en gesegmenteerd histologische p.a..
- Plaats undecalcified kaken (die zijn opgelost in stap 2.3) in 30% sacharose in PBS's nachts voordat insluiten.
- Eventuele overtollige weke ontleden en zorgvuldig snijd de mandibulaire condyle.
- Giet wat inbedding hars (genoeg ter dekking van het monster) in wegwerp plastic mallen en plaats van het mediale oppervlak van de condyle tegen de base van de schimmel, positionering van het monster parallel aan de onderkant van de schimmel.
- Fix het model op de juiste plaats met een stuk droog ijs.
- Vul de mal met hars inbedding en plaats de mal met vaste monster in koude 2-methyl-butaan, die kunnen vooraf gekoeld in een vriezer van-20 ° C of -80 ° C of in droog ijs.
- Bewaren de exemplaren bij-20 ° C of bij-80 ° C tot segmenteren.
5. condyle Sagittaal segmenteren en prepareren van objectglaasjes
- Bevroren Sagittaal secties van het condyles (5-7 µm) en de monsters naar de dia met behulp van de tape overdracht methode10,11te brengen.
- Houden de histologische secties overgedragen aan de tape met behulp van de UV-uithardende methode10.
6. histologische kleuring en microscopische beeldvorming
Opmerking: De meeste van de histologische kleuring wordt uitgevoerd zoals beschreven in de histologische sectie van het papier door Dyment et al.10.
- Voor het scannen van de basislijn, is de eerste stap het beeld voor de Col2a1 en Col10a1 transgenen, zoals beschreven door Dyment et al.10 .
- Plaats coverslips op de top van de dia's in de 30% glycerol en PBS. Het uitvoeren van basislijn imaging ofthesectionswitha fluorescente microscoop en passende filters.
- Fluorescerende tartraat-resistente zure fosfatase (TRAP) kleuring uitvoeren
Opmerking: TRAP wordt uitgedrukt door hematopoietische cellen, met inbegrip van het bot resorbeerbare cellen, osteoclasten12. Het doel van deze vlek wil analyseren MCC en subchondrale bot remodeling.- Verwijder het dekglaasje aan van de dia's door inweken hen in PBS. De dia's in PBS wassen drie keer voor elke 5 min.
- Bereiden TRAP buffer 1 door oplossing van natriumacetaat watervrij (9.2 g) en natrium L-tartraat dibasische (dihydraat) p.a. (11.4 g) in 1 L gedestilleerd water. Breng de pH op 4.2 met azijnzuur en opslaan van de buffer van de TRAP 1 bij 4 ° C.
- Bereiden TRAP buffer 2 door vers Natriumnitriet (40 mg) in 1 mL gedestilleerd water.
- Bereid TRAP substraat buffer (net voor de kleuring) door het mengen van 7,5 mL buffer 1 en 150 µL van buffer 2. Deze oplossing (200 µL) toepassen op elke dia gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Bereid TRAP reactie buffer door het mengen van 1.840 milliliters substraat buffer en 23 µL van fluorescerende coating (Zie de Tabel van de materialen).
Opmerking: De fluorescerende substrategeneratesayellowfluorescentsignal voor val activiteit. - Verwijder overtollige TRAP substraat buffer door zachtjes pipetteren de oplossing.
- Incubeer de dia's met 200 µL van TRAP reactie buffer voor 5 min onder een UV-bron lamp zwart licht.
- De dia's in PBS wassen drie keer voor elke 5 min.
- Coverslips plaats op de dia's in 30% glycerol in PBS en microscopische beeldvorming10uit te voeren.
- Cel proliferatie kleuring uitvoeren
Opmerking: In deze test, de gemodificeerde thymidine analoge 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) is opgenomen in nieuw gesynthetiseerd DNA: scheidslijn cellen worden aangeduid met een fluorescente kleurstof.- Na imaging voor OVERVULLING, verwijderen van de coverslips en wassen van de dia's in PBS drie keer voor elke 5 min. Volg de stappen in de 5-ethynyl-2'-deoxyuridine cel proliferatie kit om de histologische secties vlek.
- Een reactie voor te bereiden door het toevoegen van 430 cocktail µL van 1 X reactie buffer, 20 µL van CuSO4, 1.2 µL van fluorescente kleurstof en 50 µL van 1 X buffer additief (een totaal volume van 500 µL is genoeg voor één dia).
Opmerking: De fabrikant raadt u aan de ingrediënten in de volgorde zoals hier beschreven. - Incubeer de dia's met de bereide cocktails gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
- De dia's in PBS wassen drie keer voor elke 5 min.
- Coverslips op de top van de dia's in 30% glycerol in PBS met 1:1,000 DAPI plaatsen.
Opmerking: DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) is een blauwe fluorescerende nucleaire vlek dat zich aan de AT-rijke regio's in DNA bindt.
- Uitvoeren toluïdine blauw (TB) kleuring.
Opmerking: TB kleuring onthult de Proteoglycaan distributie op de MCC.- Spoel de indistilledwater van de dia's als u wilt verwijderen van de coverslips.
- Wassen na het verwijderen van de coverslips, de dia's in gedistilleerd water drie keer, gedurende 5 minuten elk om de zouten van de PBS volledig te verwijderen.
- Bereiden van TB werkende buffer doordat oplossing een (Los 28.4 g natriumfosfaat dibasische in 1 L gedestilleerd water) en oplossing B (Los 27.6 g natriumfosfaat monobasisch in 1 L gedestilleerd water). Mix 94,7 mL van oplossing A met 5.3 mL van oplossing B. Dilute deze oplossing 1:1 in gedistilleerd water om 200 mL 0,1 M werken buffer. Corrigeer de pH ten slotte op 8.0 door toevoeging van natriumhydroxide-oplossing tot de pH wordt bevestigd.
- 1% voorraad TB bereiden: Meng 1 TB g in 100 mL gedestilleerd water.
- Bereid de werkoplossing TB door het mengen van 40 mL 0,1 M werkende buffer in 3 mL 1% voorraad TB.
- Incubeer de dia's in de TB-werkoplossing voor 14-17 s.
Opmerking: Deze vlek is zeer tijdgevoelig; de incubatietijd moet mogelijk worden aangepast om te voorkomen dat overstaining. - Wassen van de dia's in gedistilleerd water drie keer, gedurende 5 minuten elk.
- Plaats de coverslips op de top van de dia's in 30% glycerol in gedestilleerd water. Lichte Microscoop imaging10uit te voeren.
Opmerking: Geen dekglaasje aan de dia's gekleurd voor TB in glycerol + PBS. PBS wast uit dit soort vlek.
7. fluorescerende histologische kwantificering
- Histologische kwantificering van fluorescerende afbeeldingen uitvoeren met behulp van de software van de analyse van een afbeelding (Zie de Tabel van de materialen).
Opmerking: Het basisprincipe van histologische kwantificering in deze methode is om te verdelen het aantal pixels van de TL van belang door het totale aantal pixels van de ruimte van belang en het verkregen getal vermenigvuldigt met 100, wat resulteert in een percentage van positieve pixels binnen dat gebied. - De kwantificering van Col10a1 expressie in de MCC van Sagittaal secties van condyles uitvoeren.
- Wanneer het kwantificeren van alle soorten cellen en vlekken met behulp van deze methode, selecteert u het gebied moeten worden gekwantificeerd. Open de histologische afbeeldingen die in de software van de analyse van een afbeelding en selecteer het gebied met behulp van de "Lasso Tool (L)" (Figuur 4A). Voor de analyse die hier worden beschreven, selecteert u de MCC regio alleen; na het selecteren van het gebied, is het totale aantal pixels getoond op het "Histogram" vak op het scherm van de software (Figuur 4A). Sla het aantal pixels in het gebied van belang.
- De Col10a1 rode pixels selecteren met behulp van het hulpprogramma bemonstering. Klik op "Select" op de bovenste paneel en vervolgens op "Color Range." Klik op het "gereedschap Pipet," Selecteer het monster van de kleur voor de pixel van belang in de afbeelding, en klik op 'OK'. Alle gebieden positieve voor de gekozen pixelkleur zullen geselecteerd (Figuur 4B). Het aantal fluorescerende pixels (weergegeven in het vak 'Histogram' van het scherm) kopiëren en plakken in een werkblad of statistische software voor analyse.
- Verdeel het aantal fluorescerende pixels over het aantal pixels van de ruimte van belang en dit getal te vermenigvuldigen met 100: TL pixels / pixels in interessegebied * 100.
Opmerking: Andere soort cellen, zoals blauwe Col2a1, kan worden gekwantificeerd met deze zelfde methode, maar de blauwe pixels moeten worden geselecteerd in plaats van de Col10a1 rode pixels.
Figuur 4 . Vertegenwoordiging van transgenic Col10a1 kwantificering. (A) Selecteer het interessegebied met de "lasso" (L). Voor Col10a1-positieve cellen, selecteert u het hele mandibulaire kraakbeen. Sla het aantal pixels van het vak "histogram". (B) Selecteer de pixel van belang, in dit geval het rode fluorescerende Col10a1 pixels. Merk op dat alleen de rode pixels binnen het gebied van belang zal worden geselecteerd. Sla het aantal rode pixels uit het vak "histogram". Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- De kwantificering van de activiteit van de TRAP in het MCC en subchondrale bot uitvoeren.
- Volg de procedure die is beschreven in stap 8.2, maar in plaats van alleen het selecteren van de MCC-gebied, selecteer de kraakbeen en subchondrale bot regio's (Figuur 5A).
- Voor de analyse van de activiteit van de TRAP, selecteert u de gele pixels die worden gegenereerd door het ELF97 substraat, zoals beschreven in stap 8.2.2 (Figuur 5B); kopiëren van het aantal positieve pixels; en plak deze in een spreadsheet of statistische software voor analyse.
- Het percentage van de TRAP-positieve pixels verkrijgen door delen van het aantal gele pixels door het totale aantal pixels in het subchondrale been regio en te vermenigvuldigen met 100.
Figuur 5 . Vertegenwoordiging van fluorescerende kwantificering van de TRAP. (A) Selecteer het interessegebied (mandibulaire kraakbeen en subchondrale bot) en sla het aantal pixels van deze regio. (B) Selecteer de gele fluorescerende pixels, die val activiteit vertegenwoordigt. Er rekening mee dat alleen TRAP-positieve pixels selecteren. Sla het aantal geselecteerde pixels. Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Het uitvoeren van de kwantificering van EdU-positieve cellen.
- EdU gebeitste dia's zijn counterstained met DAPI, dus in plaats van te tellen het totale aantal pixels in de regio van belang, selecteer de pixels van de DAPI-positief om het percentage van EdU-positieve pixels te berekenen. Selecteer het gebied van belang, zoals beschreven in stap 8.2, maar bewaar niet het totale aantal pixels. Selecteer de DAPI blauwe pixel als de monsterkleur, zoals beschreven in stap 8.2.2; kopiëren van het aantal pixels van de DAPI-positieve (Figuur 6A); en plak deze in een spreadsheet of statistische software voor analyse.
- Vervolgens selecteert u de EdU-positieve pixels (gele fluorescerende pixels) en het aantal pixels in het "histogram"-vak (Figuur 6B) opslaan.
- Bereken het percentage van EdU pixels door het aantal pixels van de EdU-positief door het aantal pixels van de DAPI-positief en het verkregen aantal te vermenigvuldigen met 100.
Figuur 6 . Vertegenwoordiging van EdU kwantificering. (A) Selecteer de proliferatieve regio van de MCC (de buitenste laag van het kraakbeen). DAPI-positieve pixels selecteren en sla het aantal pixels. (B) Selecteer van EdU-positieve pixels (geel fluorescerende) en sla het aantal pixels. Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
8. kwantificering van de dikte van het kraakbeen en Proteoglycaan distributie
- De dikte van het kraakbeen (afstand toewijzing) en het toluïdine blauw gebeitste gebied met behulp van de Digimizer afbeelding software analyseren.
Opmerking: Gebruik de schaal bar in het histologisch beeld om het bepalen van de eenheid (Figuur 7A). - Het uitvoeren van een toewijzing van de afstandsmeting.
Opmerking: De toewijzing van de afstandsmeting zorgt voor de dikte van het kraakbeen aan de mandibulaire condyle. In de hier beschreven methode, zijn vijf regio's van de MCC geselecteerd, wordt een gemiddelde van de totale dikte van de MCC te geven. De onderzoeker kan kiezen voor het meten van drie verschillende regio's, of zelfs één enkele regio in het midden van de MCC.- Met het gereedschap "lengte" meet de lengte van het kraakbeen van het buitenoppervlak aan het einde van het toluïdine blauw gekleurde gebied (Figuur 7B) in vijf regio's, of in zoveel plaatsen als voorkeur.
- Kopiëren van de metingen van de lengte van de "meting lijst."
Opmerking: De software biedt ook een gemiddelde van de metingen (Figuur 7B).
- Meet het toluïdine blauw gekleurde gebied.
Opmerking: Bij de waardering van het toluïdine blauw gekleurde gebied, het gebied van Proteoglycaan in het MCC zal worden verkregen.- Selecteer het gereedschap "ruimte" en contour de toluïdine blauw gekleurde gebied (Figuur 7C).
- Kopiëren van de metingen van het gebied van de "meting lijst."
Figuur 7 : Vertegenwoordiging van Proteoglycaan distributie kwantificering. (A) de bar van de schaal van het histologisch beeld gebruiken om te bepalen van de eenheid door te klikken op de "eenheid" knop (omcirkeld in het rood, eenheid die is geselecteerd: 500 µm). (B) meet dikte van het kraakbeen op verschillende locaties met behulp van de "lengte" tool (omcirkeld in het rood). Sla de metingen van de "lijst" in het bovenste rechter paneel. De software biedt ook "statistieken" in de lagere rechter paneel, zodat het gemiddelde en SD van de metingen kan rechtstreeks worden verkregen. (C) meten de toluïdine blauw gekleurde gebied met behulp van de "ruimte"-tool (omcirkeld in het rood). Cirkel van het interessegebied en opslaan van de meting van de "meting lijst." Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beschrijvende statistiek werden te onderzoeken van de verdeling van de Morfometrische metingen (mandibulaire lengte, Condylaire lengte, Condylaire breedte) en histologische analyses uitgevoerd. Resultaten werden vergeleken tussen de geladen groep (dat wil zeggen, muizen onderworpen aan druksterkte laden met de beta titanium lente) en de controlegroep (dat wil zeggen, bijpassende besturingselement muizen die niet elke procedure ontvangen). Statistisch significante verschillen tussen middelen werden bepaald door de ongepaarde t-test, en een p-waarde van < 0.05 werd geacht statistisch significant.
Morfometrische metingen, zoals beschreven in stap 4 en Figuur 3, werden uitgevoerd in de kaken van de geladen en de controlegroepen. De geladen groep gepresenteerd met aanzienlijk verhoogde onderkaak lengte (geladen: 16.62 ± 0,23 mm versus controle: 16.21 ± 0,2 mm; p < 0,05) en condyle hoofd lengte (geladen: 4.6 mm, SD 0,08 mm versus controle: 4.4 mm; SD 0,06; p < 0,05) in vergelijking met de controlegroep. Toch was er geen significant verschil in condyle breedte tussen groepen (geladen: 3,06 ± 0,12 mm versus controle: 2.9 ± 0.11; p = 0,09).
Kwantificering van de verdeling van de collageen met behulp van de methode die is beschreven in stap 8 bleek aanzienlijk verhoogd Col10a1 expressie in de MCC van de condyles van de geladen groep in vergelijking met het besturingselement (geladen: 21 ± 4.46% versus controle: 7,50 ± 2.03%; p < 0.005; Figuur 8 A en D). Aan de andere kant, was er geen statistisch verschil in Col2a1 expressie tussen de geladen en controlegroepen (geladen: 4,85% ± 1,95% versus controle: 2,92% ± 1,89%; p = 0.13; Figuur 8 B en E). Bovendien, de analyse van de activiteit van de TRAP bleek verhoogde TRAP-positieve regio's subchondrale regio van de condyles van geladen muizen (geladen: 5,28% ± 1,45% versus controle: 2.41 ± 1.39%; p < 0.05; Figuur 8 C en F). Ook wij waargenomen verhoogde celproliferatie, zoals aangegeven door de toegenomen EdU-positieve cellen in het MCC van de geladen groep in vergelijking met controle muizen (geladen: 6.23 ± 1,89% versus controle: 1.90 ± 1,03%; p < 0.05; Figuur 9 A en C).
Proteoglycaan distributie in de MCC van geladen en controle muizen werd gekwantificeerd door de evaluatie van het toluïdine blauw gekleurde gebied en de afstand kaart, zoals beschreven in stap 9 en Figuur 7. We vonden aanzienlijk verhoogde afstand toewijzing in het MCC van condyles van de geladen groep in vergelijking met controle (geladen: 210.22 µm ± 4.11 µm versus controle: 187.36 µm ± 8.64 µm; p < 0.005; Figuur 9 B en D). Echter, het gebied van Proteoglycaan gebeitste was niet statistisch verschillend tussen de geladen en controlegroepen (geladen: 203,897.93 µm2 ± 10,171.00 µm2 versus controle: 202,875.09 µm2 ± 33,419.09 µm2; p = 0.94; Figuur 9 B en E)
Figuur 8 : Representatieve resultaten: (A) Col10a1-positieve cellen in de Sagittaal secties van de MCC van condyles van controle en geladen muizen. Er zijn verhoogde aantallen Col10a1-positieve cellen van de geladen groep (D). (B) Col2a1-positieve cellen in controle en geladen muizen. Er is geen verschil in Col2a1-positieve cellen tussen groepen (E). (C) OVERLAPPEN kleuring in condyles van controle en geladen muizen. Verhoogde activiteit van de TRAP in de geladen groep in vergelijking met controle (F). De histogrammen (D-F) vertegenwoordigen de middelen ± SD voor n = 4 per groep. ** Significant verschil tussen het besturingselement en de geladen groepen (p < 0.005). Schaal bar = 200µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9:representatieve resultaten: (A) EdU kleuring in condyles van controle en geladen muizen. Verhoogde celproliferatie in de geladen groep, cellen zoals vertegenwoordigd door verhoogde EdU-positieve (C). (B) toluïdine blauwe vlekken in de condyles van de controle en de geladen muizen. Verhoogd de dikte van het kraakbeen in de geladen muizen, zoals blijkt uit de toewijzing van de grotere afstand in de experimentele groep (D). Geen verschil in Proteoglycaan gebeitste ruimte tussen het besturingselement en geladen groepen (E). Histogrammen (C-E) vertegenwoordigen de middelen ± SD voor n = 4 per groep. ** Significant verschil tussen het besturingselement en de geladen groepen (p < 0.005). Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript beschreven methoden voor de meting van Morfometrische en cellulaire analyse van lymfkliertest mandibulaire condyles en kaken. De radiografische Morfometrische metingen kunnen ook worden gebruikt voor het analyseren van andere beenderen van kleine proefdieren. Bovendien, de cellulaire analyse (cel kwantificering en kraakbeen afstand mapping) zijn niet beperkt tot de knaagdieren mandibulaire condyle, maar kan worden gebruikt voor het kwantificeren van de histologische secties van talrijke weefsels.
Transgene muismodellen uiting van fluorescerende verslaggevers zijn uitstekende instrumenten te wijzigingen in genexpressie visueel te begrijpen. De dubbel-collageen fluorescerende verslaggever muismodel (Col2a1XCol10a1) gebruikt in dit verslag was vooral geschikt voor de studie van de MCC, omdat de transgenen worden uitgedrukt in de prehypertrophic en hypertrofische regio van de MCC zo dat collageen-distributie kan worden geëvalueerd. Als de onderzoeker geen toegang tot een transgeen muismodel uiting van fluorescerende verslaggevers heeft, kunnen andere analysemethoden histologische eiwit expressie, zoals immunofluorescentie, worden gebruikt.
Voor de metingen van de Morfometrische is de kritieke stap vóór het kabinet radiografie-opnamen het verwijderen van alle zachte weefsels van de onderkaak of van de botten te analyseren. Overmatig spier of zacht weefsel gehecht aan de botten kan maskeren de werkelijke metingen van de structuren. Het is belangrijk om bewust van de beperkingen van het kabinet radiografie-systeem. Zoals elke x-stralen, het is een 2-dimensionale weergave van een 3-dimensionale structuur en overlapping van de structuren en artefacten dient zorgvuldig te worden geïnterpreteerd. Bovendien, moet de positionering van de botten in het kabinet-radiografische consistent.
De cellulaire kwantificering door middel van het tellen van het aantal positieve pixels is een efficiënte methode voor de kwantificering van de histologische in een cel-rijke regio zoals de MCC, maar de beperking van deze aanpak is dat het niet in het precieze aantal cellen voorziet. Bovendien, aangezien het kwantificeert alleen pixels geselecteerd, verdient het te kwantificeren van alle afbeeldingen van belang met behulp van dezelfde "bemonsterd" pixel om te voorkomen dat de kwantificering van pixels van verschillende intensiteiten bij het analyseren van verschillende afbeeldingen.
Een algemeen stukje van advies bij het kwantificeren van de histologische secties is voor het analyseren van meerdere seriële secties van elk monster (in dit manuscript, seriële driedelig werden geanalyseerd voor elke condyle), aangezien de variaties binnen elk monster worden meestal waargenomen.
De methodologie die is vermeld in onze experimenten is eenvoudig, makkelijk te gebruiken, en kan worden gebruikt in een studie van de gemineraliseerde weefsel in welke verslaggever muizen worden gebruikt. Met de bestaande methodologie is het mogelijk om te visualiseren van de cellen die zijn gekleurd voor val (Col2a1 of Col10a1) of EdU (Col1a1 of Col2a1) door het visualiseren van de co lokalisatie van cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs bedank Dr. David Rowe voor het vriendelijk verstrekken de transgene muizen en Li Chen voor de histologische bijstand.
Het onderzoek in deze publicatie gerapporteerd werd gesteund door het nationale Instituut van Dental & craniofaciale onderzoek van de National Institutes of Health onder Award nummer K08DE025914 en door de Amerikaanse vereniging van orthodontische Stichting Sumit Yadav.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MX20 Radiography System | Faxitron X-Ray LLC | ||
| Digimizer Image software | MedCalc Software | ||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Manual microscope Axio Imager Z1 | Carl Zeiss | 208562 | |
| yellow fluorescent protein filter - EYFP | Chroma Technology Corp | 49003 | |
| cyan fluorescent protein filter - ECFP | Chroma Technology Corp | 49001 | |
| red fluoresecent protein filter - Cy5 | Chroma Technology Corp | 49009 | |
| sodium acetate anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
| sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ELF97 substrate | Thermo Fisher Scientific | E6600 | |
| ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit | Life Technologies | C10339 | includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Scientific | D1306 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems Incorporated | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Research Products International | P32080-100T | |
| CNA Beta III Nickel-Free Archwire | Ortho Organizers, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. |
References
- LeResche, L. Epidemiology of Temporomandibular Disorders: Implications for the Investigation of Etiologic Factors. Crit Rev Oral Biol Med. 8 (3), 291-305 (1997).
- Chen, J., et al. Altered functional loading causes differential effects in the subchondral bone and condylar cartilage in the temporomandibular joint from young mice. Osteoarthr Cartil. 17 (3), 354-361 (2009).
- Pirttiniemi, P., Kantomaa, T., Sorsa, T. Effect of decreased loading on the metabolic activity of the mandibular condylar cartilage in the rat. Eur J Orthod. 26 (1), 1-5 (2004).
- Chavan, S. J., Bhad, W. A., Doshi, U. H. Comparison of temporomandibular joint changes in Twin Block and Bionator appliance therapy: a magnetic resonance imaging study. Prog Orthod. 15 (57), (2014).
- Dutra, E. H., et al. Cellular and Matrix Response of the Mandibular Condylar Cartilage to Botulinum Toxin. PLoS ONE. 11 (10), 0164599 (2016).
- Benjamin, M., Ralphs, J. R. Biology of fibrocartilage cells. Int Rev Cytol. 233, 1-45 (2004).
- Shen, G., Darendeliler, M. A. The Adaptive Remodeling of Condylar Cartilage- A Transition from Chondrogenesis to Osteogenesis. J Dent Res. 84 (8), 691-699 (2005).
- Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
- Kaul, R., et al. The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage. PLoS ONE. 11 (7), 0160121 (2016).
- Dyment, N. A., et al. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J Vis Exp. , e54468 (2016).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).
- Hayman, A. R. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).
