En morfometriska och cellulära analysmetod för murina Mandibular Condyle

Summary

Detta manuskript presenterar metoder för att analysera morfometriska och cellulära förändringar inom den mandibular condylen av gnagare.

Abstract

Käkleden (TMJ) har kapacitet att anpassa sig till yttre stimuli, och laddar ändringar kan påverka placeringen av kondyler, liksom de strukturella och cellulära komponenterna av mandibular kondylärt brosk (MCC). Detta manuskript beskrivs metoder för att analysera dessa förändringar och en metod för att ändra lastning av TMJ i möss (dvs tryckkraft statiska TMJ laddar). Strukturella utvärderingen illustreras här är en enkel morfometriska metod som använder programvaran Digimizer och utförs i röntgenbilder av små ben. Dessutom, analys av cellulära förändringar leder till förändringar i kollagen uttryck, benremodellering, celldelning och proteoglykan distribution i MCC beskrivs. Kvantifiering av dessa förändringar i histologiska avsnitt - genom att räkna de positiva fluorescerande pixlar med bild programvara och mäta avståndet mappningen och färgade området med Digimizer - demonstreras också. De metoder som visas här är inte begränsade till murina TMJ, men kan användas på ytterligare ben av små experimentella djur och i andra regioner i endochondral benbildning.

Introduction

TMJ är en unik bärande gemensamt i regionen kraniofaciala och bildas av fibrocartilage. MCC av TMJ är nödvändigt för ledfunktion, inklusive obehindrat käken rörelse samtidigt tala och masticating, men den påverkas ofta av degenerativa sjukdomar, inklusive artros¹. TMJ har kapacitet att anpassa sig till yttre stimuli och lastning förändringar, vilket leder till strukturella och cellulära förändringar till komponenterna i MCC^2,3,4,5. MCC-bärande egenskaper kan förklaras av interaktioner mellan dess beståndsdelar, inklusive vatten, kollagen nätverket, och tätt packade proteoglykaner. Den MCC har fyra distinkta cellulära zoner som uttrycka olika typer av kollagen och icke-kollagen proteiner: 1) ytlig eller artikulära zonen; (2) proliferativ zonen består av odifferentierade mesenkymala celler och som svarar på lastning krav; (3) den prehypertrophic zonen, består av mogen kondrocyter uttrycker kollagen typ 2; och 4) den hypertrofisk zonen, regionen där hypertrofisk kondrocyterna att uttrycka kollagen typ 10 dö och genomgå förkalkning. Icke-mineraliserad regionen är rik på proteoglykaner som ger resistens mot tryckkraft styrkor⁶.

Det finns kontinuerlig mineralisering vid zonen hypertrofisk MCC, där övergången från kondrogenes till osteogenesis uppstår, garanterar det subkondrala benet av mandibular condyle⁷robust mineral struktur. Cellförändringar i regionerna unmineralized och mineraliserade slutligen leda till morfologiska och strukturella förändringar i mandibular condyle och underkäken. Underhåll av homeostas av alla cellulära regioner MCC och mineraliseringen av subkondrala portion är nödvändiga till hälsa, bärförmåga och integritet TMJ.

Flera kollagen transgen musmodell (som beskrivs av Utreja et al.) ⁸ är ett bra verktyg att använda för att förstå förändringar i kollagen uttryck eftersom alla transgener uttrycks i MCC. För en fördjupad histologisk utvärdering används histologiska fläckar att studera matrisen nedfall, mineralisering, cellproliferation, apoptos, samt och proteinuttryck på de olika cellagren MCC.

I detta används manuskript, histologiska och morfometriska analyser för att utvärdera cellulära och strukturella förändringar i MCC och subkondrala benet av mandibular condyle av möss. Dessutom beskrivs en cell kvantifiering metod, för att analysera fluorescerande histologiska bilder och för kartläggning av ljusmikroskop diabilder. Tryckkraft statiska TMJ lastning metod, vilket gör cellulära och morfologiska förändringar vid MCC och subkondrala benet⁹, illustreras också för att validera våra metoder.

Metoderna som beskrivs här kan användas för att bestämma morfometriska och histologiska förändringar i mandibular condyle och underkäken gnagare eller att analysera andra regioner i endochondral benbildning och morfologi av ytterligare mineraliserade vävnader.

Protocol

Den institutionella djurvård kommittén för University of Connecticut Health Center godkänt alla djur förfaranden.

1. tryckhållfasthet statiska TMJ lastning: Mun öppnas

Obs: Fyra veckor gamla transgena möss härbärgerat fluorescerande reportrar för kollagen (Col2a1XCol10a1), vänligen tillhandahållen av Dr. David Rowe (University of Connecticut), användes för de experiment som beskrivs i detta manuskript (n = 8; 4 hanar och 4 tikar). Den Col2a1 cyan (blå) transgenens uttrycks i cellerna vid zonen prehypertrophic MCC, medan Col10a1 körsbär (röd) celler är närvarande i hypertrofisk region⁸ (figur 1). Mössen delades lika i två grupper: 1) laddade gruppen där möss utsattes för tryckkraft statiska TMJ lastning (beskrivs i steg 2) och 2) kontrollgruppen, där möss fick ingen intervention.

Figur 1. Representant sagittal av condyle av en dubbel-kollagen fluorescerande reporter mus (Col2a1XCol10a1). Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

1. Tillverka fjädrar usingbeta titan legering archwires (0,017 x 0,025 tum) (figur 2A).
2. Söva försöksdjuren genom en intraperitoneal injektion av en blandning av ketamin (90 mg/kg kroppsvikt) och xylazin (13 mg/kg kroppsvikt).
3. Försiktigt öppna munnen i möss och infoga fjädrarna, engagerande slingor i de maxillary och mandibular framtänderna (figur 2B och C).
4. Inducera tryckkraft statiska TMJ lastning genom att hålla fjädrarna i på framtänderna sövda mössens för 1 h. Upprepa proceduren för 5 dagar.
5. Injicera möss med 5-ethnyl-2'-deoxiuridin (EdU; 30 mg/kg kroppsvikt) intraperitonealt för cell spridning analys 2 dagar och 1 dag innan eutanasi.

Figur 2. Tryckkraft statiska TMJ lastning: mun tvingade öppen modell. (A) våren tillverkad av 0,017 x 0,025 beta titan legering archwire. (B) inlästa mus med våren. (C) röntgenbild av inlästa och kontroll möss visar skillnader i placeringen av underkäken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. underkäken dissektion och fixering

1. Vid slutpunkten av förfaranden som tvingade-öppen mun, eutanasi försöksdjuren med en godkänd metod.
2. Dissekera Underkäkar genom att skära den muskulösa bifogade filen utan skrapa brosk av condyle.
3. Placera de rengjorda Underkäkar i 10% formalin i 24 h för fixering.
   Försiktighet: Formalin är irriterande; Använd lämplig personlig skyddsutrustning.

3. X-ray Imaging och morfometriska mätningar

1. Placera Underkäkar i en platt behållare (t.ex. en 55 mm x 16 mm petriskål) och ta röntgenbilder av proverna skåp röntgen system med en 26 kV för 5 s.
   Obs: Placera en skala bar innan du sparar bilderna.
2. Utföra morfometriska mätningar av de underkäkar använder ett bildbehandlingsprogram för analys (se Tabell för material).
   Obs: Innan du utför eventuella mätningar, använda skalstapeln på röntgenbild för att avgöra enheten. Detta steg är viktigt att korrekt mäta de anatomiska strukturerna. Klicka på knappen ”Unit” (figur 3A).
3. Välj de anatomiska punkter med hjälp av den ”markör stilen 2” i avbildningsprogrammet (figur 3B). För att följa den metod som beskrivs i detta dokument, Välj följande punkter (figur 3B):
   1. Markera condylion (punkt 1), den mest bakre punkten av mandibular condyle;
   2. Välj processen framtand (punkt 2).
   3. Välj den djupaste punkten på sigmoideum skåran (punkt 3).
   4. Välj den djupaste punkten i konkavitet av mandibular ramus (punkt 4).
   5. Välj den mest främre punkten av den kondylärt artikulära ytan (punkt 5). och
   6. Välj den mest bakre punkten av den kondylärt artikulära ytan (punkt 6).
4. När du har valt de anatomiska punkterna, utför morfometriska mätningar med verktyget ”längd”, men för condyle huvud längd, Använd verktyget ”vinkelräta linjen” från punkterna 3 och 4 (figur 3C).
   1. Mät längden på mandibular, från condylion (1) till framtand processen (2).
   2. Mät längden condyle huvud - vinkelräta avståndet från condylion (1) till en linje som spåras från den djupaste punkten på sigmoideum skåran (3) till den djupaste punkten i konkavitet av mandibular ramus (4).
   3. Mäta condyle huvudet bredd - avståndet från mest anterior mest posterior peka av den kondylärt artikulära ytan (5-6).
   4. Kopiera mätningarna från listan ”mätning” på höger sida av skärmen (figur 3C).

Figur 3 . Representation av morfometriska mätningar av underkäken. (A) använda skalstapeln av röntgenbild för att avgöra enheten (inringad i rött, skalstapeln: 10 mm). (B) Välj de anatomiska punkter med hjälp av ”markör stil 2” (inringad i rött). (1) Condylion; (2) framtand processen; (3) djupast peka på sigmoideum skåran; (4) djupaste punkt i konkavitet av mandibular ramus; (5) mest främre punkten av kondylärt artikulära ytan. (6) de flesta bakre punkt i den kondylärt artikulära ytan. Skalstapeln: 10 mm.(C) utför mätningar med ”längd” och ”vinkelrät” verktyg (inringad i rött). Mätningar från punkt 1 till 2: mandibular längd; från punkt 5 till 6: kondylärt bredd; vinkelrätt från punkt 1 till 4 - 3: kondylärt huvudet längd. Spara mätningar från ”mätning listan”. Skalstapeln = 10 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

4. condyle inbäddning

Obs: Efter att ha tagit de radiografiska bilderna, Underkäkar kan inbäddade och sektioneras för histologisk analys.

1. Placera undecalcified Underkäkar (som har korrigerats i steg 2.3) i 30% sackaros i PBS över natten innan inbäddning.
2. Analysera eventuella överskjutande mjukvävnad och försiktigt skära den mandibular condylen.
3. Häll några inbäddning harts (tillräckligt för att täcka provet) i disponibel plast formar och placera den mediala ytan av condyle mot basen av mögel, positionering provet parallell till botten av formen.
4. Fixa preparatet på rätt plats med en bit torris.
5. Fyll formen med inbäddning harts och placera formen med fasta prov i kallt 2-metyl-butan, som kan vara pre kylda i frys-20 ° C eller -80 ° C eller i torr-is.
6. Lagra exemplaren vid-20 ° C eller vid-80 ° C tills snittning.

5. condyle Sagittal snittning och bild förberedelse

1. Skapa frusna sagittala snitt av kondyler (5-7 µm) och överför proven i bilden med hjälp av tejp överföring metod^10,11.
2. Följa avsnitten histologiska överföras till de band med UV-härdande metod¹⁰.

6. histologiska färgning och mikroskopbilder

Obs: De flesta av histologiska färgningen utförs enligt beskrivningen i avsnittet histologiska papperets av Dyment et al¹⁰.

1. För baslinjen skanning, är det första steget att bilden för Col2a1 och Col10a1 transgener, som beskrivs av Dyment et al¹⁰ .
   1. Placera coverslips ovanpå bilderna i 30% glycerol och PBS. Utföra baslinjen imaging ofthesectionswitha fluorescerande Mikroskop och lämpliga filter.
2. Utföra fluorescerande tartrat-resistenta syra fosfatas (TRAP) färgning.
   Obs: FÄLLAN är uttryckt av hematopoetiska celler, inklusive ben resorbing celler, osteoklaster¹². Syftet med denna fläck är att analysera MCC och subkondrala benremodellering.
   1. Ta bort täckglaset bilder genom att blötlägga dem i PBS. Tvätta bilderna i PBS tre gånger för 5 min varje.
   2. Förbereda fälla buffert 1 genom att lösa upp natriumacetat vattenfri (9,2 g) och natrium L-tartrat dibasiskt dihydrat (11,4 g) i 1 liter destillerat vatten. Justera pH till 4.2 med ättiksyra och lagra fälla bufferten 1 vid 4 ° C.
   3. Förbereda fälla buffert 2 av nymalen upplösning natriumnitrit (40 mg) i 1 mL destillerat vatten.
   4. Förbered fälla substratbuffert (strax före färgning) genom att blanda 7,5 mL buffert 1 och 150 µL buffert 2. Applicera denna lösning (200 µL) till varje bild i 10 min i rumstemperatur.
   5. Förbered fälla reaktion buffert genom att blanda 1.840 mL substratbuffert och 23 µL av fluorescerande substrat (se Tabell för material).
      Obs: Den fluorescerande substrategeneratesayellowfluorescentsignal för TRAP-aktivitet.
   6. Ta bort överflödigt fälla substratbuffert genom försiktigt pipettering lösningen.
   7. Inkubera i bilderna med 200 µL fälla reaktion buffert för 5 min under en UV-källa lampa svart ljus.
   8. Tvätta bilderna i PBS tre gånger för 5 min varje.
   9. Placera coverslips på bilder i 30% glycerol i PBS och utför mikroskopiska imaging¹⁰.
3. Utföra cell spridning färgning.
   Obs: I denna analys, den modifierade tymidin analoga 5-ethynyl-2'-deoxiuridin (EdU) inkorporeras i nyligen syntetiskt DNA: delande celler är märkta med ett fluorescerande färgämne.
   1. Efter imaging för fälla, ta bort coverslips och tvätta bilderna i PBS tre gånger för 5 min varje. Följ stegen från 5-ethynyl-2'-deoxiuridin cell spridning kit att färga de histological avsnitten.
   2. Förbereda en reaktion cocktail genom att lägga till 430 µL av 1 X reaktion buffert, 20 µL av CuSO₄, 1,2 µL av fluorescerande färgämne och 50 µL av 1 X buffert tillsats (en total volym av 500 µL är nog för en bild).
      Obs: Tillverkaren rekommenderar att lägga ingredienserna i den ordning som beskrivs här.
   3. Inkubera bilderna med förberedda drinkar i 30 min i rumstemperatur, skyddas från ljus.
   4. Tvätta bilderna i PBS tre gånger för 5 min varje.
   5. Placera coverslips ovanpå bilderna i 30% glycerol i PBS med 1:1,000 DAPI.
      Obs: DAPI (4', 6-diamidin-2-fenylindol) är en blå fluorescerande nukleära fläck som binder till AT-rika regioner i DNA.
4. Utföra toluidin blå (TB) färgning.
   Obs: TB färgning avslöjar proteoglykan fördelningen på MCC.
   1. Skölj den bilder indistilledwater för att ta bort coverslips.
   2. Efter avlägsnande av coverslips, tvätta objektglasen i destillerat vatten tre gånger för 5 min varje helt ta bort salter från PBS.
   3. Förbereda TB arbetande buffert genom att lösning en (lös 28,4 g natriumfosfat dibasisk i 1 liter destillerat vatten) och lösning B (lös 27,6 g natriumfosfat monobasiskt i 1 liter destillerat vatten). Blanda 94,7 mL av lösning A med 5,3 mL lösning B. Dilute denna lösning 1:1 i destillerat vatten att göra 200 mL 0,1 M arbetar buffert. Rätta pH till 8.0 genom att lägga till natriumhydroxid tills pH är fast.
   4. Förbereda 1% lager TB: Blanda 1 g TB i 100 mL destillerat vatten.
   5. Förbered TB fungerande lösning genom att blanda 40 mL 0,1 M arbetande buffert i 3 mL 1% lager TB.
   6. Inkubera bilder i TB arbetslösning för 14-17 s.
      Obs: Denna fläck är mycket tid känslig; Inkubationstiden kan behöva justeras för att förhindra overstaining.
   7. Tvätta objektglasen i destillerat vatten tre gånger för 5 min varje.
   8. Placera coverslips ovanpå bilderna i 30% glycerol i destillerat vatten. Utföra ljusmikroskop imaging¹⁰.
      Obs: Använd inte täckglas bilderna färgas för TB i glycerol + PBS. PBS tvättar ut denna typ av fläcken.

7. fluorescerande histologiska kvantifiering

1. Utföra histologiska kvantifiering av fluorescerande bilder med hjälp av ett bildbehandlingsprogram för analys (se Tabell för material).
   Obs: Den grundläggande principen för histologiska kvantifiering i denna metod är att dela upp antalet fluorescerande pixlar av intresse av det totala antalet pixlar med området av intresse och multiplicera antalet erhållna med 100, vilket resulterar i en procentandel av positiva pixlar inom denna region.
2. Utföra kvantifiering av Col10a1 uttryck i MCC sagittal avsnitt av kondyler.
   1. När kvantifiera alla typer av celler och fläckar med den här metoden, Välj området att kvantifieras. Öppna de histologiska bilderna i ett bildbehandlingsprogram för analys och välj området med hjälp av ”Lasso verktyg (L)” (figur 4A). För analysen beskrivs här, välj regionen MCC endast; När du har valt området, visas det totala antalet pixlar på rutan ”Histogram” på skärmen av programvaran (figur 4A). Spara antalet pixlar i området av intresse.
   2. Välj Col10a1 röda pixlar med hjälp av provtagning. Klicka på ”Välj” på den övre panelen och sedan ”färgområde”. Klicka på ”pipetten”, Välj provet färg för pixeln sevärdheter i bilden, och klicka ”OK”. Alla områden positiva för den valda pixelfärgen kommer att vara markerad (figur 4B). Kopiera i fluorescerande bildpunkter (visas i rutan ”Histogram” på skärmen) och klistra in dem i ett kalkylblad eller statistisk programvara för analys.
   3. Dividera antalet fluorescerande pixlar över antalet pixlar av området av intresse och multiplicera detta tal med 100: fluorescerande pixlar / pixlar i område av intresse * 100.
      Obs: Andra typer av celler, såsom blå Col2a1, kan kvantifieras med samma metod, men den blå pixlar bör väljas istället för Col10a1 röda pixlarna.

Figur 4 . Representation av transgenens Col10a1 kvantifiering. (A) Välj området av intresse med ”verktyget Lasso” (L). För Col10a1-positiva celler, markerar du hela mandibular brosk. Spara antal bildpunkter i rutan ”histogram”. (B) Välj pixeln av intresse, i det här fallet de röda fluorescerande Col10a1 pixlarna. Observera att endast de röda pixlarna inom området av intresse kommer att vara markerade. Spara antalet röda pixlar från rutan ”histogram”. Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

3. Utföra kvantifiering av TRAP-aktivitet i MCC och subkondrala benet.
   1. Följ proceduren som beskrivs i steg 8,2, men istället för att bara välja området MCC, Välj brosk och subkondrala benet regionerna (figur 5A).
   2. För TRAP aktivitet analys, Välj de gula pixlar som genereras av den ELF97 substraten, som beskrivs i steg 8.2.2 (figur 5B). kopiera antalet positiva pixlar; och klistra in dem i ett kalkylblad eller statistisk programvara för analys.
   3. Hämta procentandelen av TRAP-positiv pixlar genom att dividera antalet gul pixlar av det totala antalet pixlar i regionen subkondrala benet och multiplicera med 100.

Figur 5 . Representation av fluorescerande fälla kvantifiering. (A) Välj området av intresse (mandibular brosk och subkondrala ben) och spara antalet pixlar i denna region. (B) Välj de gula fluorescerande pixlar, som representerar TRAP-aktivitet. Observera att endast TRAP-positiv pixlar kommer att välja. Spara antalet markerade pixlar. Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

4. Utföra kvantifiering av EdU-positiva celler.
   1. EdU-färgade bilder är counterstained med DAPI, så istället för att räkna det totala antalet pixlar i regionen av intresse, Välj de DAPI-positiv pixlarna för att beräkna procentandelen av EdU-positiv pixlar. Välj området av intresse som beskrivs i steg 8,2, men Spara inte det totala antalet pixlar. Välj DAPI blå pixeln som provfärgen, som beskrivs i steg 8.2.2; kopiera antalet DAPI-positiv pixlar (figur 6A); och klistra in dem i ett kalkylblad eller statistisk programvara för analys.
   2. Nästa, Välj EdU-positiv pixlar (gula fluorescerande pixlar) och Spara antal bildpunkter i rutan ”histogram” (figur 6B).
   3. Beräkna procentandelen av EdU pixlar genom att dividera antalet EdU-positiv pixlar av antalet pixlar som DAPI-positiv och erhållna numret multipliceras med 100.

Figur 6 . Representation av EdU kvantifiering. (A) Välj regionen proliferativ MCC (det yttre lagret av brosk). Välj DAPI-positiv pixlar och spara antalet pixlar. (B) Välj EdU-positiv pixlar (gul fluorescerande) och spara antalet pixlar. Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

8. kvantifiering av brosk tjocklek och proteoglykan Distribution

1. Analysera brosk tjocklek (avstånd mappning) och toluidin blå-färgade området med programvaran Digimizer bild.
   Obs: Använd skalstapeln i histologiska bilden för att avgöra enheten(figur 7).
2. Utföra en kartläggning avståndsmätning.
   Observera: Avstånd mappning mätning kommer att ge tjockleken av brosket på mandibular condyle. I den metod som beskrivs här, väljs fem regioner MCC, vilket ger ett genomsnitt på MCC totala tjocklek. Forskaren kan välja att mäta tre olika regioner, eller ens en enda region mitt i MCC.
   1. Med verktyget ”längd”, mäta längden av brosk från utsidan till slutet av toluidin blå-färgade området (figur 7B) i fem regioner eller i så många platser som önskat.
   2. Kopiera längd mätningarna från ”mätning listan”.
      Obs: Programvaran ger också ett genomsnitt av mätningar (figur 7B).
3. Mäta toluidin blå-färgade området.
   Obs: Vid mätning av toluidin blå-färgade området, området proteoglykan i MCC kommer att erhållas.
   1. Välj verktyget ”område” och kontur toluidin blå-färgade området (figur 7C).
   2. Kopiera området mätningarna från ”mätning listan”.

Figur 7 : Representation av proteoglykan distribution kvantifiering. (A) använda skalstapeln av histologiska bilden för att avgöra enheten genom att klicka på knappen ”enhet” (inringad i rött, enhet som valts: 500 µm). (B) mäter tjockleken av brosk på olika platser med hjälp av verktyget ”längd” (inringad i rött). Spara mätningarna från listan ”mätning” i den övre högra panelen. Programvaran ger också ”statistik” i den nedersta högra panelen, så det medelvärdet och SD av mätningarna kan erhållas direkt. (C) mäta toluidin blå-färgade området med hjälp av verktyget ”område” (inringad i rött). Circle området av intresse och spara mätningen från ”listan”. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Representative Results

Beskrivande statistik utfördes för att undersöka fördelningen av morfometriska mätningar (mandibular längd, kondylärt längd, kondylärt bredd) och histologiska analyser. Resultaten jämfördes mellan gruppen laddad (dvs möss som utsätts för tryckkraft lastning med beta titanium våren) och kontrollgruppen (dvs, matchande kontroll möss som inte fått något förfarande). Statistiskt signifikanta skillnader mellan de bestämdes av oparat t-test, och p-värdet < 0.05 ansågs vara statistiskt signifikant.

Morfometriska mätningar, som beskrivs i steg 4 och figur 3, utfördes i Underkäkar av den laddade och kontrollgrupper. Inlästa gruppen presenteras med signifikant ökad underkäken längd (laddad: 16,62 ± 0.23 mm kontra kontroll: 16.21 ± 0,2 mm; p < 0,05) och condyle huvud längd (laddad: 4,6 mm, SD 0,08 mm kontra kontroll: 4,4 mm; SD 0,06; p < 0,05) i jämförelse med kontrollgruppen. Dock fanns det ingen signifikant skillnad i condyle bredd mellan grupperna (laddad: 3,06 ± 0,12 mm kontra kontroll: 2.9 ± 0,11; p = 0,09).

Kvantifiering av kollagen distribution med den metod som beskrivs i steg 8 visade signifikant ökat Col10a1 uttryck i MCC av kondyler av laddade gruppen jämfört med kontroll (laddad: 21 ± 4,46% kontra kontroll: 7,50% ± 2,03%; p < 0,005; Figur 8 A och D). Däremot, det fanns ingen statistiskt signifikant skillnad i Col2a1 uttryck mellan de lastade och styra grupper (laddad: 4,85% ± 1,95% kontra kontroll: 2,92% ± 1,89%; p = 0,13; Figur 8 B och E). Dessutom visade analysen av TRAP-aktivitet ökad TRAP-positiva regioner i regionen subkondrala i kondyler av inlästa möss (laddad: 5,28% ± 1,45% kontra kontroll: 2,41% ± 1,39%; p < 0,05; Figur 8 C och F). Likaså vi observerade ökad cellproliferation, indikerat av ökad EdU-positiva celler i MCC i gruppen laddade jämfört med kontroll möss (laddad: 6.23% ± 1,89% kontra kontroll: 1,90% ± 1,03%; p < 0,05; Figur 9 A och C).

Proteoglykan distribution i MCC av inlästa och kontroll möss kvantifierades genom att utvärdera toluidin blå-färgade området och avstånd kartan, som beskrivs i steg 9 och figur 7. Vi hittade betydligt ökat avstånd mappning i MCC av kondyler av laddade gruppen jämfört med kontroll (laddad: 210.22 µm ± 4.11 µm kontra kontroll: 187.36 µm ± 8,64 µm; p < 0,005; Figur 9 ” B och D). Proteoglykan-färgade området var dock inte statistiskt skilt mellan de lastade och styra grupper (laddad: 203,897.93 µm² ± 10,171.00 µm² kontra kontroll: 202,875.09 µm² ± 33,419.09 µm²; p = 0,94; Figur 9 B och E)

Figur 8 : Representativa resultat: (A) Col10a1-positiva celler i avsnitten sagittal MCC av kondyler från kontroll och laddade möss. I området i närheten finns det ökad nummer Col10a1-positiva celler i gruppen laddad (D). (B) Col2a1-positiva celler i kontroll och laddade möss. Det finns ingen skillnad i Col2a1-positiva celler mellan grupperna (E). (C) fälla färgning i kondyler kontroll och laddade möss. Ökad TRAP-aktivitet i gruppen laddade jämfört med kontroll (F). Histogram (D-F) representerar den medel ± SD för n = 4 per grupp. ** Signifikant skillnad mellan kontroll och laddade grupper (p < 0,005). Skalstapeln = 200µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 9:representativa resultat: (A) EdU färgning i kondyler kontroll och laddade möss. Ökad cellproliferation i gruppen laddad celler som representeras av ökad EdU-positiva (C). (B) toluidin blå färgning i kondyler kontroll-och laddade möss. Ökade brosk tjocklek i de inlästa möss, vilket framgår av ökat avstånd mappning i den experimentella gruppen (D). Ingen skillnad i proteoglykan-färgade området mellan kontroll och laddade grupper (E). Histogram (C-E) representerar den medel ± SD för n = 4 per grupp. ** Signifikant skillnad mellan kontroll och laddade grupper (p < 0,005). Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

Detta manuskript beskrivs metoder för morfometriska mätning och cellulära analyser av murina mandibular kondyler och Underkäkar. Radiografisk morfometriska mätningarna kan också användas för att analysera andra ben från små experimentella djur. Dessutom den cellulära analysen (cell kvantifiering och brosk avstånd mappning) är inte begränsade till gnagare mandibular condyle, men kan användas för att kvantifiera histologiska sektioner i många vävnader.

Transgena musmodeller uttrycker fluorescerande reportrar är utmärkta verktyg för att visuellt förstå förändringar i genuttryck. Dubbel-kollagen fluorescerande reporter musmodell (Col2a1XCol10a1) används i denna rapport var speciellt lämplig för studier av MCC, eftersom transgener uttrycks i regionen prehypertrophic och hypertrofisk MCC så att kollagen distribution kunde utvärderas. Om forskaren inte har tillgång till en transgen musmodell uttrycker fluorescerande reportrar, kan andra analysmetoder histologiska protein uttryck, såsom immunofluorescens, användas.

För mätningar av morfometriska är den kritiska steget innan du tar skåp röntgenbild bilderna att ta bort alla mjuka vävnader av underkäken eller skelettet att analyseras. Överdriven muskel eller mjuk vävnad bifogas ben kunde dölja de verkliga mätningarna av strukturerna. Det är viktigt att vara medveten om begränsningarna i skåp röntgenbild systemet. Det är en 2-dimensionell representation av en 3-dimensionell struktur som varje röntgen, och överlappning av strukturer och artefakter bör tolkas försiktigt. Dessutom bör positionering av benen i radiografisk skåpet vara konsekvent.

Cellulära kvantifiering genom räknar antalet positiva pixlar är en effektiv metod för histologiska kvantifiering i en cell-rika region som MCC, men begränsningen av detta tillvägagångssätt är att den inte ger det exakta antalet celler. Dessutom, eftersom det kvantifierar endast pixlar valt, rekommenderas att kvantifiera alla bilder av intresse med hjälp av samma ”samplade” pixel för att undvika kvantifiering av pixlar i olika intensiteter när analysera olika bilder.

Ett allmänt råd när kvantifiera histologiska sektioner är att analysera flera seriell avsnitt av varje prov (i detta manuskript, tre seriell avsnitt analyserades för varje condyle), eftersom variationer inom varje prov är vanligen observeras.

Den metod som nämns i våra experiment är enkel, lätt att använda och kan användas i någon mineraliserad vävnad studie i vilken reporter möss används. Med de befintliga metoder är det möjligt att visualisera de celler som är färgade för TRAP (Col2a1 eller Col10a1) eller EdU (Col1a1 eller Col2a1) genom att visualisera samtidig localizationen av celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MX20 Radiography System	Faxitron X-Ray LLC
Digimizer Image software	MedCalc Software
Shandon Cryomatrix embedding resin	Thermo Scientific	6769006
Manual microscope Axio Imager Z1	Carl Zeiss	208562
yellow fluorescent protein filter  - EYFP	Chroma Technology Corp	49003
cyan fluorescent protein filter - ECFP	Chroma Technology Corp	49001
red fluoresecent protein filter - Cy5	Chroma Technology Corp	49009
sodium acetate anhydrous	Sigma-Aldrich	S2889
sodium L-tartrate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	228729
sodium nitrite	Sigma-Aldrich	237213
ELF97 substrate	Thermo Fisher Scientific	E6600
ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit	Life Technologies	C10339	includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Scientific	D1306
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S3264
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	71505
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260
Adobe Photoshop	Adobe Systems Incorporated
Phosphate buffered saline tablets (PBS)	Research Products International	P32080-100T
CNA Beta III Nickel-Free Archwire	Ortho Organizers, Inc.
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc.