Summary
Laser microirradiation är ett användbart verktyg för studier av DNA-reparation i levande celler. En metod för användning av UVA lasrar att framkalla olika DNA lesioner visas. Vi har optimerat en metod för lokal microirradiation som upprätthåller normala cellcykelns; Således, bestrålade celler vidare genom Mitos.
Abstract
Lokala microirradiation med laser representerar ett användbart verktyg för studier av DNA-reparation-relaterade processer i levande celler. Här, beskriver vi en metod att analysera protein kinetik på DNA skador över tid eller protein-protein interaktioner på lokalt microirradiated kromatin. Vi visar också hur man känner igen olika faser av cellcykeln använder Fucci cellulära systemet för att studera cell-cykel-beroende protein kinetik på DNA lesioner. Metodbeskrivningen för användning av två UV-lasrar (355 nm och 405 nm) att framkalla olika typer av DNA-skador presenteras också. Endast de celler microirradiated av 405-nm diode laser fortsatte genom Mitos normalt och var saknar cyclobutane pyrimidin dimerer (CPDs). Vi visar också hur microirradiated celler kan fastställas vid en given tidpunkt att utföra immunodetection av endogena proteiner av intresse. DNA reparation i studierna, beskriver vi dessutom biofysikaliska metoder inklusive FRAP (fluorescens återhämtning efter fotoblekning) och FLIM (livstid Imaging fluorescensmikroskopi) i celler med spontant förekommer DNA skador foci. Vi visar också en tillämpning av FLIM-bandet (fluorescens resonans energi Transfer) i experimentella studier av protein-protein interaktioner.
Introduction
DNA-skador leder till uppkomsten av DNA lesioner bestående av cyclobutane pyrimidin dimerer (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine och singel-strand eller dubbel-strand breaks1,2. Γ-strålning är i form av joniserande strålning med högsta energi och hög penetrans, således denna källa av strålning används allmänt i strålbehandling3. Däremot, inducerad experimentellt DNA-skador som orsakas av UV lasrar härmar naturlig exponering för UV-ljus. UVA microirradiation, representerar som en mikroskopisk metod, en experimentella verktyg för att studera DNA-skador i enskilda levande celler. Microirradiation användes för första gången 40 år sedan för att avslöja organisationen av kromosom regioner4,5. Denna teknik är mycket beroende av antingen funktionella egenskaper confocal Mikroskop eller tekniska gränserna för modern nanoskopi. För att inducera DNA lesioner, kan celler vara presensitized av 5' Bromdeoxiuridin (BrdU) eller Hoechst 33342 före UV-bestrålning. Bártová et al. 6 tidigare beskrivits det presensitization steget, och nyligen vi optimerat denna microirradiation teknik för att undvika celldöd eller apoptos. Till exempel leder användning av en 405-nm UV-laser (utan Hoechst 33342 presensitization) till induktion av 53BP1-positiv dubbel-strand raster (DSBs) på bekostnad av cyclobutane pyrimidin dimerer (CPDs). Å andra presensitization steg i kombination med UV microirradiation framkalla mycket höga nivåer av CPDs och DSBs samtidigt7,8. Denna metod är svårt att tillämpa på studiet av en enda väg för DNA-reparation.
Med microirradiation är det möjligt att analysera protein rekrytering, kinetik och interaktion på DNA skador i levande celler. Ett exempel på denna metod publicerades av Luijsterburg et al. 9 för Heterokromatin protein 1β och vi visade nyligen för första gången som den pluripotency faktorn Oct4 och ett protein som är associerad med Cajal förkroppsligar, coilin, rekryteras till UV-inducerad DNA lesioner6,10. Protein kinetik vid dessa DNA-skador kan också studeras med hjälp av FRAP (fluorescens återhämtning efter fotoblekning)11,12,13 eller GRÄMA (fluorescens resonans energi Transfer) tekniker14 ,15. Dessa metoder har potential att avslöja enkel diffusion av proteiner vid DNA lesioner eller protein-protein interaktioner. Ett användbart verktyg för ytterligare karakterisering av proteiner är FLIM (livstid Imaging fluorescensmikroskopi) eller dess kombination med bandet teknik (bandet-FLIM)16. Dessa metoder gör det möjligt att studera processer i levande celler som är stabilt eller övergående uttrycker proteinet av intresse märkta av en fluorescerande molekyl17. Här visas ett exempel på exponentiell förfalla time (τ) för GFP-märkta p53 protein och dess interaktion partner, mCherry-taggade 53BP1, spelar en viktig roll i DNA skador svar18,19 . Den parametern τ, är livstid den fluorokrom som tillhandahålls av FLIM beräkningar, specifika för en viss fluorescens färg, dess bindande förmågor och dess cellulära miljön. Därför, denna metod kan visa oss distinktioner mellan protein subpopulations, deras bindande förmågor och deras funktionella egenskaper efter, exempelvis DNA-skador.
Här, en disposition av metodologiska tillvägagångssätt av avancerad mikroskopi tekniker som används i vårt laboratorium för att studera tid-specifika protein rekrytering, kinetik, diffusion och protein-protein interaktioner på platsen av microirradiated kromatin presenteras. Den stegvisa metoden för induktion av lokala DNA lesioner i levande celler, och en beskrivning av metoder som är användbara för studier av DNA-skada-relaterade händelser på lokalt inducerad DNA skador orsakade av UV-lasrar finns.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. odling av cellinjer
- HeLa-derived cellinjer
Obs: Använd HeLa cervikal cancer cells: antingen HeLa cells stabilt uttrycker Histon H2B taggade med GFP eller HeLa-Fucci celler som uttrycker RFP-Cdt1 i G1 och tidiga S faser och GFP-geminin i S/G2-M faser ( figur 1).- För odling av alla HeLa-derived cellinjer, använda Dulbecco ' s modified Eagle ' s medium (DMEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum och lämpliga antibiotika vid 37 ° C i en fuktad atmosfär som innehåller 5% CO 2. Ersätta mediet 2 - 3 gånger per vecka.
- Bort odlingsmedium och skölj cellerna använder 1 x PBS för att avlägsna alla spår av serum som innehåller trypsin-hämmare. Utför det här steget i huv biohazard rumstemperatur.
- Tillsätt 1 mL förvärmd Trypsin-EDTA-lösning att täcka det cell-lagret, och hålla celler vid 37 ° C. Trypsinize celler tills celllagrar sprids (vanligtvis 3-5 min).
- Tillsätts 3 mL förvärmd komplett odlingsmedium att inaktivera Trypsin-EDTA och skingra medlet av försiktigt pipettering flera gånger.
Obs: Denna procedur måste utföras i en biohazard huva för att skydda föraren från föroreningar och bibehålla optimal cell odling villkor. - Räkna celler med en automatisk cell counter eller Bürker kammare. Späd cellsuspension till 1 × 10 5 celler/mL och Pipettera 5 mL i en ny skål. Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO 2.
- Odling av mus embryonala stamceller (mESCs), D3 cellinje
- kultur mESCs på cell kultur rätter överdragna med 0,2% gelatin och mESC underhåll medium. Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO 2.
Obs: Förbereda mESCs odling/underhåll mediet i 50 mL alikvoter och lagra den på 2-8 ° C i upp till 2 veckor rekommenderas. MESC mediet innehåller 75 mL ES Cell FBS, 5 mL Penicillin G och Streptomycin, 5 mL icke-essentiella aminosyror (10 mM) (slutlig koncentration 0,1 mM), 50 µL mus leukemi hämmare faktor (mLIF; 100 µg/mL) (slutlig koncentration 10 ng/mL), 430 µL MTG (1- Thioglycerol; 1: 100 utspädning i DMEM) (slutlig koncentration 100 µM) och hög glukos DMEM medium upp till 500 mL. - Aspirera mESC odling mediet från kultur skålen och skölj cellerna en gång med 1 x PBS.
- Tillsätt 0,5 mL Trypsin-EDTA och inkubera vid 37 ° C bara tills cellerna börjar lossna från skålen. Sedan, inaktivera Trypsin tvätta cellerna med 2 mL av mESC odling medium kompletteras med 15% fetalt bovint serum.
- Använd en pipett för att rubba de resterande cellerna från kultur maträtt.
Obs: Det är viktigt att få enstaka celler, eftersom cellen klumpar främjar differentiering av cellerna. - Split celler 1:10 på gelatinized rätter med mESC underhåll medium.
Obs: Om tätheten av mESC celler är för lågt, de växer inte bra; om densiteten är för hög, differentiering främjas. - Se till att mESCs bibehålls i en odifferentierad stat genom att utföra mESC passage varannan dag genom att dela upp celler från en petriskål in fyra nya rätter. Inspektera mESC kolonierna med ett inverterat Mikroskop under 100 X eller 200 X förstoring, och, om det finns bevis för spontana mES celldifferentiering, utföra Western blotting för att bedöma Oct4 protein utarmning.
Obs: Med optimal cell passaging, spontana differentiering av mESCs in vitro- kan reduceras.
- kultur mESCs på cell kultur rätter överdragna med 0,2% gelatin och mESC underhåll medium. Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO 2.
2. Cell Transfection
- utsäde celler 48 h innan experiment på inrutade mikroskopi rätter (diameter 35 mm) för att hitta microirradiated celler enligt deras koordinater på petriskål.
Obs: Detta är ett exempel i vilka microirradiation är det första experimentella steget och immunfärgning är andra ( figur 2A).- För sådd, använda en koncentration av 5 × 10 4 celler/mL för HeLa-derived cellinjer (eller 1 × 10 4 celler/mL för D3 mES celler). Använd upp till 2 mL komplett medium per maträtt. Under odling och microirradiation, upprätthålla celler i en termostat eller odling kammare vid 37 ° C och 5% CO 2.
- Räkna celler med en automatisk cell räknare.
Obs: Använd inte en högre koncentration av celler. Särskilt när det gäller tätt packade kolonier av D3 mESCs, hög cell densiteten förhindrar en identifiering av lokalt microirradiated celler efter immunfärgning.
- Förbereda plasmid DNA och transfection reagens av val som följer. Förbereda lösning A med 2-3 µg av valda plasmid DNA (se Tabell av material för detaljer) och 150 µL 1 x PBS. Förbereda Lösning B använda 3,5 µL transfection reagens i 150 µL 1 × PBS. Säkerställa att varje lösning är väl blandat genom försiktig pipettering.
Obs: Det optimala förhållandet mellan DNA och transfection reagens empiriskt bestämmas för varje cell fodrar och enskilda plasmid. - På 24 h innan experimentella observation av övergående transfekterade levande celler, kombinera lösning A och lösning B utan vortexa. Inkubera i kombinerade lösningar i rumstemperatur i 15-20 min. På ett sätt som droppvis, homogeneously skingra detta slutföra transfection blandning (300 µL, som beskrivs i punkt 2.2) i cell lager växer i mikroskopi skålen.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO 2 för 4-6 h, sedan ersätta transfection blandningen med färska medium. Odla celler under standart villkorar.
Obs: När du använder en 405-nm laser, inte presensitize cellerna med någon reagens, men när du använder en 355-nm laser, utföra cell presensitization med 10 µM 5-brom-2 ' - deoxy - uridin (BrdU) 7 , 8 . Presensitization tid är beroende av den celltyp och längd av cellcykeln. För HeLa celler, lägga till BrdU 16 till 20 h innan lokala microirradiation. När det gäller mESCs, lägga till BrdU 6 till 8 h innan microirradiation.
3. Induktion av lokala DNA skador och konfokalmikroskopi
- Placera skålen på Mikroskop scenen och spela in positionen för de markerade cellerna på skålen; cell koordinaterna kommer att behövas för vidare analys ( figur 2A a-c).
- Hitta transfekterade cellerna i en kvadrat som är märkta med en siffra eller bokstav ( figur 2A d-f, pilar i Ad visar platsen för cellen förstorat i paneler Ae och Af). Få en bild av cellerna med ljusa fält mikroskopi och erhålla en fluorescens bild för att identifiera placeringen av både cellerna och torget märkt ( figur 2A).
- För bild förvärv före bestrålning, använda en vitt ljus laser (WLL) (470-670 nm i 1-nm steg) ansluten till mikroskopet confocal (eller en annan tillgänglig laser ansluten till confLocal mikroskopet).
- Använder följande inställningar: 512 × 512 punkters upplösning, pixel storlek 64 nm, 400 Hz, dubbelriktad läge (Skanna i två riktningar), linje genomsnittliga set till 8, zoom 8 x 12 x.
Obs: Line genomsnitt representerar ett visst antal skanningar; samma linje genomsöks flera gånger innan du fortsätter till nästa rad. Upprepade skanningar av alla linjer producera den sista bildrutan i bilden. - För bild observation och förvärv, Använd ett 63 × olja mål med en numerisk bländare på 1.4 och sekventiellt förvärva fluorescens bilder. Eliminera överhörning mellan de två fluorokromer med hjälp av sekventiella genomsökningsläget av lämplig programvara.
Obs: Alla Mikroskop programvara gör inställningen av så kallade sekventiell skanningsläge. Operatören kan välja att förvärva fluorokromer ' information samtidigt (t.ex., i röd-grön-blå fluorescens) eller, som nämnts här, individuellt (sekventiellt), fluorokrom av fluorokrom. Ta hänsyn till den allmänna informationen att högsta magnetiseringen/utsläpp för GFP är 395/509 nm och högsta magnetiseringen/utsläpp för mCherry är 587/610 nm (se fluorokromer används här i figur 2B). Baserat på denna information, Välj lämplig excitation och utsläpp filter för de önskade fluorokromer. Filtrera urval och skanning förfaranden måste optimeras för varje confocal mikroskopet. - För induktion av DNA lesioner, använda 64 linje sökningsläge, Stäng av WLL (i ' förvärv ' läge), slå på den externa UV-källan (på " UV laser " knappen), ange regionen av intresse (ROI) (i ' förvärv ' läge), och ange den 355-nm Laser till 100% effekt eller, alternativt, använda en 405-nm laserkälla.
Obs: I allmänhet lasereffekt justeras genom knappen lämplig laser justering i förvärvet bildläge. - För lokala microirradiation, använda lasrar som avger i nära UVA spektrumet. För microirradiation av ROI i kärnan och insamlingsavbildning, ställa in bakgrunden till noll i bildläge förvärv att reglera laser intensitet utanför ROI; om cellen bestrålas ordentligt, signalera av GFP-histonglykoprotein H2B försvinner, och, till exempel mCherry-taggade PCNA protein kommer att rekryteras till DNA skador omedelbart efter bestrålning ( figur 2B och Video 1 ).
Obs: En DNA-skada inducerad i ROI för en confocal avsnitt visas också i tredimensionella (3D) projektion (se 3D-rotation och x-y, x-z, y-z-projektionerna i figur 2 c och Video 2). Beskrivningar av de kompletta tekniska parametrarna för 355-nm och 405-nm lasrar, se Stixová o.a. 7 - efter the ROI har bestrålats, stänga av den externa UV-källan, Stäng av ROI, slå på WLL, ändra linje skanning till 8 och hitta en annan cell för bestrålning. För ROI urval, Använd knappen tillämpliga i programvaran ' s förvärv bildläge.
Obs: mCherry-PCNA har en maximal ackumulering topp DNA lesioner mellan 2 och 20 min ( figur 2B). Kontrollera resultatet på exogent proteinnivåer, Fortsätt med immunofluorescens färgning omedelbart efter lokala microirradiation. Välj bestrålning tidsintervall efter intresse. - Kontrollera att en ackumulation av exogena proteiner kan upptäckas i majoriteten av microirradiated celler. För denna kontroll, använda kriterierna i följande steg.
- Kontrollera att det inte finns någon överuttryck av exogent protein i normalnivå transfekterade celler. Som en möjlig lösning, välja celler med endast en svag uttryck av fluorescerande protein (t.ex., mCherry-PCNA eller mCherry-53BP1).
- Bedöma fototoxicitet av WLL exponeringen används för bild förvärvandet.
Obs: För fototoxicitet testning, exponera transfekterade celler till långvarig laser microirradiation och verifierar att celler fortsätter att Mitos som visas i figur 3A -B. Som en möjlig lösning, minska skanning tid och antal confocal skivor per cell, optimera 3D-scanning genom val av det optimala axiella steget (0,3 µm rekommenderas) och ställa in laser ' makt på sin minsta. Alternativt kan fototoxicitet som använder Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid, en vattenlöslig analog av E-vitamin) upplöst i odling mediet elimineras. För DNA-skada-relaterade experiment, det rekommenderas inte att använda av Trolox på grund av dess skyddande effekt mot UV-strålning. - När det gäller bestrålning med 355-nm laser, verifierar tillräcklig införlivandet av BrdU med hjälp av en lämplig BrdU detektionsantikropp från BrdU inkorporeringen kit (se Tabell för material). Eftersom BrdU inkorporeras i DNA under fasen S av cellcykeln, måste flertalet celler gå via i S-fasen under presensitization. Som en möjlig lösning, anser längden av cellcykeln, som är cellen-typ specifika.
- Analysera huruvida DNA reparation proteiner av intresse har en förmåga att känna igen DNA skador i specifik cell cykel faserna. En möjlig lösning: Kontrollera att rekrytering av valda proteiner till DNA lesioner är begränsad till specifika cellcykelns faser (G1/S/G2), använda HeLa-Fucci celler. Dessa celler uttrycker RFP-Cdt1 i G1 och tidiga S faser och GFP-märkta geminin i S/G2-M cellcykelns faser 22 ( figur 1).
- Att undvika apoptos, programmerad celldöd, Välj en lämplig laserkälla och laser power inställningen 23. Tänk på att bestrålade celler bör gå till Mitos ( figur 3A -B, Video 3).
Obs: Oönskade apoptos kan upptäckas av Annexin V positivitet, kaspas 3 eller lamin B klyvning. På den morfologiska nivån, cell lösgörande och bildandet av apoptotiska kroppar visas.
4. Immunofluorescens färgningen
- skölj celllagrar (växer i mikroskopet rätter) kort med 1 × PBS och efter sköljning, fixa celler med 4% formaldehyd i 10 min (för HeLa-derived cellinjer) eller 20 min (för D3 ES-celler) i rumstemperatur. Skölj skålen med 1 × PBS.
Varning: Formaldehyd orsakar allvarliga ögonskador, kan orsaka allergisk hudreaktion och är också potentiellt cancerframkallande; således alla experimentella åtgärder med formaldehyd ska utföras i en köksfläkt.
Obs: För att undvika onödiga blekning av fluorescens signaler, lagra skålen i en mörk kammare under inkubationstiden nödvändigt för immunofluorescens färgning. - Permeabilize celler med 0,1% Triton x-100 löses i H 2 O i 8 min, och sedan Inkubera cellerna för 12 min med 1 × PBS som innehåller 0,1% saponin och 0,1% Triton x-100. Efter inkubation, tvätta cellerna i 1 × PBS två gånger för 15 min.
- Inkubera cellerna med 1% BSA i 1 × PBS för 60 min att blockera ospecifik bindning av valda antikroppar. Tvätta cellerna i 1 × PBS för 15 min efter inkubation.
- Dilute primär antikropp i förhållandet 1: 100 (eller 1: 200) (detta steg måste optimized för enskilda antikroppar) i 1% BSA i 1 × PBS, använda 25 µL av denna lösning per maträtt och täcka cellerna med ett täckglas. Inkubera cellerna med lösningen innehållande den primär antikroppen i en fuktig kammare över natten vid 4 ° C.
- Följande dag, tvätta cellerna i 1 × PBS två gånger för 5 min.
- Späd den sekundära antikroppen i förhållandet 1: 100 (eller alternativt 1: 200) i 1% BSA i 1 × PBS, med 100 µL av denna lösning per maträtt, och täcka cellerna med ett täckglas. Inkubera cellerna med lösningen innehållande sekundära antikroppen för 60 min. Efter inkubation, tvätta cellerna i 1 × PBS tre gånger för 5 min.
- Montera täckglas med en droppe monteringsmedium och försegla täckglaset med nagellack eller lim för att förhindra uttorkning och rörelse under mikroskopisk observation. Lagra skålen i mörker vid 4 ° C.
5. Fluorescensmikroskopi livstid bild (FLIM)
- Start FLIM programvara. Öppna den " Application Suite " av programvaran och växla till den " FLIM " läge. Kontrollera att WLL fungerar i pulsad läge.
Obs: Operatören måste växla en maskinvaruknapp för att nå pulsläge. - Placera skålen som innehåller färgade celler (målat i avsnitt 4) på Mikroskop scenen i samma riktning som under lokala microirradiation, och hitta de bestrålade cellerna enligt gallren på petriskål. Utföra bild förvärvandet av confocal mikroskopet.
Obs: Använd följande inställningar: 1024 × 1024 pixlar, 400 Hz, dubbelriktad läge, 16 rader, zoom 8 x 12 x. - Innan du börjar FLIM mätning, utföra en preliminär test för att visa en realtid post av exponentiell förruttnelse, genom att klicka på " Setup FLIM " och " förvärv " och trycka på " kör FLIM test ". Optimera parametrarna FLIM för provet genom att bedöma de två viktigaste parametrarna enligt följande.
- Optimera andelen upprepning av WLL med excitation våglängden inställd på livstid av provet (se nedan). I confocal Mikroskop mjukvaran, justera laser intensitet med lämplig knapp, som kallas allmänt " laser inställning för " i den ' bild förvärv ' menyn. Sedan beräkna ett förfall kurva (eller histogram visar alla photon räknar) använda programvaran FLIM (se figur 4A -B).
Obs: Använd WLL i pulsläge för magnetisering. Programvaran måste utrustas med en puls picker för WLL, som tillåter val av andelen upprepning (80, 40, 20 eller 10 MHz). Magnetiseringen våglängd när det gäller fluorescens givaren, GFP, är 488 nm. Decay kurvan registreras använder arbetsytan för FLIM-programvara. Parametern (τ D, τ DA) visar exponentiell förruttnelse gånger (t.ex., fluorokrom livstid); parametern a representerar amplituden av fluorokrom decay (se exempel på FLIM data för GFP-märkta p53 och mCherry-taggade 53BP1 i figur 4A -B). - Kontrollera antalet upprepning kurs med hjälp av verktyget för förvärv av programvara (Välj repetition rate läge). Välj de ljusaste pixlarna i provet, kurvan för den ljusaste pixeln måste understiga 10% av totala fluorescensintensiteten.
- Optimera andelen upprepning av WLL med excitation våglängden inställd på livstid av provet (se nedan). I confocal Mikroskop mjukvaran, justera laser intensitet med lämplig knapp, som kallas allmänt " laser inställning för " i den ' bild förvärv ' menyn. Sedan beräkna ett förfall kurva (eller histogram visar alla photon räknar) använda programvaran FLIM (se figur 4A -B).
- Klicka på " mätning " och tryck på " kör FLIM ".
6. givarens livstid med en FLIM Script och beräkning av GRÄMA effektivitet
- Starta bandet-FLIM programvaran och öppna den ' givare ' arbetsyta.
- Välj det " analys " / " Imaging " fliken i menyn och starta FLIM skriptet genom att klicka på " börja ". För optimal bandet-FLIM inställningar, använda välkända samverkande protein partners.
Obs: FRET-FLIM effektiviteten för välkända interagerar partner GFP-p53 och mCherry-53BP1 var (34,1 ± 2,3) % ( figur 4 c). - Använd endast givare utsläpp kanal (kanal 1 eller 2) och tryck på " beräkna snabbt FLIM ".
Obs: Bilden grafen både uppdateras och. - i the FRET-FLIM programvara, ange intensitet skala (0 - 4000 räknas) och livstid skala (0 - 5 ns) manuellt i programvaran. Med detta synsätt, visualisera cellen av intresse och ställa bandet-FLIM mätningen.
Obs: Denna inställning eliminerar skillnader i fluorescensintensiteten bland enskilda celler i cell befolkningen. - i förfall form, Välj den passande modellen.
Obs: Vi rekommenderar n-exponentiell reconvolution och val av modell parametern " n ". En optimal passform har följande kriterier: den monterade kurva överlägg decay kurvan väl och χ 2 - värdet är lika med 1 ( figur 4B). - Välj det " tröskel " / " Använd tröskelvärde " och anger tröskelvärdet till 75. Starta " inledande Fit ".
Obs: Programvaran SPT64 beräknar genomsnittliga givarens livstid i avsaknad av bandet (" amplitud vägda genomsnittliga livslängden ", τ Av.Amp)
7. FRET effektivitet använder skriptet FLIM-bandet
- Välj arbetsytan givare/Acceptor och öppna sedan " analys " | " Imaging " | " livstid GRÄMA bild ".
- Välj bara givaren som aktiv kanal och justera Pixel Binning beroende på fotonen nummer/pixel. Kör sedan den programvara läge kallas " beräkna FastFLIM ". Om fotonen nummer/pixeln i bilden är låg, öka den Pixel Binning till 4 Poäng.
- Anger intensiteten till 0 - 200 räknas och livstid till 0 - 5 ns.
- Aktivera " användning tröskel " och ange ett tröskelvärde på 75.
- Inställt tillbehörsmodell " Multi-Exp. givare ", ange parametern modell " n ", ange τ Av.Amp (steg 6,6) som en τ D, och aktivera " inledande passar ".
- Ange parametrarna Bkgr Dec, Shift IRF och Bkgr IRF till konstanta värden genom att ta bort märket.
Obs: Ange de flesta parametrar ska förbli konstant som möjligt. Detta tillvägagångssätt minskar statistiska fluktuationer. I det här fallet inte trycker " inledande fit " igen. Beskrivningar av de nämnda parametrarna följer: IRF = Instrument svar funktion, BkgrDec = bakgrund från den exponentiella passformen, ShiftIRF = IRF Skift från exponentiell reconvolution passform, BkgrIRF = IRF bakgrund från exponentiell reconvolution passar. Alla tre parametrar beräknas och kan fastställas med hjälp av programvaran för vidare analys. - Press " beräkna FRETŔ en FRET bild (ritade i bildområdet FLIM) bandet effektivitet histogram beräknas och bandet avstånd histogram ritas ( figur 4 c). När bildanalys är klar, tryck på " Spara resultatet ".
Obs: Under bandet experimenten är det nödvändigt att överväga att fluorescerande proteiner uppvisar reversibel övergångar mellan lysrör (ljusa) och icke-fluorescerande (mörk) staterna. Denna egenskap kallas " blinkande ", och bandet effektivitet påverkas av detta fenomen (en förklaring av denna effekt var tillhandahålls av Vogerl et al. 24).
8. FRAP analys
- plats dish på Mikroskop scenen, hitta de transfekterade celler som uttrycker fluorescently märkta proteinet av intresse och utföra bild förvärv med ljusa fält mikroskopi med standard Mikroskop lampan (se figur 2Aa-b) och Fluorescence mikroskopi lägen.
- För bild förvärv, använder vitt ljus laser (WLL) ansluten till mikroskopet confocal (eller en laser val, enligt den valda fluorokrom). Använd följande inställningar: 512 × 512 pixlar, 1000 Hz, dubbelriktad läge, linje genomsnittet 1, zoom 8 x 12 x.
- Förvärva minst 15 prebleaching bilder (vid ~ 10% lasereffekt) och definiera regionen av intresse (ROI) i menyn bild förvärv.
- För fotoblekning experiment, använda en argon laser (488 nm). Tillämpa följande inställningar: frame upplösning 512 × 512 pixlar, 1000 Hz, dubbelriktad läge, zoom 8 x till 10 x.
Obs: Fluorokromer inklusive GFP, mCherry och RFP kan vara upphetsad av en argon laser arbetar på 488 nm eller 514 nm. - Använder den FRAP programvara mikroskopet val. Ställ in argon laser under fotoblekning, ' s makt att maximalt med hjälp av laser justering knappen. Utföra bild förvärv med 0.256 s mellanrum, 10% lasereffekt.
Obs: För postbleaching steg, Använd standard bild förvärv läget av mikroskopet confocal val.- Monitor fluorescens återhämtningstiden efter fotoblekning (upp till 45-50 s efter blekning ingreppet).
Obs: Som visas i figur 4 d, återhämtningstiden efter fotoblekning för mCherry-taggade 53BP1 är distinkt på spontana DNA skador och UVA-strålning-inducerad foci. mCherry-53BP1 på UVA lesioner återhämtade sig snabbt i jämförelse med mCherry-53BP1 ansamlingar på spontant förekommande DNA reparation foci; Se figur 4 d och Foltankova o.a. 25
- Monitor fluorescens återhämtningstiden efter fotoblekning (upp till 45-50 s efter blekning ingreppet).
- Exportera data från Mikroskop mjukvaran (eller programvara av val) till ett kalkylblad och utföra statistisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använder avancerad konfokalmikroskopi, observerat vi en ackumulering av mCherry-märkta 53BP1 och mCherry-PCNA proteiner vid DNA lesioner. Analyser utfördes av lokala microirradiation av levande celler. För att känna igen de nukleära spridningsmönster av DNA-reparation-relaterade proteiner i enskilda cellcykelns faser, vi använde Fucci cellulära systemet, genom vilken det är möjligt att fastställa den G1, tidig S, och G2 faser av cellen cykel (figur 1). Den biologiska tillämpningen av Fucci cellulära modellen som vi publicerade i Suchankova o.a. 26 visar att 53BP1 rekryterades till lokalt inducerad DNA lesioner i G1, S, och G2 faser av cellcykeln, som var associerade med funktionen av detta protein under icke-homolog slutet att gå (NHEJ), en av de viktigaste mekanismer som leder till dubbel-strand paus reparation. Å andra sidan, visade detta experimentella system oss enskilda cellnivå att proteinet PCNA, som är kopplad till den homologa rekombination reparera vägen (HRR), erkänner DSBs i sena S och G2 faser i cellcykeln 27. För studier på DNA reparation maskiner, vi har också optimerat bestrålningsvillkoren för att säkerställa att cellkulturer fortsatte att genomgå Mitos efter exponering för UV-lasrar (figur 3). Microirradiated celler som genomgår Mitos bevisa att DNA reparation intäkterna i ett relativt fysiologiska sätt och celler i dessa försöksbetingelser, inte har skadats av lasrar, som högre stödnivåer inducera apoptos. Här, visar vi också hur man tillämpa bandet-FLIM analys till karakterisering av DNA reparation proteiner. Denna avancerade teknik gör det möjligt för oss att studera lokala protein-protein interaktioner i cellkärnan eller, alternativt, proteininteraktioner i nukleolära regioner såsom nucleolus, nukleära lamina, eller kluster av Heterokromatin. För nybörjare i denna teknik, skulle vi vilja rekommendera optimera denna bandet-FLIM-teknik med hjälp av välkända samverkande protein partner som p53 och 53BP1 (figur 4A-C). I allmänhet leder en kunskap protein-protein interaktioner till förstå hur proteinkomplex reglera processer som replikering, gen aktivering, tysta eller DNA-reparation. Ett mycket användbart verktyg för studier av protein kinetik är dessutom metoden FRAP, som visar egenskaperna hos lokala protein diffusion och rörlighet (figur 4 d). Sammantaget tillhandahåller här vi metodiska anvisningar för ansökan avancerad konfokalmikroskopi tekniker i DNA reparation studier.
Figur 1: bildandet av DNA reparation foci kan studeras i HeLa-Fucci celler som uttrycker RFP-cdt1 (röd) i G1/tidiga S faser och GFP-geminin (grön) i S/G2 faser av cellcykeln. Spontant förekommande DNA lesioner positivt för 53BP1 protein (blå; Alexa 405 färgning), studerades i G1 (röd), tidig S (orange; uttryck för både RFP-cdt1 och GFP-geminin), och G2 (grön) faser av cellcykeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: rekrytering av mCherry-märkta PCNA på DNA skador över tid. (A) celler som uttrycker mCherry-PCNA (röd), var belägna på en inrutade Mikroskop maträtt i utvalda regioner (grå). Efter fixering och immunfärgning, bestrålade celler (gula pilar) var placerade enligt registrerade koordinater (se grå bokstaven K som ett exempel) (Aa-c). Den gul ram och pilar (Ad) visar cellen som var microirradiated och förstorade i paneler Ae-f. (B) ackumulering av mCherry-PCNA (röd) studerades i HeLa cells stabilt uttrycker GFP-märkta Histon H2B (grön). Celler övervakades omedelbart efter lokala microirradiation för upp till 35 min (se Video 1). (C) Microirradiated celler analyserades av 3D konfokalmikroskopi, och protein ackumulering vid DNA lesioner (t.ex., mCherry-53BP1) hittades i alla tre dimensioner (x-y, x-z, och y-z) även om endast midsection av cellkärnan var microirradiated (se 3D-cell rotation i Video 2 3D prognoserna i figur 2 c). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: celler microirradiated av en 405-nm laserdiod fortskrida normalt genom cellcykeln. (A) efter bestrålning med en 405-nm diode laser, HeLa cells (stabilt uttrycker GFP-histonglykoprotein H2B; grön) genomgå Mitos (se även Video 2). Gula pilar och ramar anger bestrålade ROI i markerade celler. Vita ramar Visa Mitos. (B) på samma experimentella villkor observerades också Mitos i bestrålade celler av time lapse mikroskopi i HeLa cells stabilt uttrycker GFP-H2B (grön) och övergående uttrycker mCherry-PCNA (röd). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: FLIM och bandet-FLIM analys av GFP-p53 och mCherry-53BP1. Fluorescens resonans energi överföring (bandet) upptäcks av FLIM och tillämpningen av fluorescens återhämtning efter fotoblekning(FRAP) på olika DNA lesioner. ( A-C) I genomsnitt (n = 10) livstidar av GFP-märkta p53 i frånvaro och närvaro av acceptor (mCherry-53BP1), mätt i hela nonreplicating HeLa cellkärnor. (A) representativa fluorescens decay kurvor och residualer studerade i HeLa cells normalnivå uttrycker GFP-p53 (givare-bara, τD) eller GFP-p53 och mCherry-53BP1 (givare – acceptor, τDA). (B) Averaged livstid (τ1 - τ3) och amplituder (en1 -3) av (en) god Jordbrukarsed-p53 och (b) mCherry-53BP1 mäts i hela HeLa cellkärnor. Χ2 -värden beräknades också och visas. (C) Sammanfattning av bandet effektivitet för välkända samverkande partner GFP-p53 och mCherry-53BP1. Skala barer = 4-5 µm. bandet-FLIM resultatet visar ~ 35% bandet effektivitet för välkända interagerar samarbetspartners GFP-märkta p53 och mCherry-taggade 53BP1. (D) Återhämtning kinetik av mCherry-53BP1 studerade vid spontant förekommande DNA lesioner (grön kurva) och UVA-inducerad DNA lesioner (blå kurva). mCherry på DNA lesioner var blekt till nivån för bakgrunden (spridda form av protein mCherry-53BP1 protein) och bakgrunden fluorescensen var subtraheras från varje värde. DATA, visas som relativa fluorescensintensiteten hos mCherry-53BP1, presenteras som medel ± medelfel. Students t-test visade en statistiskt signifikant skillnad mellan två typer av DNA lesioner (* visar p ≤0.05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: rekrytering av mCherry-märkta PCNA protein (röd fluorescens) till DNA lesioner inducerats av lokala microirradiation i HeLa celler stabilt uttrycker GFP-märkta Histon H2B (grön fluorescens). Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Video 2: ansamling av mCherry-märkta 53BP1 protein (röd fluorescens) på DNA lesioner inducerats av lokala microirradiation i HeLa cells. Cellkärnan visas i 3D-rymden en programvaru-läge som möjliggör visualisering av cell rotation i rymden. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Video 3: Microirradiated HeLa cells stabilt uttrycker GFP-märkta Histon H2B (grön fluorescens) Fortsätt genom Mitos. Bestrålade regionen kännetecknas av utarmning av GFP-H2B (svart regioner är bestrålade remsor inne i cellkärnan). Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroskopi tekniker utgör grundläggande verktyg i forskningslaboratorier. Här en kort beskrivning av metoderna som används för studier av protein rekrytering och kinetik på DNA lesioner presenteras. Noterade vi särskilt våra experimentella erfarenheter inom lokala microirradiation av levande celler, och vi diskutera studiet av protein kinetik av FRAP och protein-protein interaktioner på DNA skador av acceptor-blekning bandet28 och dess avancerade ändring bandet-FLIM (figur 4A-D). De metoder som visas här är viktiga verktyg för en verklig förståelse av processer för DNA-reparationer, särskilt protein kinetics i levande cellulära system, som inspekteras av avancerade confocal Mikroskop6,7,8, 28. Dessa metoder är av enorm nytta till framtida medicin i hanteringen med effekterna av strålbehandling på vävnader eller karakterisera tumör cellmorfologi. För att optimera denna metod, skulle vi vilja rekommendera börjar med välkända samverkande protein partner, som visas i figur 4 c.
Det är välkänt att protein rekrytering till DNA lesioner är mycket dynamisk och tidsberoende; inte bara inom grundläggande vetenskap utan också i kliniker26krävs således tillämpningen av time-lapse konfokalmikroskopi efter cell bestrålning. Lokalt inducerad DNA skador på grund av laser microirradiation9,28,29 representerar genomisk områden där det är möjligt att studera proteinbindning rekrytering, protein-protein eller protein-DNA och interaktion. Utgångspunkten för dessa metoder är att rekryteringen av exogena proteiner måste verifieras genom lämpliga antikroppar på endogena nivå. Nästa, den kritiska steget av sådana experiment är att alltför transfekterade celler kan ge falskt positiva resultat. Således är det bästa beslutet att upprätta cellinjer stabilt uttrycker de fluorescently märkta proteinerna av intresse. Dessutom på grund av de fototoxiska effekterna av lasrar används för bild förvärvandet, antingen villkoren för skanning måste optimeras eller Trolox förening måste upplösas i cell odling medium. Dessutom elimineringen av det presensitization steget innan bestrålning rekommenderas. Efter lokala microirradiation, DNA-reparation måste fortsätta så att cellerna genomgår Mitos ()figur 3A-B och Video 3). Induktion av apoptos efter laser irradiation är en mindre värdefull process från beskåda av optimal DNA reparation23. Det är också uppenbart att vissa proteiner för DNA-reparation erkänna DNA-skador endast i specifika cellcykelns faser (t.ex., det Bártová o.a. 30). således användningen av det HeLa-Fucci mobilsystem, visar cellerna i de enskilda faserna i interphasen, är ett användbart verktyg för studier av DNA skada svar. Dessutom kan cellcykelns faser erkännas enligt den nukleära spridningsbild av PCNA protein31.
Det är väl känt att metoderna FRAP och bandet utgör mycket användbara verktyg för att undersöka egenskaperna hos proteiner som rekryteras till DNA lesioner7,8,32. Dessutom kan den FLIM teknik32 avslöja information om dynamiska konfirmerande ändringarna av de proteiner som ackumuleras på DNA lesioner. Användningen av denna metod är viktigt eftersom FLIM mäter dynamiska cellulära processer direkt; steady state fluorescensintensiteten mäts således över tid. FLIM metoder ökar bildens kontrast genom att eliminera bakgrund fluorescens. Detta är en fördel med bandet-FLIM mätning jämfört med konventionella acceptor-blekning bandet. Fluorescens livstider mäts av FLIM innehåller information om fraktionerna av fluorescently märkta proteiner och visa hur heterogen sonder beror på miljöfaktorer. FLIM är också bäst och mest pålitliga biofysiska tillvägagångssätt att utföra bandet för protein-protein interaktioner i levande celler32,33.
Sammantaget har alla beskrivna metoder potential att avslöja nya mekanismer av DNA skada svar i mänskliga celler, vilket är viktigt särskilt för radioterapeutiska metoder. Exempelvis har multiphoton FLIM tillämpats för att få högupplösta bilder i medicin, där den kallas multiphoton tomografi34. Mycket sofistikerad mikroskopiska metoden kan tillämpas i kliniker för diagnos med histochemical prover och analyseras med hög upplösning. FLIM metoder kan dessutom ge en exakt analys av tumör cell ytor enligt deras autofluorescens. En nackdel med metoden FLIM-bandet är dess mycket sofistikerad programvara bakgrund, som måste förstås fullt av mikroskopet operatören. Ytterligare kommer biologiska relevansen av FLIM data, i allmänhet och i processer för DNA-reparationer, säkerligen att avslöjas inom en snar framtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Grant byrån i Tjeckien, projektet P302-12-G157. Experiment stöddes också av den tjeckiska-norska forskning programmet CZ09, som övervakas av norska medel och av ministeriet för utbildning, ungdom och idrott i Tjeckien (bevilja nummer: 7F14369).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell cultivation | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
| DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
| DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
| Trypsin - EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
| Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
| µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
| 0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell transfection | |||
| GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
| mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
| Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
| 10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
| 5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscopy | |||
| Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| White-light laser | Leica Microsystems | ||
| 355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
| 405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence staining | |||
| Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
| AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |
References
- Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).
- Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair. J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).
- Lahtz, C., et al. Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells. PLoS One. 7 (9), e44858 (2012).
- Cremer, T., et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).
- Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes. Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).
- Bartova, E., et al. Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells. PLoS One. 6 (12), e27281 (2011).
- Stixova, L., et al. HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39 (2014).
- Stixova, L., et al. Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus. Folia Biol (Praha). 60, Suppl 1. 76-84 (2014).
- Luijsterburg, M. S., et al. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).
- Bartova, E., et al. Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies. Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).
- Franek, M., et al. Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections. Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).
- Lemmer, P., et al. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range. J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).
- Lakowitz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , 3rd ed, Springers Science+Business Media, LLC. New York, USA. (2006).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
- Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
- Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).
- Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).
- Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages. J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence. Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).
- Sorokin, D. V., et al. Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS One. 7 (11), e49593 (2012).
- Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions. Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).
- Suchankova, J., et al. Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).
- Bártová, E., et al. PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma. , (2017).
- Krejci, J., et al. Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm. J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).
- Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).
- Sustackova, G., et al. Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin. J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).
- Smirnov, E., et al. Separation of replication and transcription domains in nucleoli. J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).
- Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
- Day, R. N. Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
- Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 66 (2), 230-236 (2014).
