Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

התכנות ראשי מי שפיר ו ממברנות התאים כדי Pluripotency בתנאים קסנו-חופשית

doi: 10.3791/56003 Published: November 27, 2017

Summary

פרוטוקול זה מתאר את התכנות של ראשי מי השפיר נוזל לבין הממברנה בתאי גזע mesenchymal לתוך תאי גזע pluripotent המושרה באמצעות גישה episomal-שילוב בתנאים מוגדרים לחלוטין מבחינה כימית. תהליכי מיצוי, תרבות, התכנות, ואפיון של תאי גזע pluripotent המושרה הנוצרת על ידי שיטות מחמירים מפורטים.

Abstract

טיפולים מבוססי תאים עצמיים יש צעד אחד קדימה למציאות עם כניסתה של גזע pluripotent המושרה. תאי גזע עובריים, כגון מי שפיר והממברנה בתאי גזע mesenchymal, מייצגים סוג ייחודי של תאים מובחן עם הבטחה הנדסת רקמות, עבור התכנות לתוך iPSC התערבויות רפואת העתיד, תאי גזע, בנקאות. פרוטוקול המובאת כאן מתאר הליך בלתי אופטימליים עבור חילוץ ו culturing ראשי מי השפיר נוזל לבין הממברנה בתאי גזע mesenchymal, הפקת episomal המושרה בתאי גזע pluripotent של תאים אלה בתרבות מוגדרים לחלוטין מבחינה כימית תנאים ניצול אנושי vitronectin רקומביננטי והמדיום E8. אפיון של הקווים החדשים על-ידי החלת שיטות מחמירים – cytometry זרימה, הדמיה קונאפוקלית, טרטומה היווצרות ו פרופיל תעתיק – גם מתואר. הקווים החדש שנוצר אקספרס סמנים של תאי גזע עובריים – Oct3/4A, Nanog, Sox2, טרה-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – בעת היותו שלילי עבור דה מרקר SSEA-1. הקווים תאי גזע טופס teratomas בעכברים scid-בז ' ב- 6-8 שבועות ומכילים teratomas רקמות נציג של כל שלוש שכבות הנבט. פרופיל תעתיק של הקווים על ידי הגשת נתונים microarray ביטוי הכללית באלגוריתם הערכה pluripotency bioinformatic ייחשב כל קווי pluripotent, לכן, גישה זו היא חלופה אטרקטיבית לניסויים בבעלי חיים. הקווים iPSC החדש יכול לשמש בקלות בניסויים במורד הזרם מעורבים אופטימיזציה של בידול והנדסת רקמות.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הטכנולוגיה של תאי גזע pluripotent מושרה (iPSC) מביא על פוטנציאל התא החלפת טיפולים, מחלות, מודלים התפתחותיים, ואת סמים ההקרנה רעילות1,2,3. החלפת טיפולים מושגית יכולה להיות מושגת על ידי הזרקת תא, הפריה הבדיל השרשה רקמות (כגון תיקוני הלב), או מודרכת התחדשות של הנדסת רקמות. מי שפיר (AFSC), קרום תאי גזע (AMSC) הם מקור מצוין של תאים עבור התערבויות אלה גם ישירות4,5,6,7 או כאוכלוסייה התא ההתחלתי עבור התכנות לתוך pluripotency8,9,10,11,12.

גישות מוקדם בשימוש מערכות התרבות לא מוגדר או התכנות בפעולות שירות הדורשות אינטגרציה הגנומי קשור בתזמון של בונה9,10,11,12. מחקר עדכני יותר מועסקים מדיום קסנו-חופשית, אף-על-פי מטריצה מצורף קרום המרתף פחות מוגדר (BMM) שימש, כדי ליצור iPSC מתאי אפיתל נוזל מי השפיר. עם זאת, וזמינותו היווצרות טרטומה שאינו נכלל את המחקר יחד עם שפע של הפריה הנתונים המולקולריים. נמצאו תאים אפיתל נוזל מי השפיר יש בערך 8-fold יעילות גבוהה יותר התיכנות בהשוואה neonatal fibroblasts13. במחקר אחר, גזע mesenchymal של נוזל מי השפיר נמצאו גם כדי לתכנת לתוך iPSC עם הרבה יותר יעילות12.

גזע pluripotent יכול להיות מובחן רקמות נציגם של כל שכבות הנבט 3, ולכן יש את הפוטנציאל הרחב ביותר. ילדים יכולים להרוויח מן קציר, התכנות, הנדסת רקמות של שלהם תאי גזע של נוזל מי השפיר עצמיים prenatally, קרום מי השפיר גזע תאים perinatally. יתר על כן, הנמוכות יחסית של ההתמיינות של תאי גזע עובריים (נמוך יותר מאשר14,תאי גזע בוגרים15) יכול לסייע באופן תיאורטי בהתייחסות השמירה שנצפו של epigenetic הטיה מתאי המקור iPSC16.

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור התכנות השפיר, קרום תאי גזע כדי pluripotency ב מוגדרים כימי בינוני E8 קסנו-חופשית vitronectin רקומביננטי17 . עולמיים בנויים (. לצרכיך המדויקים) בעזרת פלסמידים episomal18. היתרון העיקרי של נוזל מי השפיר ותאי ממברנה כמקור של תאים עבור התכנות טמון זמינותם מראש, perinatally ובכך גישה זו בעיקר ירוויחו מחקר לתוך הנדסת רקמות לילדים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הפרוטוקול מנחים המוסדי של ועדת האתיקה למחקר אנושי. הסכמה בכתב של המטופל הושג באמצעות השפיר למחקר.

פרוטוקול זה מלווה את מדיניות ראש הוועדה אכפת לי חיה מוסדיים שימוש של אוניברסיטת דרום אלבמה.

1. בידוד והתרבות של ראשי מי השפיר בתאי גזע Mesenchymal

  1. ציפוי של תאים נוזל מי השפיר
    1. להשיג מינימום של 2.5 מ של נוזל מי השפיר שנקטפו בתהליך בדיקת מי שפיר על ידי רופא.
      הערה: כל טיפול של תאים חיים ורקמות חייב להתבצע ב- cabinet רקמות סטריליים-תרבות, ציוד מגן אישי מתאים צריך לשמש. היכרות עם התרבות התא הבסיסי סטרילי טכניקה זו נדרשת.
    2. להכין מי השפיר נוזל לבין קרום התא (AFMC) תרבות המדיום: בינוני הבזליים EBM-2, 15% סרום שור עוברית (FBS), 20 ng/mL של bFGF, 25 ננוגרם למ"ל של EGF, 10 ננוגרם למ"ל של IGF. תרבות של תאי גזע ראשי קרום מי השפיר נוזלים, כמו גם מי השפיר, המדיום להשלימה בעזרת פתרון אנטיביוטיקה-antimycotic.
    3. ביום 0, מערבבים 2.5 מ של נוזל מי השפיר עם 3.5 מ של AFMC תרבות בינוני וצלחת לתוך בקבוקון T25. דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור הפרעה לפני בדיקת נוכחות של מושבות לפחות 48 שעות.
    4. יום 5, מושבות תאים חסיד צריך להיות נוכח. רוק בעדינות את הבקבוק מכך שהתאים לא לגמרי לדבוק התחתון ופסולת, ואקום-לשאוב התערובת בילה נוזל מי השפיר/בינונית בעזרת פיפטה של פסטר. החלף 5 מ של טרי AFMC בינונית.
    5. תרבות עוד 5 ימים. לשנות בינוני בכל יום כפי שמתואר בשלב 1.1.4.
  2. בידוד של גזע mesenchymal העיקרי של האדם השפיר
    1. להשיג מאחד לשני במהירות האפשרית לאחר הלידה, תוך 24 שעות לכל המאוחר, כדי למקסם את תקינות הסלולר. לחתוך קטע2 9 ס מ השפיר, להסיר קרישי דם ולשטוף בשפופרת צנטרפוגה 50 מ עם 30 מ של PBS בתוספת אנטיביוטיקה-antimycotic פתרון.
    2. מינצ הממברנות בעזרת זוג ואזמלי מנתחים משובח חתיכות בצלחת תרביות רקמה סטרילי 10 ס מ. העיכול של הממברנות, החילוץ של התאים תושג באמצעות מערכת דיסוציאציה רקמות. פעלתי לפי הנהלים של היצרן
      הערה: עדינה את החתיכות של הרקמה לאחר לקמץ, גבוה יותר מספרי הטלפון הנייד התאוששה לאחר עיכול.
    3. העברת המסה רקמת קרום טחון באמצעות את להבים ומהדקים לתוך צינור דיסוציאציה רקמה אחת ומערבבים עם 4.7 mL RPMI 1640 בינוני. מערבבים את האנזים דיסוציאציה (ראה טבלה של חומרים).
    4. הר הצינורות אל dissociator רקמת ולהפעיל תוכנית "h_tumor_01". דגירה הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס על פלטפורמה נדנדה למשך 30 דקות.
    5. בהמשך לדלל את המתלים 35 מ של RPMI 1640 ולהחיל על מסננת מיקרומטר 70 הניח על שפופרת צנטרפוגה אוסף 50 מ.
    6. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב g 200 x בטמפרטורת החדר, להשליך תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 5 מ של RPMI 1640, לספור את התאים באמצעות hemacytometer ואת צלחת על צפיפות של תאים/ס מ 10,0002 לתוך כלי שטופלו תרביות רקמה עם טרי מוכן AFMC בינוני בתוספת אנטיביוטיקה-antimycotic פתרון.
      הערה: במקרה של עיכול לא שלם, חתיכות קטנות של רקמות יהיה נוכח, תאים בודדים יהיה מצומצם. ספין למטה שוב, צלחת בגדר כולו לתוך הבקבוק T75 אחד.
  3. תרבות של ראשי AFSC, AMSC
    1. מושבות מעבר של AFSC/AMSC מאת כ רפה-בעברית ואקום בילה בינונית בעזרת פיפטה פסטר והוספת 2 מ ל אנזים ניתוק התא לתוך הבקבוק. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5-8 דקות.
    2. הקש על הבקבוק כדי לעזור לסלק את התאים ומערבבים את המתלים עם אמצעי אחסון שווה AFMC בינוני (תוספת אנטיביוטיקה-antimycotic לא צריך להיות הכרחי מנקודה זו ואילך). צנטריפוגה-200 גרם 4-5 דקות להסיר תגובת שיקוע באמצעות זכוכית או פיפטה פסטר או פשוט על-ידי היפוך הצינור וריקון זה לתוך מיכל פסולת.
    3. גלול לתחתית הצינור צנטריפוגה להיפרד בגדר להשעיה תא בודד בתיבה הנפתחת הנותרים של נוזל ולערבב עם AFMC בינוני עבור ציפוי. הצלחת לתוך T-מבחנות צפיפות בין 2,500 ל- 5,000 תאים/ס מ2.
    4. שינוי בינוני בכל יום אחר. לא תרבות הקווים תא מעבר פסקה 6. עבור התכנות למטרות, להשתמש בתור נמוכה מעבר ככל האפשר.
    5. התכונן מניות קפוא של AFSC ושל AMSC גיבויים באמצעות הקפאה בינוני. הקציר תרבויות באמצעות אנזים ניתוק התא, צנטריפוגה-200 גרם עבור 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    6. הסר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה פסטר וחבוט התחתון של צינור כדי singularize התאים בגדר. Resuspend במדיום הקפאה מוחלטת על צפיפות של 1 × 106/mL ו aliquot לתוך cryovials. לאחסן במיכל ההקפאה ללון ב- 80 מעלות צלזיוס. ולאחר מכן להעביר חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

2. התכנות לתוך Pluripotency

  1. להשיג את התיכנות פלסמידים
    1. לרכוש את פלסמידים התיכנות דרך מאגר פלסמיד ללא כוונת רווח. הסכם העברת חומר נדרש.
    2. להפוך את פלסמידים לתאים המוסמכת e. Coli ו לבודד את פלסמידים באמצעות ערכת חילוץ פלסמיד מסחרי. בצע הוראות היצרן.
    3. מודדים את ריכוז פלסמיד הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים. המטרה עבור ריכוז גבוה פלסמיד וכתוצאה מכך, באופן אידיאלי בסביבות 1 µg µL כדי למנוע דילול של המדגם במהלך תרביות תאים.
    4. למדוד את ריכוזי פלסמידים בודדים באמצעות UV-ספקטרופוטומטרים aliquot אותם בנפרד.
    5. מערבבים יחד 3 µg 3 µg, 2 µg של פלסמידים EN2K, ET2K ו- M2L, בהתאמה. זהו הפתרון פלסמיד התיכנות. הכמות של פלסמיד הפתרון הוא מספיק כדי transfect עונה 1 פרק 106 תאים. הכן מספר aliquots כזה.
    6. לאחסן כל aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת לוחות תרבות היעד
    1. מעיל לוח 6-ובכן אחד עם vitronectin – מוסיפים 1 מ"ל vitronectin דילול מאגר לבאר כל ומערבבים ב 40 µL של פתרון מניות עולמיים בנויים לצרכיך המדויקים (1 µg/cm2). להשאיר בטמפרטורת החדר (RT) או בחממה ב 37 ° C עבור 1 h.
    2. ואקום-לשאוב הפתרון בעזרת פיפטה פסטר והחלף 2 מ של AFMC במדיום מכל קידוח. לאחסן ב 37 ° C עד התאים הם כדי להיות מצופה.
      הערה: חשוב: AFMC אופן השימוש בשלב זה אינו אמור להכיל את כל פתרונות לאנטיביוטיקה או antimycotic.
  3. קציר תרבותי AFSC ראשי/AMSC
    הערה: הרחב AFSC/AMSC בתרבות מספיק כדי להפוך את מניות הקפוא במספר נמוך מעבר ולהקדיש את הבקבוק T-75 אחד עבור התכנות. מאז מעטים כמו תאים 100,000 מספיקים ניסוי, לכוון קציר בסביבות 500,000 תאים כדי לפצות על ההפסדים ואם אופטימיזציה של תרביות תאים פרמטרים או תרבות אחרת תנאים הם להיבדק.
    1. בזמן שנוחהמוקדם-קטע נמוך, לקצור את AFSC/AMSC באמצעות תא ניתוק אנזים מיקס כפי שמתואר בשלב 1.3.1 כדי 1.3.2. אחרי שיש כבר centrifuged את התאים, המשך לשלב הבא.
    2. Resuspend בגדר ב 1 מ"ל של PBS, לערבב היטב כדי לשטוף את הנסיוב רכיבים. לספור את התאים באמצעות hemacytometer. להתאים את צפיפות התאים עד 100,000/מ"ל של PBS ו aliquot לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL. פעולה זו מבטיחה זמן קשר מינימלי בלבד בין התאים המאגר המשמש עבור תרביות תאים.
    3. למקם את הצינור microcentrifuge על גבי צינורות פוליסטירן 5 מ"ל (כמו מתאמים, יאפשר צנטריפוגה ברוטור הנדנדה רגיל), צנטריפוגה ב 200 x g עבור 4 דקות בטמפרטורת החדר. היפוך הצינורות ולמחוק את תגובת שיקוע לתוך מיכל פסולת. אל תשתמש רוטור קבוע-זווית.
    4. לבצע צעד צנטריפוגה נוספים ב 200 x g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. זה יאפשר הנותרים נוזלי מהקירות של הצינור כדי לאסוף בתחתית. בזהירות תשאף כל זה בעזרת פיפטה 200 µL.
  4. תרביות תאים עם התכנות פלסמידים
    1. עבור התכנות ניסויים, מערכת תקנים (ראה טבלה של חומרים) ישמש כדי לספק פלסמידים התיכנות לתוך התאים. הצב טיפים תרביות תאים, צינורות תרביות תאים, מאגר resuspension, מאגר electrolytic אל הארון תרביות רקמה. ריאגנטים ערכת נשמרים RT עד שהם נפתחים, ואז הם מאוחסנים ב 4 º C.
      הערה: אנו משתמשים הגירסה µL 10 של הערכה.
    2. להעביר ההתקן תרביות תאים סגור כך ניתן להציב את תחנת הרכבת התחתית שלה ישירות לתוך הקבינט. מילוי שפופרת אחת תרביות תאים עם 3 מ"ל של מאגר electrolytic והר הצינור לתחנה על-ידי דחיפתו כל הדרך בתוך החריץ.
    3. לקחת פלסמיד התיכנות aliquots פתרון מוכן בשלב 2.1.5 מהאחסון-80 ° C ולאפשר להם להפשיר ב RT בתרבות הקבינט.
    4. על המכשיר תרביות תאים, בחר את הפרמטרים הבאים של תרביות תאים: 950 V, 40 ms, ודופק 1.
    5. Resuspend בגדר המכיל תאים 100,000 במאגר resuspension µL 10. עובדים במהירות מהנקודה הזו מאז resuspension מאגר רעיל במקצת ותוצאות זמן חשיפה מוגברת של הכדאיות נמוכה באופן ניכר התא.
    6. מערבבים 1/10 של הפתרון פלסמיד התיכנות (הפתרון aliquot הוכן עבור סכום כולל של עונה 1 פרק 106 תאים).
    7. הר טיפ תרביות תאים על פיפטה תרביות תאים.
    8. האחות התליה תא לתוך קצה תרביות תאים בקפידה, הימנעות היווצרות בועות אוויר. אם בועות. מובחנות, לגרש את המתלים וחזור על השאיפה. בועות אוויר לעכב תרביות תאים.
    9. להוסיף את פיפטה תרביות תאים לתוך הצינור תרביות תאים, לחץ על לחצן "התחל" על המסך של המכשיר תרביות תאים. נחכה להודעה מסך להודיע על ההצלחה של תרביות תאים ולהסיר את פיפטה מהצינור מיד.
    10. לגרש את המתלים 1 טוב של 6-ובכן המטרה צלחת מוכן בסעיף 2.2. מערבבים את האמצעי השכנה טוב ולהפיץ ההשעיה באופן שווה לתוך שתי בארות (צפיפות התא שיתקבל יהיה 50,000/טוב).
    11. חזור על תרביות של תאים עבור כל צינורות microcentrifuge המכיל AFSC/AMSC בנפרד. מקם את הצלחת לתוך החממה-CO 37 ° C ו-5%2.
  5. תרבות של transfected AFSC/AMSC
    1. התרבות התאים transfected 2-5 ימים. ואז לעבור בינוני התיכנות המורכב E8 בתוספת 100 מיקרומטר של נתרן butyrate ביום השלישי.
      הערה: ניתן לבצע מעבר משני כדי למנוע צמיחת יתר של המקור AFSC/AMSC. עם זאת, passaging תגרום להשבתת האפשרות לחשב את יעילות התיכנות כראוי אם הפרמטר זה עניין.
    2. לשנות את המדיום התיכנות כל יום כל יום אחר במשך 10 ימים. מחליף המדיום כל יום מיום 10
  6. איסוף ידני של המושבות reprogramed באופן מלא עבור משובט הרחבה
    1. המושבות היו מלא מופיעים סביב היום ה-14. לאפשר מושבות להרחיב במידה ולהיות קומפקטיים. הם יכולים להיות ידנית בחרה והעבירו ללוחות טריים מוקדם ככל יום 15-16.
    2. h 1 לפני ההליך האיסוף, מעיל טוב 24 צלחות עם µL 8 של עולמיים בנויים לצרכיך המדויקים ב- 300 µL vitronectin מאגר דילול לכל טוב (1 µg/cm2), דגירה RT או 37 מעלות צלזיוס. החלף את הפתרון E8 בינונית ללא סודיום butyrate.
    3. בחר מושבות במידה מספקת (אידיאלי מעל 400 מיקרומטר בקוטר) בתרבות סטרילי בארון. ניתן להשתמש במיקרוסקופ ניגוד שלב או של stereomicroscope.
    4. עבור איסוף, מיקרוסקופ הדמיה LCD להציב בתוך הארון ישמש מאז שלה צג מבטל את הצורך oculars. לחטא את הבמה מיקרוסקופ עם 70% אתנול.
    5. באמצעות מיקרוסקופ תרבות תא רגיל ניגודיות שלב, בחר, לסמן ורשום את מספר מושבות לאסוף אותם. זה חשוב לוודא זמן לא מבוזבז עבור תהליך זה במהלך האיסוף בפועל.
    6. למלא מספר המבחנות זה שווה או גדול יותר ממספר מושבות לאסוף אותם עם 30 µL של חומצה ethylenediaminetetraacetic 0.5 מ מ (EDTA) ב- PBS. מושבות יוצב לתוך הצינורות האלה על דיסוציאציה חלקית לפני ציפוי.
    7. מתכנן לאסוף 5 מושבות בכל פעם מן הלוחות בעזרת פיפטה של 10 µL מוגדר µL 2. להחזיק את הקצה פיפטה בזווית בקצה המושבה, בזהירות ובהדרגה לגרד כל המושבה מעל פני השטח. מיד תשאף כל המושבה לתוך קצה פיפטה ולהעביר אותו לאחת המבחנות מוכן עם EDTA.
    8. חזור עם המושבות 4 הנותרים. תקופת דגירה-RT של 4-6 דקות.
    9. Pipet התליה למעלה ולמטה בעדינות באמצעות טיפ פיפטה גדול יותר כדי לשבור את המושבה לתוך גושים קטנים יותר. הימנע מיצירת השעיה תא בודד.
    10. צלחת ההשעיה ישירות לתוך יעד טוב של צלחת 24-ובכן מוכן בשלב 2.6.2. חזור עם המושבות הנותרים.
    11. חזור על שלבים 2.6.6 דרך 2.6.10 אם המושבות יותר מ-5 להיבחר אך לא לקחת יותר מ-5 מושבות בכל פעם. דגירה-CO 37 ° C ו-5%2.
  7. משובט הרחבה, ההבשלה של iPSC
    1. לאפשר מושבות לגדול ולהיות קומפקטיים. 3-6 ימים מספיקים. לשנות את המדיום תרבות מדי יום. השתמש בין µL 400 מ ל 1 בינוני E8 בהתבסס על צפיפות התאים.
    2. הבארות של צלחת 24-ובכן עם צפיפות המושבה מספקת תורחב לוחות 6-. טוב. h 1 לפני passaging, מעיל טוב 6 הצלחות עם עולמיים בנויים לצרכיך המדויקים (כמו שלב 2.2.1). לאחר מכן להחליף את הפתרון בבאר עם 2 מיליליטר E8 בינוני לכל טוב.
    3. האחות המדיום בילה מן הבארות המקור באמצעות פיפטה 1 מ"ל והחלף 300 µL של 0.5 מ מ EDTA לשטוף. האחות מיידי באמצעות הטיפ פיפטה באותו להחליף µL 300 של 0.5 מ מ EDTA שוב ואז דגירה-RT עבור 5 דק תשאף כל נוזל באמצעות פיפטה של 1 מ"ל.
    4. הגדר את פיפטה 1 מ"ל קיבולת, הר טיפ נשא רחב 1 מ"ל על זה ולאחר תשאף והמדיום E8 מן המטרה היטב לתוך הקצה. לשטוף את התרבות iPSC מקור עם זרם של המדיום.
    5. להעביר את המתלים לתוך יעד טוב ו pipet לאורך מספר פעמים כדי לשבור את המושבות לתוך גושים של תאים 20-50. ודא כי הם לקבל מופץ באופן שווה בתוך הבאר על ידי עדין נדנדה וניער את הצלחת, דגירה-CO 37 ° C ו-5%2.
    6. לשנות את בינוני מדי יום ואת המעבר כל 3-4 ימים. כל המושבות המבדילים ניתן לסמן במיקרוסקופ ניגוד שלב והוציאו באמצעות טיפ פיפטה בתרבות בארון. דבר זה מאפשר הפצה סלקטיבית של תרבות iPSC טהור באיכות גבוהה.
    7. h 1 לפני passaging, מעיל הבארות של צלחת 6-ובכן עם עולמיים בנויים לצרכיך המדויקים כמו שלב 2.2.1. לאחר מכן להחליף את הפתרון עם 2 מיליליטר E8 בינוני לכל טוב.
    8. Passaging שגרתית דומה ראשוני passaging נעשה שימוש 0.5 מ מ EDTA (שלבים 2.7.2 כדי 2.7.5). החלף בילה במדיום אחד טוב של צלחת 6-ובכן 1 מ"ל של EDTA כדי לשטוף ולמחוק.
    9. להוסיף 1 מ"ל של EDTA, דגירה-RT למשך 5-7 דקות על דיסוציאציה חלקית. למטב את זמן הדגירה אם יש צורך, מוודא השעיה של סביב 20-50-לתא גושים מופק. הימנע דיסוציאציה לתוך תאים בודדים.
    10. לבטל את הפתרון EDTA, תשאף 1 מ"ל של המדיום E8 באמצעות פיפטה של 1 מ"ל מן המטרה גם לתוך טיפ רחב נשא פיפטה.
    11. לשטוף את התרבות iPSC מקור עם זרם של המדיום E8 שוב ושוב עד חלקו הרצוי שוחרר מפני השטח ולהעביר לתוך היעד טוב. חלק זה מייצג את יחס פיצול (למשל, 1/8 של התרבות ניתן להעביר על יחס של 1:8.)
    12. מעבר כל 3-4 ימים. לאפשר iPSC קווים להבשיל מאת culturing אותם לפחות 15 קטעים לפני השימוש בניסויים במורד הזרם

3. אפיון ואישור Pluripotency

הערה: עיין הקבצים המשלימים לפרטים על cytometry זרימה, מיקרוסקופיה קונפוקלית.

  1. טרטומה היווצרות assay
    1. כדי לקבוע את הקיבולת של iPSC להבדיל לרקמות נציג של כל שלוש שכבות נבט על ידי טרטומה היווצרות assay, בצע את מדיניות מוסדית בנושא טיפול בבעלי חיים ושימוש, בתכנון מראש לאפשר זמן הגשת הפרוטוקול המתאים מסמכים. היווצרות טרטומה בעכברים ייקח בין 6-10 שבועות.
    2. תרבות 4 בארות של צלחת 6-ובכן לשורה iPSC במשך 4 ימים. המספר המשוער של תאים מוזרק לתוך אגף אחד של עכבר הוא 0.5-1 x 106 תאים. אופציונלי: נוסף טוב יכול להיות מוקדש לקביעת מספר תא נציג בבאר של דיסוציאציה תא בודד עם אנזים ניתוק התא וסופר.
    3. חישוב הנפח של התערובת E8/BMM כגיהנום iPSC יושעו ב: משני האגפים של עכבר מוזרקים, כל אחד עם 150 µL של סבך השעיה. שלושה עכברים מספיקים לבדוק טרטומה היווצרות iPSC שורה אחת. כוללים של µL תוספת 150 לכל מחט באמצעי האחסון שנוצר כדי לפצות על אובדן נפח מת. מחט 1 לכל העכבר נמצא בשימוש. לנפח הכללי ולכן היא 3 * (150 µL * 2 + 150 µL) = 1350 µL
    4. חלקית מביצועם המושבות iPSC עם EDTA כאילו היו כדי להיות passaged, כמתואר בצעדים 2.7.8 כדי 2.7.10. חשוב כי המושבות להיות חלופה מועדפת לתוך גושים, מופרדים לתוך תאים בודדים.
    5. לשטוף את המושבות iPSC עם µL 675 E8 בינוני (מחצית האחסון מחושבים. משלב 3.3.3), באמצעות טיפ נשא רחב. להעביר את המתלים סבך לתוך צינור פוליסטירן מ. מניחים על קרח.
    6. לשלב עם µL 675 של BMM. לשמור התליה המתקבלת על הקרח עד הזריקה.
    7. עזים ומתנגד העכברים כדי לשתק אותם באמצעות איזופלוריין. זה צריך לבצע או מונחה על ידי הצוות המיומן של ביבר.
    8. מערבולת פוליסטירן מ ל צינור בקצרה, וארוקן את סבך הבולם (450 µL לכל עכבר) לתוך מזרק אינסולין אחת מצויד עם מחט 22 גרם. להזריק 150 µL של התליה תא subcutaneously. כרך זה מכיל כ עונה 1 פרק 106 תאים (ראה שלב 3.1.2).
    9. להזריק 3 עכברים לשורה iPSC. בצע תרגול טיפול בבעלי חיים עבור כל שגרות.
    10. לפקח על הבריאות של העכברים מדי יום.
    11. כאשר teratomas מגיעים עם קצה בקוטר של 1.5-2 ס מ, המתת חסד העכברים, explant את teratomas, לאחסן אותם פורמלין פתרון עבור קיבוע הרקמה במשך 24 שעות ביממה.
    12. להביא את teratomas קבוע מתקן הליבה היסטולוגיה עבור hematoxylin אאוזין (H & E) מכתים. פתולוג אתן ציון הנוכחות של רקמות של כל שלוש שכבות הנבט.
      הערה עבור Karyotyping: חיה iPSC תרבויות צריכה להישלח התמחה cytogenetic מעבדות בדיקה של שלמות קריוטיפ. מומלץ כי בדיקה זו ניתן לבצע כל הקטעים 5.
  2. פרופיל תעתיק
    1. תרבות בארות 2 של צלחת 6-ובכן 3-4 ימים לקבל דוגמא אחת של RNA. רק להשתמש תרבויות באיכות גבוהה, ניתן לטפל בזיהום קטין המבדילים תאים על ידי גירוד אותם באמצעות טיפ pipet.
    2. לבודד RNA מתרבויות iPSC באמצעות ערכת זמינים מסחרית ע פ הפרוטוקול של היצרן. הספינה דגימות למתקן הליבה גנומית מיוחדים.
    3. להשיג את הפרופילים תעתיק הכללית של הקווים iPSC באמצעות מיקרו-מערכים (ראה טבלה של חומרים עבור האפשרויות נתמך) או רצפי RNA.
    4. שלח קבצים "*.idat" עבור הערכה bioinformatic של pluripotency באמצעות ממשק מקוון במכון Coriell. לחילופין, להגיש "* .cel" קבצים עבור bioinformatic זיהוי של סוג התא, לרבות תאי גזע pluripotent, באמצעות ממשק מקוון ב אוניברסיטת ג'ונס הופקינס. לפרטים על סוגי נתונים לקבל מבחני bioinformatic בודדים, ראה טבלה של חומרים .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הסכמה בכתב מושכלת הושג מחולים לפני הקציר השפיר למטרות בדיקה גנטית, מקדיש aliquot קטן של נוזל למחקר. אין הסכמה נדרש לשימוש של קרום מי השפיר במחקר כפי השליה מייצג פסולת רפואית. נוזל מי השפיר ותאי גזע ממברנה להציג מאפייני mesenchymal טיפוסי, מורפולוגית התאים שלהם הם בצורת כישור, שלב-בהיר. על התכנות, התאים עוברים mesenchymal-כדי-אפיתל המעבר (MET), רוכשים ריצוף דמוי ומורפולוגיה הארגון המרחבי של המושבות, המציינת את מאפייני האפיתל. תהליך זה מתחיל מוקדם ככל 48-72 שעות לאחר כניסתה של התכנות פלסמידים episomal. היעדרות של מושבות אלו ביום 5 של התכנות מצביע על כישלון הניסוי. להתרבות התאים של המושבות MET, כתוצאה מכך, המושבות להיות קומפקטי, בין יום 5 ו- 14. מושבות MET קומפקטי המורכב מעובדים התאים שאינם ניכר בקלות בנפרד (איור 1 א'). על סביב היום ה-14, מלא היו מושבות מופיעים עם תאים מסודרים של טפט, נושא בולט, גרעינים בקלות ניכר nucleoli. הם מוכנים להיות מבודדת, התרחבה כאשר המושבות להגיע בגודל מתאים ולהיות קומפקטיים (איור 1B).

מושבות באופן מלא חלקית היו נוכחים בתרבויות לאורך כל התקופה התיכנות, למרות המושבות היו חלקית לא בהכרח לרכוש pluripotency מלא. איור 2 מראה נציג לזרום ניתוח cytometric של תאי גזע עובריים (ESC) סמן ביטוי מלא חלקית pluripotent מושבות, מורפולוגיות המתאימים שלהם. Pluripotency מלא מזוהה עם הביטוי של Oct4, Nanog, Sox2, אנטיגנים TRA ו- SSEA-4, בעוד הביטוי SSEA-1 הוא שלילי19,20,21 (איור 2 א). באופן חלקי תאים pluripotent, עם זאת, לא מבטא Nanog ו- TRA אנטיגנים20 (איור 2B). Immunocytochemical מכתים, עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב או קונאפוקלית (איור 3) צריך לאשר את הביטוי ואת לוקליזציה של סמנים ESC.

אישור פונקציונלי pluripotency מושגת על ידי להפגין את היכולת של הקווים iPSC teratomas הטופס לאחר הזרקה תת עורית של התאים לתוך עכברים scid-בז '. 6-8 שבועות יש צורך את teratomas להגיע לגודל מובילים. H & E מכתים של רקמות, בדיקה פתולוגית מתבצע ואז לאשר הנוכחות של רקמות נציגם של כל שלוש נבט שכבות – האנדודרם, neuroectoderm ווהמזודרם (איור 4A). אלטרנטיבה ניסויים בבעלי חיים היא לנתח את החתימה תעתיק המשויכים pluripotency על-ידי סימביונטים כמו cDNA מיקרו-מערכים22,23. ואז ניתן לכמת את שיעור של הפרופיל תעתיק חופף עם אחד בריכת iPSC ומבוססת וקווים ESC על ידי תוכנת ההערכה pluripotency bioinformatic באינטרנט בצורה של מגרש של שני המסווגים – pluripotency, החידוש (איור 4B). גבוה יותר את הציון pluripotency, יותר השאילתה iPSC קו דומה הקווים הוקמה. ניקוד החדשנות גבוהה, עם זאת, עשוי להצביע על סטיות או סטיות כרומוזומליות אפילו, למרות pluripotency גבוה הציון (כמו למשל teratocarcinoma קווים)22. כל הקווים iPSC שנוצר על-ידי ביצוע פרוטוקול המובאת כאן נקבעתם pluripotent cytometry זרימה, הדמיה, טרטומה היווצרות ועל שיטות ניתוח תעתיק.

Figure 1
איור 1: התקדמות מורפולוגי של התאים במהלך התכנות. (א) מי שפיר ו קרום תאי גזע, אשר מייצגים תאי המקור עבור התכנות, מציגים מורפולוגיה mesenchymal טיפוסי, מוארך ובהיר שלב (משמאל) עד שהם עוברים את המעבר mesenchymal-כדי-אפיתל (MET) אשר מוביל רכישת נכסים אפיתל היווצרות מושבות עם חלוק דמוי אבן תאים (במרכז). מושבות אלו להתרבות וליצור גושים הסלולר לא סדיר של המטרופוליטן תאים (מימין). (B) בשלבים מאוחרים יותר של התכנות (החל מ סביב היום ה-14), מושבות תאים באופן מלא מחדש להגיח – בנפרד ניכר תאים עם גרעינים בולטים, nucleoli מסודרים monolayers, עם גבולות מוגדרים היטב (מרכז) – והם נוכח לצד המושבות MET כי הם רבים יותר (משמאל). לשיבוט בוגר מבודד לחלוטין reprogrammed מתואר בצד הימין. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: זרימה cytometric ניתוח של הביטוי של ESC סמני ב חלקית באופן מלא ל- (MET) היו מושבות תא. (א) פרופיל ביטוי pluripotent הוא חיובי עבור Oct4, Nanog, Sox2, טרה-1-60, TRA-1-81 SSEA-4, תוך שלילי עבור SSEA-1. (B) באופן חלקי מושבות תאים pluripotent – אלה עברו במשטרה אך לא הצליחה להתקדם pluripotency מלא – הם חיוביים עבור Oct4 ו- Sox2 אך אנטיגנים Nanog, TRA SSEA נעדרים. מורפולוגיות הקשורים כלולים להשוואה side-by-side. גודל ברים = מיקרומטר 200 ו- 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: קונאפוקלית הדמיה ניתוח של הביטוי של סמני ESC בוגרת iPSC נוזל מי השפיר. גורמי שעתוק Oct3/4A, Nanog ו- Sox2 מותאמים הגרעינים תוך TRA, אנטיגנים SSEA glycoproteins מקומי על הקרום. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. תמונות של הגדלה גדול יותר (מיזוג 2 X) נכללו Oct3/4, Nanog, Sox2 עבור כאחראית על לוקליזציה הגרעין שלהם. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. מין – תמונות רכשה על אור המשודרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: היווצרות טרטומה והגדרת פרופיל תעתיק ב iPSC נוזל לבין קרום מי השפיר בוגרת. (א) Teratomas גדל בעכברים scid-בז ' subcutaneously מכילים רקמות נציג של כל שלוש שכבות הנבט (100 X הגדלה). (B) הפרופילים microarray ביטוי הכללית נאספו לתוכנה pluripotency מקוון חזר מגרש של שני המסווגים – pluripotency, החידוש. ציונים pluripotency גבוהה ותוצאות החידוש נמוכה - אדום ענן - לציין פרופיל ביטוי של קו ESC/iPSC טיפוסי. הענן הכחול מייצג אזור אשכול עבור תאים, בעוד ענן כחול חלש מייצג אזור אשכול עבור תאים pluripotent חלקית. מי שפיר (3 קווים) ואת iPSC ממברנה (4 קווים) נחשבו pluripotent בבחינה. קו ESC WA25 נכללה כפקד, מזוהה כאן עם חץ שחור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השלב הראשוני של דור iPSC של תאי גזע עובריים מצריכה הפקת תאי המקור של רקמות העובר שלהם, הרחבה, ותרבות הקדמה של פלסמידים התיכנות episomal. שלב זה ואחריו תקופת תרבות בסביבות 14-18 ימים לפני ניתן להרחיב את המושבות מלא reprogrammed הראשון. השלב האחרון הוא התבגרותם של שיבוטים iPSC. החילוץ הראשוני של תאי גזע קרום מי השפיר מושגת באמצעות העיכול בשילוב מכני, אנזימטי של השפיר. . מצאנו זמן הדגירה של 30 דקות הביא המספר הגבוה ביותר של תאים חילוץ עם הכדאיות הגבוהה ביותר. ההליך העיכול יכול לייצר חתיכות קטנות של הרקמה והתא גושים. אם חלקם של אלה ביחס תאים בודדים הוא גבוה, אנו ממליצים ציפוי כל גושים של תאים בודדים לתוך לכלי אחד מאז כל יכול לתרום outgrowths של תאים חסיד. ציפוי תאי גזע נוזל מי השפיר היא פשוטה כמו התאים רק מעורבב עם המדיום תרבות, מודגרות עד מושבות תאים חסיד להגיע במידה מספקת. Plasticware שטופלו תרביות רקמה רגיל מתאים בצורה מושלמת, אנו ממליצים משטחים מיוחדים, למרות שהם מיועדים התא העיקרי שיפור תרבות, מאז עם אלה נצפו viabilities נמוך וקשיים עם passaging תהליך.

גזע של נוזלים ושל קרום מי השפיר תאים צריך להיות מורחבת של מניות קפוא, אבל, בזמן שנוחהמוקדם, התאים יכול לשמש מקור התאים עבור התכנות. לצורך כניסתה של פלסמידים episomal לתוך התאים, מערכת תקנים המשמש כאן עם הפרמטרים תרביות תאים מוגדר כ- 950 V, 40 ms, הדופק 1 יש לבצע היטב, עם כל הקווים ניסיון (בסופו של דבר בהצלחה מחדש מעל 10 שורות). המערכת הראשית מתחרות משלוח פועל על עיקרון דומה לא לייצר התיכנות ניסוי יירוט מוצלח בידיים שלנו.

התאים transfected הם נזרע על גבי כלים מצופים vitronectin בינוני AFMC במשך 3-5 הימים הראשונים, לאחר מכן המדיום נכנס למצב E8 בתוספת 100 מיקרומטר נתרן butyrate. זה מגדיל מאוד את קצב רכישת pluripotency מלא. ניתן לראות סימנים ראשונים של שינוי מורפולוגי מוקדם ככל 48-72 שעות. מקור התאים עוברים במשטרה ומופיעות מושבות תאים עם מורפולוגיה אפיתל. אלה בהדרגה להתרבות, להיות קומפקטי. תת-קבוצה של המושבות ירכשו את תכונות מורפולוגיות של תאי גזע pluripotent במלואו – בנפרד ניכר תאים עם גרעינים בולטים, nucleoli, מושבות שטוחות עם גבולות מוגדרים היטב, בניגוד הגבולות מטושטשים שנצפתה חלקית pluripotent MET מושבות. על הרגע רכישה של pluripotency מלאה, המושבות תא MET קומפקטי לרכוש גרעינים בולטים ולהיות התאים הבודדים ניכר תוך יצירת תבנית ייחודית מורפולוגי. עין מקצועית, דפוס זה הוא סימן ברור של התכנות מוצלחת. עם זאת, לחוקר חסר הכשרה תרבות PSC, זיהוי של המושבות אשר התקדמו בהצלחה כדי pluripotency מלא דורש הערכה זהירה כמו שיבוטים MET, iPSC ניתן להתבלבל בין אחד לשני. איור 1 , איור 2 מספקים דוגמאות של שניהם. אם MET שיבוטים נאספים במקום ניתוח cytometry זרימה מעמיק יחשוף את הטעות, בפרט, אנטיגנים TRA-1-60, TRA-1-81 יהיה כנראה להיות נעדר כמוצג באיור2. אכן, אנטיגנים TRA נמצאו בעבר להיות סמנים pluripotency המחמירים. עם זאת, באופן חלקי תאים pluripotent MET עשויות להיות בעלות סרטן מחקר25.

מצב זה תרבות היא שיוצרת עבור המקור AFSC/AMSC בסופו של דבר, ההפצה שלהם יהיה להאט, הם ירכשו מורפולוגיה להחמיא, כמו פיברובלסט. תאי המקור טופס ברקמות ניתן לנתק מפני השטח במהלך בשלבים מאוחרים יותר של התכנות, למרות שזה לא להשפיע לרעה על תהליך התיכנות. להפך, התהליך שמוביל לפעמים פינוי שטח עבור המושבות reprogrammed, תוך צמצום חומר הסלולר האו ם reprogrammed לא רצויות. להיות מושלך מנותקת הרקמות בקלות באמצעות טיפ פיפטה סטריליות עוזב חלקית באופן מלא מושבות pluripotent מאחור, מפשטת מאוד בחירה ידנית במורד הזרם.

עבור איסוף ידני של המושבות מלא reprogrammed, אנו משתמשים LCD מערכת, וניתן להניחו בארון הבטיחות הדמיה, חסר כל החלקים בולטות החוצה להפריע את זרימת האוויר. מלבד מערכת הדמיה זו, אין ציוד מיוחד נחוץ כפי האיסוף עצמו יכול להתבצע באמצעות פיפטות רגיל. המושבות שנאספו באופן חלקי הפומבית תמיסת EDTA/PBS לפני להיות מצופה לתוך הבארות היעד כדי לגדול כמו שיבוטים. בהתאם לקו השיבוט, עבור כמה מעברים, התרבויות עלול להיות מזוהם עם באופן ספונטני המבדילים תאים. Passaging טורי מניפולציה ידנית בדרך כלל לחסל את הבעיה. צריכים להיות מושלך שיבוטים התמלא בידול נרחב, עם זאת, שיבוטים יקר אפשר להציל עם דרגות שונות של הצלחה על-ידי חוזרות ידני אוסף של המושבות pluripotent ולא סילוק המבדילים תאים. פלסמידים episomal הוצגו לקחת בסביבות 15 קטעים יאבד לחלוטין מכל iPSC26. לכן, מומלץ לאפשר שיבוטים לגדול לפחות מספר קטעים לפני השימוש עבור יישומי הזרם וניתוחים, מלבד ניטור שוטף של קריוטיפ וביטוי של אנטיגן TRA. TRA אנטיגן הביטוי יכול בקלות יהיה פיקוח על ידי cytometry זרימה כפי שמתואר כאן בפרוטוקול, מאז וזמינותו בלבד דורש כ-200,000 תאים, וזה יכול להתבצע בכל פעם החוקרים הם ספק באשר אם שמירה שיבוטים בתרבית pluripotency כראוי. ניתוח cytometry זרימה של הביטוי סמן ' ESC ' נחשב לא יספיק לאשר pluripotency המועמד קווים19.

טרטומה היווצרות assay הוא מבחן pluripotency חד משמעי תקן27. PSC גדל בתנאים מוגדרים כימי, ללא קסנו רגישים במיוחד דיסוציאציה-induced המוות, מכאן, מזריק אותם subcutaneously כמו גושים הוא הכרחי עבור8,שלהם שכל28. בעקבות זריקה, בדרך כלל 4-6 שבועות מספיק לצמיחה של קסנו-שתלי יהיו גלויים, לפני שבוע 8, כולם יכולים להיות שנקטפו, H & E-ישנה על שנותחה. רווחת בעלי חיים, עלות, ובדיקות זמן תקופות הדרושים הם הסיבות לפיתוח שיטות אלטרנטיביות. ניתוח גנומי בשילוב עם מתקדם, מכונת bioinformatic למידה-powered גישות יכול לספק הערכה מדויקת של פרופילי ביטוי גלובלית. עלות קבלת נתונים כאלה היא להשוות העלות של טרטומה היווצרות וזמינותו, אולם, הגישה גנומית היא מהירה יותר באופן משמעותי, חיות לא צריך לשמש. אחד assay כזה זה תוכנה22הערכה pluripotency bioinformatic. זה מיושם כממשק מקוון (טבלה של חומרים). הפופולריות הגוברת של עלות צלילה של רצון רצפי RNA להבטיח המשכיות של גישה זו. חלופה זו תוכנה pluripotency זמינה מ אוניברסיטת ג'ונס הופקינס23 (cellnet.hms.harvard.edu), מבוססת על גישה דומה והוא מסוגל לקבל microarray נתונים כדי לנתח את transcriptome של דגימות אנושי. היתרון של תוכנה זו היא כי יש את היכולת לזהות לא רק גזע pluripotent אבל גם הבדיל תאים ולאחר, מאז שלה datasets אצר נגזר רקמות העיקרי, רמת הדמיון בין הפריה גדל התאים / רקמות ורקמות ב- vivo ניתן לקבוע, מתן של בקרת איכות מעולה לפיתוח של בידול פרוטוקולים או הנדסת רקמות. הבדיקה יש היכולת לסווג את השאילתות לתוך 20 תאים שונים או סוגי רקמות. בזמן הנוכחי, זה דורש נתונים microarray אבל המחברים עובדים לקראת הרחבת האפשרויות פלטפורמת ה-RNA רצף גם כן.

לפי הפרוטוקול שהוצגו, חוקרים ניתן להפיק iPSC קווים של נוזל מי השפיר ותאי גזע קרום עם הפארמצבטית גבוהה מאוד בינוני לחלוטין מבחינה כימית והמוגדרים קסנו-חופשית, באמצעות שיטה התיכנות ללא שילוב. קווים אלה יכול לשמש במחקר בסיסי למטב בידול פרוטוקולים, בסופו של דבר בדוגמנות המחלה, סמים רקמות סינון או רפואת ילדים לימודי הנדסה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי Medizinische Forschung Fonds באוניברסיטת ציריך, Forschungskredit של אוניברסיטת ציריך, NMS SCIEX שלCh תחת מלגות 10.216 ו- 12.176, שוויצרי החברה לקרדיולוגיה, את המדע הלאומית השוויצרית קרן תחת גרנט [320030-122273] ו- [310030-143992], לתכנית המסגרת השביעית, שסתום החיים, הנציבות האירופית תחת גרנט [242008], קרן Mayenfisch אולגה, קרן EMDO, המענק סטארט-אפ 2012 של בית החולים האוניברסיטאי בציריך, ו מימון פנימי של מכון הסרטן מיטשל.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tumor Dissociation Kit, human Miltenyi Biotec 130-095-929 tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 tissue dissociation system, dissociator
Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) Thermo-Fisher 3120032
70 µm cell strainers Corning 10054-456
RPMI 1640 medium Thermo-Fisher 32404014 
rocking platform VWR 40000-300
50 ml centrifuge tubes Thermo-Fisher 339652
15 ml centrifuge tubes Thermo-Fisher 339650
EBM-2 basal medium Lonza CC-3156 basal medium for AFMC medium
FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) Prospec Bio CYT-218 bFGF, supplement for AFMC medium
EGF Human, Pichia Prospec Bio CYT-332  EGF, supplement for AFMC medium
LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant Prospec Bio CYT-022 IGF, supplement for AFMC medium
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified Thermo-Fisher 10439024 FBS
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo-Fisher 15240062  for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells!
Accutase cell detachment solution StemCell Technologies 07920 cell detachment enzyme
CryoStor™ CS10 StemCell Technologies 07930 complete freezing medium
PBS, pH 7.4 Thermo-Fisher Scientific 10010023 
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen 12362 for plasmid isolation
pEP4 E02S EN2K Addgene 20925 EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4
pEP4 E02S ET2K Addgene 20927 ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4
pCEP4-M2L Addgene 20926 M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28
NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000C spectrophotometer
Neon® Transfection System Thermo-Fisher MPK5000 transfection system, components:
Neon pipette - transfection pipette
Neon device - transfection device
Neon® Transfection System 10 µL Kit Thermo-Fisher MPK1025 consumables kit for the Neon Transfection System, it contains:
Neon tip - transfection tip
Neon tube - transfection tube
buffer R - resuspension buffer
buffer E - electrolytic buffer
Stemolecule™ Sodium Butyrate StemGent 04-0005 small molecule enhancer of reprogramming
TeSR-E8 StemCell Technologies 05940 E8 medium
Vitronectin XF™ StemCell Technologies 07180 VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer
CellAdhere™ Dilution Buffer StemCell Technologies 07183 vitronectin dilution buffer
UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo-Fisher 15575020 dilute with PBS to 0.5 mM before use
EVOS® FL Imaging System Thermo-Fisher Scientific AMF4300 LCD imaging microscope system
CKX53 Inverted Microscope Olympus phase contrast cell culture microscope
Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo-Fisher 28908 dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week
Perm Buffer III BD Biosciences 558050 permeabilization buffer, chill to -20 °C before use
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 557782 isotype control for Oct3/4A, Nanog
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 557783 isotype control for Sox2
Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 561628
Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 560791
Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 562139
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 401617 isotype control for TRA-1-60
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 401618 isotype control for TRA-1-81
Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 330613
Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 330705
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 400129 isotype control for SSEA-1
Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 401321 isotype control for SSEA-4
Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 323010
Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 330407
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 Jackson Immunoresearch 115-606-068 use at a dilution of 1:600 or further optimize
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 Jackson Immunoresearch 115-546-068 use at a dilution of 1:600 or further optimize
DAPI Thermo-Fisher Scientific D21490 stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution
Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free Corning 356231 basement membrane matrix (BMM)
scid-beige mice, female Taconic CBSCBG-F
RNeasy Plus Mini Kit (50) Qiagen 74134 RNA isolation kit
T-25 flasks, tissue culture-treated Thermo-Fisher 156367
T-75 flasks, tissue culture-treated Thermo-Fisher 156499
Nunc™ tissue-culture dish Thermo-Fisher 12-567-650  10 cm tissue culture dish
6-well plates, tissue-culture treated Thermo-Fisher 140675
Neubauer counting chamber (hemacytometer) VWR 15170-173
Mr. Frosty™ Freezing Container Thermo-Fisher 5100-0001  freezing container
FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml Corning 352058 5 ml polystyrene tubes
Eppendorf tubes, 1.5 ml Thermo-Fisher 05-402-96 1.5 ml microcentrifuge tubes
PCR tubes, 200 µl Thermo-Fisher 14-222-262
pipette tips, 100 to 1250 µl Thermo-Fisher 02-707-407 narrow-bore 1 mL tips
pipette tips, 5 to 300 µl Thermo-Fisher 02-707-410
pipette tips, 0.1 to 10 µl Thermo-Fisher 02-707-437
wide-bore pipette tips, 1000 µl VWR 89049-166 wide-bore 1 mL tips
glass Pasteur pipettes Thermo-Fisher 13-678-20A
ethanol, 200 proof Thermo-Fisher 04-355-451
vortex mixer VWR 10153-842
chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass Thermo-Fisher 155409 glass-bottom confocal-grade cultureware
22G needles VWR 82002-366
insulin syringes Thermo-Fisher 22-253-260
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L fixation of explanted teratomas
Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip Illumina BD-103-0204 expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer
PrimeView Human Genome U219 Array Plate Thermo-Fisher 901605 expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest
GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array Thermo-Fisher 902482 expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest
PluriTest® Coriell Institute www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data - *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data
CellNet Johns Hopkins University cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data - *.cel files, soon to support RNA sequencing data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, (4), 663-676 (2006).
  2. Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science. 318, (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, (3), 194-200 (2016).
  4. Schmidt, D., et al. Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source. Circulation. 116, (11 Suppl), I64-I70 (2007).
  5. Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth. Placenta. 32, S316-S319 (2011).
  6. Weber, B., et al. Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation. Biomaterials. 33, (16), 4031-4043 (2012).
  7. Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects. Cardiovasc. Pathol. 25, (4), 300-305 (2016).
  8. Slamecka, J., et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 15, (2), 234-249 (2016).
  9. Jiang, G., et al. Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy. Stem Cells Dev. 23, (21), 2613-2625 (2014).
  10. Pipino, C., et al. Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking. Cell. Reprogram. 16, (5), 331-344 (2014).
  11. Cai, J., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells. J Biol. Chem. 285, (15), 11227-11234 (2010).
  12. Ge, X., et al. Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells. Stem Cells Dev. 21, (15), 2798-2808 (2012).
  13. Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res. Ther. 6, (1), (2015).
  14. Kang, N. -H., et al. Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells. Cancer Gene Ther. 19, (8), 517-522 (2012).
  15. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol. Ther. 20, (10), 1953-1967 (2012).
  16. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467, (7313), 285-290 (2010).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, (5), 424-429 (2011).
  18. Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324, (5928), 797-801 (2009).
  19. Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8, (2), 223-253 (2013).
  20. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27, (11), 1033-1037 (2009).
  21. Adewumi, O., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25, (7), 803-816 (2007).
  22. Müller, F. -J., et al. A bioinformatic assay for pluripotency in human cells. Nature Methods. 8, (4), 315-317 (2011).
  23. Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering. Cell. 158, (4), 903-915 (2014).
  24. Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma. STEM CELLS. 25, (3), 723-730 (2007).
  25. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156, (4), 663-677 (2014).
  26. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33, (1), 58-63 (2014).
  27. Müller, F. -J., Goldmann, J., Löser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6, (5), 412-414 (2010).
  28. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat. Protoc. 7, (11), 2029-2040 (2012).
התכנות ראשי מי שפיר ו ממברנות התאים כדי Pluripotency בתנאים קסנו-חופשית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Slamecka, J., Laurini, J., Shirley, T., Hoerstrup, S. P., Weber, B., Owen, L., McClellan, S. Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions. J. Vis. Exp. (129), e56003, doi:10.3791/56003 (2017).More

Slamecka, J., Laurini, J., Shirley, T., Hoerstrup, S. P., Weber, B., Owen, L., McClellan, S. Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions. J. Vis. Exp. (129), e56003, doi:10.3791/56003 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter