Summary
Denne protokol beskriver omprogrammering af primære fostervand væske og membran mesenkymale stamceller til induceret pluripotente stamceller ved hjælp af en ikke-integrere episomal tilgang i fuldt kemisk definerede betingelser. Procedurer for udvinding, kultur, omprogrammering og karakterisering af de resulterende inducerede pluripotente stamceller af strenge metoder er beskrevet.
Abstract
Autolog cellebaserede behandlinger fik et skridt tættere på virkeligheden med indførelsen af induceret pluripotente stamceller. Føtale stamceller, som fostervand og membran mesenkymale stamceller, repræsenterer en enestående type af udifferentierede celler med løftet i vævsmanipulering og for omprogrammering til iPSC for fremtidige pediatric interventioner og stamcelle bank. Protokollen præsenteres her beskriver en optimeret proceduren til ekstraktion og dyrkning af primære fostervand væske og membran mesenkymale stamceller og generere episomal induceret pluripotente stamceller fra disse celler som fuldt kemisk definerede kultur betingelser, der anvender humane rekombinante vitronectin og E8 medium. Karakterisering af de nye linjer ved at anvende strenge metoder – flowcytometri, Konfokal imaging, teratom dannelse og transcriptional profilering – er også beskrevet. De nyligt oprettede linjer express markører af embryonale stamceller-Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – samtidig med at være negativ for SSEA-1 markør. Stamcellelinjer danner Teratomer i scid-beige mus i 6-8 uger og Teratomer indeholder væv repræsentativ for alle tre Kim lag. Transkriptionel profilering af linjerne ved at indsende globale udtryk microarray data til en bioinformatic pluripotency vurdering algoritmen anses for alle linjer pluripotente og derfor denne tilgang er et attraktivt alternativ til dyreforsøg. De nye iPSC linjer kan let anvendes downstream forsøg med optimering af differentiering og vævsmanipulering.
Introduction
Teknologien af induceret pluripotente stamceller (iPSC) bringer om potentielle celle udskiftning behandlingsformer, sygdom og udviklingsmæssige modellering, og narkotika og toksikologiske screening1,2,3. Udskiftning terapier kan konceptuelt opnås ved celle indsprøjtning, in vitro-opdelte væv (såsom hjerte patches) implantation eller guidede regenerering gennem vævsmanipulering. Fostervand (AFSC) og membran stamceller (AMSC) er en glimrende kilde til celler til disse interventioner enten direkte4,5,6,7 eller som en start celle population for omprogrammering i pluripotency8,9,10,11,12.
Tidlig tilgange bruges udefineret kultur systemer eller omprogrammering metoder, der kræver indebærer genomisk integration af konstruktioner9,10,11,12. En nyere undersøgelse ansat en xeno-frit medium, selv om en mindre definerede basalmembranen vedhæftet fil matrix (BMM) blev brugt til at generere iPSC fra fostervand væske epitelceller. Teratom dannelse analysen indgik ikke i undersøgelsen sammen med et væld af in vitro- og molekylære data. Fostervand væske epitelceller fandtes for at have en nogenlunde 8-fold højere omprogrammering effektivitet i forhold til neonatal fibroblaster13. I en anden undersøgelse fandtes mesenkymale stamceller fra fostervand også skal omprogrammeres til iPSC med en meget højere effektivitet12.
Pluripotente stamceller kan differentieres til væv repræsentant for alle 3 Kim lag og dermed har den bredeste potentiale. Pædiatriske patienter kunne drage fordel af den høst, omprogrammering, og vævsmanipulering af deres autolog fostervand væske stamceller prænatalt og fostervand membran stilk celler perinatal. Desuden kunne det forholdsvis lave niveau af differentiering af føtale stamceller (lavere end voksne stamceller14,15) teoretisk støtte i håndteringen af de observerede fastholdelse af epigenetiske bias fra kildecellerne i iPSC16.
Præsenterer her vi en protokol for omprogrammering fostervand og membran stamceller til pluripotency i kemisk definerede xeno-fri E8 medium rekombinante vitronectin17 (VTN) ved hjælp af episomal plasmider18. Den største fordel af fostervand væske og membran celler som en kilde til celler for omprogrammering ligger i deres tilgængelighed pre- og perinatal og dermed denne tilgang gavner hovedsagelig forskning i pediatric vævsmanipulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen følger institutionelle retningslinjer fra den etiske komité for human forskning. Skriftlig samtykke fra patienten blev opnået for anvendelse af fostervand til forskning.
Denne protokol følger institutionelle Animal Care og brug Udvalget af University of South Alabama politikker.
1. isolering og kultur af primære fostervand mesenkymale stamceller
-
Plettering af fostervand væske celler
- Få mindst 2,5 mL fostervand høstet ved fostervandsprøve af en læge.
Bemærk: Al håndtering af levende celler og væv skal udføres i en steril vævskultur kabinet og korrekte personlige værnemidler skal anvendes. Kendskab til grundlæggende cellekultur og steril teknik er påkrævet. - Forberede den fostervand væske og membran (AFMC) cellekulturmedium: EBM-2 basal medium, 15% føtal bovint serum (FBS), 20 ng/mL af bFGF, 25 ng/mL af EGF, 10 ng/mL af IGF. For kultur af primære fostervand væske samt fostervand membran stamceller, bør medium suppleres med antibiotika-antimykotikum løsning.
- På dag 0, Bland 2,5 mL fostervand med 3,5 mL af AFMC næringssubstratet og plade i en T25 kolbe. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i mindst 48 timer uforstyrret før kontrol for tilstedeværelse af kolonier.
- På dag 5, bør kolonier af vedhængende celler være til stede. Forsigtigt rock kolben for at løsne celler, der ikke fuldt ud overholder bunden og snavs og vakuum-aspirat brugt medium/fostervand væske blandingen ved hjælp af Pasteurs pipette. Erstat med 5 mL frisk AFMC medium.
- Kultur til en anden 5 dage. Ændre medium hver anden dag som beskrevet i trin 1.1.4.
- Få mindst 2,5 mL fostervand høstet ved fostervandsprøve af en læge.
-
Isolering af primære mesenkymale stamceller fra menneskelige dyr
- Få placenta snarest muligt efter fødslen, inden for 24 timer på senest, at maksimere cellulære integritet. Klip en 9 cm2 segment af dyr, fjerne blodpropper og vask i et 50 mL centrifugeglas med 30 mL PBS suppleret med antibiotika-antimykotikum løsning.
- Hakkekød membraner ved hjælp af et par af skalpeller til fine stykker i en steril 10 cm vævskultur parabol. Fordøjelsen af membraner og udvinding af cellerne kan opnås ved hjælp af en væv dissociation system. Følg producentens protokol.
Bemærk: de finere stykker af væv efter hakning, jo højere celle numre inddrives efter fordøjelsen. - Overføre hakket membran vævsmasse bruger skalpel vingerne ind i et væv dissociation rør og bland med 4,7 mL af RPMI 1640 medium. Bland i dissociation enzymer (Se Tabel af materialer).
- Montere rør på væv dissociator og Kør programmet "h_tumor_01". Inkuber rør ved 37 ° C på en vuggende platform for 30 min.
- Yderligere fortyndes suspensioner med 35 mL af RPMI 1640 og gælder for en 70 µm si placeret over et 50 mL centrifugeglas samling.
- Centrifuge tilberedt for 5 min på 200 x g ved stuetemperatur, Fjern supernatanten, resuspenderes i 5 mL af RPMI 1640, tælle celler ved hjælp af en hemacytometer og plade med en tæthed på 10.000 celler/cm2 i vævskultur-behandlede fartøjer med frisk AFMC medium suppleret med antibiotika-antimykotikum løsning.
Bemærk: I tilfælde af ufuldstændig fordøjelse, vil små stykker af væv være til stede og enkelt celler bliver knappe. Spin ned igen og plade hele pellet i en kolbe på T75.
-
Kultur af primær AFSC og AMSC
- Passage kolonier af AFSC/AMSC vakuum-sugning brugt medium ved hjælp af Pasteurs pipette og tilføje celle detachement enzym sættes 2 mL i kolben. Der inkuberes ved 37 ° C i 5-8 min.
- Tryk på kolben til at løsne cellerne og bland suspension med et lige saa stort volumen af AFMC medium (antibiotikum-antimykotikum supplement bør ikke være nødvendigt fra dette punkt på). Der centrifugeres ved 200 g i 4-5 min. Fjern supernatanten ved hjælp af enten et glas Pasteur pipette eller blot ved hjælp af invertere røret og tømme den ind i en spildbakken.
- Svip til bunden i centrifugeglasset at bryde op pellet i en enkelt cellesuspension i de resterende dråbe af væske og blandes med AFMC medium for plating. Plade i T-flasker med en tæthed mellem 2.500 og 5.000 celler/cm2.
- Skift mellem hver anden dag. Kultur ikke cellelinjer ud over passage 6. For omprogrammering formål, brug så lav en passage som muligt.
- Forberede frosne bestande af AFSC og AMSC som back-ups bruge indefrysning medium. Høste kulturer ved hjælp af en celle detachement enzym, centrifuge på 200 g til 4 ° C i 5 min.
- Fjern supernatanten ved hjælp af Pasteurs pipette og bladre i bunden af røret til singularize celler i toerstoffet. Resuspend i fuldstændig indefrysning medium med en tæthed på 1 × 106/mL og alikvot ind i cryovials. Opbevar i en indefrysning beholder natten over ved-80 ° C. Derefter flytte til flydende kvælstof til langtidsopbevaring.
2. omprogrammering i Pluripotency
- Opnå de omprogrammering plasmider
- Køb de omprogrammering plasmider gennem en non-profit plasmid repository. Et materiale overdragelsesaftalen er nødvendig.
- Omdanne plasmider til E. Coli kompetente celler og isolere plasmider ved hjælp af en kommerciel plasmid udvinding kit. Følg producentens anvisninger.
- Mål koncentrationen af plasmid DNA ved hjælp af et spektrofotometer. Målet for en høj resulterende plasmid koncentration, ideelt set omkring 1 µg/µL at undgå fortynding af prøven under Transfektion.
- Bestemmelse af koncentrationen af de enkelte plasmider ved hjælp af en UV-Spektrofotometer og prøve dem individuelt.
- Bland 3 µg, 3 µg, og 2 µg for EN2K, ET2K og M2L plasmider, henholdsvis. Dette er den omprogrammering plasmid løsning. Mængden af plasmid løsning er nok til at transfect 1 x 106 celler. Forbered flere sådanne delprøver.
- Gemme alle alikvoter ved-80 ° C.
- Forberede målet kultur plader
- Coat et 6-godt plade med vitronectin – tilsættes 1 mL vitronectin fortynding buffer i hver brønd og bland i 40 µL af VTN stamopløsning (1 µg/cm2). Forlade ved stuetemperatur (RT) eller i inkubator ved 37 ° C i 1 time.
- Vakuum-aspirat løsning ved hjælp af Pasteurs pipette og erstatte med 2 mL af AFMC medium i hver brønd. Opbevar ved 37 ° C, indtil cellerne skal være forgyldt.
Bemærk: Vigtigt: den AFMC medium anvendes i dette trin bør ikke indeholde enhver antibiotika eller antimykotikum løsninger.
- Høst kulturperler primære AFSC/AMSC
Bemærk: Udvid AFSC/AMSC i kultur nok at gøre frosne bestande på en lav passage antallet og dedikere en T-75 kolben til omprogrammering. Siden så få som 100.000 celler er tilstrækkelig for et eksperiment, mål ved høst omkring 500.000 celler til at kompensere for tab og hvis optimering af Transfektion parametre eller anden kultur betingelser der skal testes.- På de tidligste bekvemmelighed på en lav passage, høste AFSC/AMSC ved hjælp af celle detachement enzym mix, som beskrevet i trin 1.3.1 til 1.3.2. Når cellerne har været centrifugeres, skal du fortsætte til næste trin.
- Resuspend pellet i 1 mL PBS og bland godt at vaske serum komponenter. Tælle celler ved hjælp af en hemacytometer. Justere celle tæthed til 100.000/mL PBS og alikvot i 1,5 mL microcentrifuge rør. Dette sikrer kun en minimal kontakttid mellem cellerne og den buffer, der bruges til Transfektion.
- Placer microcentrifuge tube oven på 5 mL polystyren rør (som adaptere, vil tillade centrifugering i en regelmæssig swing rotor) og centrifugeres ved 200 x g i 4 min ved stuetemperatur. Invertere rør og supernatanten i en spildbakken. Brug ikke en fast vinkel rotor.
- Udføre en yderligere centrifugering skridt på 200 x g i 3 min. ved stuetemperatur. Dette vil give mulighed for de resterende flydende fra væggene i røret at indsamle nederst. Omhyggeligt Aspirér alle af det ved hjælp af en 200 µL pipette.
- Transfektion med omprogrammering plasmider
- For omprogrammering eksperimenter, vil (Se Tabel af materialer) en Transfektion system blive brugt til at levere omprogrammering plasmider ind i cellerne. Placer Transfektion tips, Transfektion rør, ophvirvling buffer og elektrolytisk buffer ind i vævskultur kabinettet. Kit reagenserne er holdt på RT, før de åbnes, så de opbevares ved 4 ° C.
Bemærk: Bruger vi de 10 µL version af kit. - Flyt enheden Transfektion tæt, så dens tube station kan placeres direkte ind i kabinettet. Fyld en Transfektion tube med 3 mL af elektrolytisk buffer og montere røret ind på stationen ved at skubbe det hele vejen inde i slidsen.
- Tage den omprogrammering plasmid løsning delprøver forberedt i trin 2.1.5 ud af-80 ° C opbevaring og tillade dem at tø på RT i kultur kabinet.
- Vælg følgende Transfektion parametre på enhedens Transfektion: 950 V, 40 ms, og 1 puls.
- Resuspenderes med 100.000 celler i 10 µL resuspension buffer. Arbejde hurtigt fra dette punkt på siden resuspension buffer er lidt giftigt, og en øget eksponeringstid resulterer i en mærkbart lavere cellernes levedygtighed.
- Bland i 1/10 af omprogrammering plasmid løsningen (den alikvote løsning blev udarbejdet for et samlet beløb på 1 x 106 celler).
- Montere en Transfektion tip på Transfektion pipette.
- Opsug cellesuspension ind i Transfektion spidsen forsigtigt, undgå dannelsen af luftbobler. Hvis bobler er observeret, udvise suspension og gentage aspiration. Luftbobler vil hindre Transfektion.
- Indsæt Transfektion pipette i Transfektion røret og tryk på "START" knappen på skærmen på Transfektion enhed. Afvente den raster besked informere om succes af Transfektion og fjerne pipetten fra røret straks.
- Udvise suspension til 1 godt af mål 6-godt pladen forberedt i afsnit 2.2. Mix på medium fra en nærliggende godt og distribuere suspension ligeligt i begge wells (den resulterende celle tæthed bliver 50.000/brønd).
- Gentag Transfektion af alle microcentrifuge-rør indeholdende AFSC/AMSC individuelt. Pladen anbringes i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2.
- For omprogrammering eksperimenter, vil (Se Tabel af materialer) en Transfektion system blive brugt til at levere omprogrammering plasmider ind i cellerne. Placer Transfektion tips, Transfektion rør, ophvirvling buffer og elektrolytisk buffer ind i vævskultur kabinettet. Kit reagenserne er holdt på RT, før de åbnes, så de opbevares ved 4 ° C.
- Kultur af transfekteret AFSC/AMSC
- Kultur de transfected celler i 2-5 dage. Derefter skifte til omprogrammering medium bestående af E8 suppleret med 100 µM af natrium butyrat på dag 3.
Bemærk: Sekundær passage kan udføres for at undgå tilgroning af kilde AFSC/AMSC. Men den passaging vil deaktivere muligheden for at beregne den omprogrammering effektivitet korrekt, hvis denne parameter er af interesse. - Ændre den omprogrammering medium hver dag til hver anden dag i 10 dage. Ændre medium hver dag fra dag 10 på.
- Kultur de transfected celler i 2-5 dage. Derefter skifte til omprogrammering medium bestående af E8 suppleret med 100 µM af natrium butyrat på dag 3.
- Manuel plukning af fuldt reprogramed kolonier for klonal ekspansion
- Fuldt omprogrammeret kolonier vises omkring dag 14. Tillad kolonier til at udvide i størrelse og blive kompakt. De kan være manuelt plukket og overført til frisk plader så tidligt som i dag 15-16.
- 1 time før proceduren picking pels 24-godt plader med 8 µL af VTN i 300 µL af vitronectin fortynding buffer pr. brønd (1 µg/cm2) og inkuberes ved RT eller 37 ° C. Udskifte løsningen med E8 medium uden natrium butyrat.
- Vælg kolonier af en tilstrækkelig størrelse (ideelt over 400 µm i diameter) i en steril kultur kabinet. Et fase-kontrast mikroskop eller et stereomikroskop kan bruges.
- Til pluk bruges en LCD imaging mikroskop placeret i kabinettet da dens skærm eliminerer behovet for okularer. Sterilisere mikroskop scenen med 70% ethanol.
- Ved hjælp af en regelmæssig fasekontrast celle kultur mikroskop, Vælg, markere og Bemærk antallet af kolonier skal plukkes. Det er vigtigt at sørge for tiden ikke er spildt for denne proces under de faktiske plukning.
- Udfylde en række PCR rør, der er lig med eller større end antallet af kolonier skal plukkes med 30 µL af 0,5 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) i PBS. Kolonier vil blive placeret i disse rør til delvis dissociation før plating.
- Planlægger at vælge 5 kolonier ad gangen fra plader ved hjælp af en 10 µL pipette indstillet til 2 µL. holde pipetten spids i en vinkel på koloni kant og forsigtigt og gradvist skrabe hele kolonien fra overfladen. Straks Aspirér hele kolonien ind i pipette spidsen og overføre det til en af de forberedte PCR rør med EDTA.
- Gentag med de resterende 4 kolonier. Der inkuberes ved RT i 4-6 min.
- Med pipette overfoeres suspension op og ned forsigtigt ved hjælp af en større pipette tip for at opdele kolonien i mindre klumper. Undgå at skabe en enkelt cellesuspension.
- Plade suspension direkte ind i et mål godt af en 24-godt plade forberedt i trin 2.6.2. Gentag med de resterende kolonier.
- Gentag trin 2.6.6 gennem 2.6.10, hvis mere end 5 kolonier skal plukkes men ikke vælge mere end 5 kolonier ad gangen. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.
- Klonal ekspansion og modning af iPSC
- Tillad kolonier til at vokse og blive kompakt. 3-6 dage er tilstrækkelig. Ændre næringssubstratet dagligt. Bruge mellem 400 µL 1 mL af E8 medium baseret på celle tæthed.
- Pladens huller, 24-godt med en tilstrækkelig koloni tæthed vil blive udvidet til 6-godt plader. 1 h før passaging, pels 6-godt pladerne med VTN (som i trin 2.2.1). Derefter erstatte løsning i brønden med 2 mL af E8 medium pr. brønd.
- Opsug den brugte medium fra kilde brønde ved hjælp af 1 mL pipette og erstatte med 300 µL af 0,5 mM EDTA at vaske. Aspirér straks ved hjælp af den samme pipette spids og erstatte med 300 µL af 0,5 mM EDTA igen, derefter inkuberes ved RT for 5 min. Aspirér alle væske ved hjælp af 1 mL pipette.
- Sæt 1 mL pipette til kapacitet, montere en 1 mL wide-bore spidsen på det og Opsug E8 mediet fra målet godt ind i spidsen. Vaske kilde iPSC kultur med en strøm af mediet.
- Overføre suspension til målet godt og afpipetteres op og ned flere gange for at bryde op kolonier i klumper på 20-50 celler. Sørg for de få fordeles jævnt i brønden af blid rokkende og ryster pladen og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.
- Ændre medium dagligt og passage hver 3-4 dage. Enhver differentiering kolonier kan mærkes under fase-kontrast mikroskop og fjernes ved hjælp af en pipette tip i kultur kabinet. Dette giver mulighed for selektiv overførsel af høj kvalitet ren iPSC kultur.
- 1 h før passaging, pels wells af en 6-godt plade med VTN som i trin 2.2.1. Derefter erstatte løsningen med 2 ml af E8 medium pr. brønd.
- Rutinemæssig passaging er magen til den oprindelige passaging gjort ved hjælp af 0,5 mM EDTA (trin 2.7.2 til 2.7.5). Udskift brugte medium i et godt af en 6-godt plade med 1 mL af EDTA til vask og kassér.
- Der tilsættes 1 mL af EDTA og inkuberes ved RT i 5-7 min til delvis dissociation. Optimere inkubationstiden hvis nødvendigt, og sørg for en suspension af omkring 20 til 50-celle klumper er produceret. Undgå dissociation i enkelte celler.
- Kassér EDTA-oploesning og Opsug 1 mL af E8 medium ved hjælp af en 1 mL pipette fra målet langt ind i en wide-bore pipette tip.
- Vaske kilde iPSC kultur med en strøm af E8 medium gentagne gange, indtil en ønsket del af det blev udgivet fra overfladen og overføre til målet godt. Denne del repræsenterer delingsforholdet (f.eks.1/8 af kulturen kan overdrages i forholdet 1:8.)
- Passage hver 3-4 dage. Tillad iPSC linjer til at modnes ved dyrkning dem for mindst 15 passager før du bruger dem i downstream eksperimenter
3. karakterisering og bekræftelse af Pluripotency
Bemærk: Henvise til de supplerende filer til detaljer på flowcytometri og konfokal mikroskopi.
-
Teratom dannelse assay
- Følg de institutionelle politikker vedrørende dyrs pleje og planlægning, videre at give tid til indgivelse af den relevante protokol for at fastslå iPSC evne til at differentiere i væv repræsentativ for alle tre Kim lag af teratom dannelse assay, dokumenter. Teratom dannelsen i mus vil tage mellem 6-10 uger.
- Kultur 4 brønde i en 6-godt plade pr. iPSC linje i 4 dage. Det omtrentlige antal celler injiceres i ene flanke af en mus er 0,5 til 1 x 106 celler. Valgfrit: et ekstra godt kan være dedikeret til fastsættelse af en repræsentativ celle nummer i en brønd med enkelt celle dissociation med en celle detachement enzym og optælling.
- Beregning af volumen af E8/BMM blandingen iPSC klumper vil blive suspenderet i: begge flanker af en mus er indsprøjtet, hver med 150 µL af klump suspension. Tre mus er tilstrækkelige til at teste teratom dannelsen af en iPSC linje. Inkludere en ekstra 150 µL pr. nålen i den deraf følgende volumen til at kompensere for dødvolumen tab. 1 nål pr. musen bruges. Det samlede volumen er derfor 3 * (150 µL * 2 + 150 µL) = 1350 µL
- Delvist adskille iPSC kolonier med EDTA, som hvis de skulle være passaged, som beskrevet i trin 2.7.8 til 2.7.10. Det er vigtigt, at kolonierne blive adskilt i klumper og ikke opdelt i enkelt celler.
- Vask off iPSC kolonier med 675 µL af E8 medium (halvdelen af den beregnede mængde fra trin 3.3.3), ved hjælp af en wide-bore spidsen. Overføre klump suspension i en 5 mL polystyren tube. Anbring på is.
- Kombinere med 675 µL af BMM. Hold de resulterende suspension på is indtil injektion.
- Bedøver mus for at immobilisere dem ved hjælp af isofluran. Dette bør udføres eller styret af faglært personale af vivarium.
- Vortex 5 mL polystyren tube kort og Opsug klump suspension (450 µL pr. mus) ind en insulin sprøjten udstyret med en 22 G kanyle. Injicér 150 µL af cellesuspension subkutant. Denne diskenhed indeholder ca 1 x 106 celler (Se trin 3.1.2).
- Injicere 3 mus pr. iPSC linje. Følg korrekt dyrs pleje praksis for alle procedurer.
- Overvåge sundheden for musene dagligt.
- Når Teratomer nå et slutpunkt diameter på 1,5 til 2 cm, aflive mus, explant Teratomer, og gemme dem i formalin løsning for væv fiksering i 24 timer.
- Bringe de faste Teratomer til en histologi core facilitet for hæmatoxylin eosin (H & E) farvning. En patolog vil grade tilstedeværelsen af væv af alle tre Kim lag.
Note til Karyotyping: levende iPSC kulturer skal sendes til specialiserede cytogenetisk laboratorier for afprøvning af integriteten af karyotype. Det anbefales, at denne test udføres hver 5 passager.
-
Transkriptionel profilering
- Kultur 2 brønde i en 6-godt plade for 3-4 dage at få én RNA prøve. Brug kun høj kvalitet kulturer, mindre forurening med differentiering af celler kan løses ved at skrabe dem ved hjælp af en pipette tip.
- Isolere RNA fra iPSC kulturer ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit efter producentens protokol. Skibet prøver til en specialiseret genomisk core facilitet.
- Opnå de globale transkriptionel profiler af iPSC linjerne ved hjælp af microarrays (Se Tabel af materialer til understøttede valg) eller RNA sekvensering.
- Indsende "*.idat" filer til bioinformatic vurdering af pluripotency gennem en online interface på Coriell Institute. Alternativt kan du indsende "* .cel" filer til bioinformatic identifikation af celletype, herunder pluripotente stamceller, gennem en online interface på Johns Hopkins University. Se Tabel af materialer for detaljer om typerne data individuelle bioinformatic assays acceptere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Informeret skriftligt samtykke blev opnået fra patienter før høsten fostervand for genetiske testformål og afsætte en lille prøve af væsken for forskning. Ingen samtykke er påkrævet for brug af fostervand membranen i forskning som moderkagen repræsenterer medicinsk affald. Fostervand væske og membran stamceller viser typiske mesenchymale egenskaber, morfologisk deres celler er spindel-formet og fase-lyse. Ved omprogrammering, cellerne gennemgå mesenchymale til epitel (MET) overgang og erhverve brostensbelagte-lignende morfologi og rumlige organisering af de kolonier, der angiver epitelial egenskaber. Denne proces er påbegyndt så tidligt som i 48-72 h efter indførelsen af omprogrammering episomal plasmider. Fraværet af disse kolonier af dag 5 af omprogrammering tyder på fejl i forsøget. Cellerne i markedsøkonomisk kolonier formere og som et resultat af kolonier bliver kompakt, mellem dag 5 og 14. Kompakt MET kolonier består af celler, ikke der let individuelt mærkbar (figur 1A). På omkring dag 14, vises fuldt omprogrammeret kolonier med celler arrangeret i en éncellelag, transporterer fremtrædende, nemt mærkbar kerner og nucleoli. De er klar til at være mekanisk isoleret og udvides, når kolonierne nå en passende størrelse og bliver kompakt (figur 1B).
Helt og delvist omprogrammeret kolonier er til stede i kulturer i hele perioden hele omprogrammering selvom delvist omprogrammeret kolonier ikke nødvendigvis får fuld pluripotency. Figur 2 viser en repræsentant flow cytometric analyse af embryonale stamceller (ESC) markør udtryk i fuld og delvis pluripotente kolonier og deres tilsvarende morfologier. Fuld pluripotency er forbundet med udtryk for Oct4, Nanog, Sox2, TRA antigener og SSEA-4, mens SSEA-1 udtryk er negative19,20,21 (figur 2A). Delvist udtryk pluripotente celler, men ikke Nanog og TRA antigener20 (figur 2B). Udtryk og lokalisering af ESC markører bør bekræftes ved andre farvning og afbildet ved hjælp af en wide-felt eller Konfokal mikroskop (figur 3).
En funktionel bekræftelse af pluripotency opnås ved at demonstrere evne til iPSC linjer form Teratomer efter subkutan injektion af cellerne i scid-beige mus. 6-8 uger er nødvendige for Teratomer at nå end-point størrelse. H & E farvning af væv og undersøgelse af en patolog derefter foretages for at bekræfte tilstedeværelsen af væv repræsentant for alle tre Kim lag-endoderm, neuroectoderm og mesoderm (figur 4A). Et alternativ til dyreforsøg er at analysere det transkriptionel signatur tilknyttet pluripotency af genomforskningsmetoder ligesom cDNA microarrays22,23. Andel af det transkriptionel profil, der overlapper med en af en pulje af veletablerede iPSC og ESC linjer kan derefter kvantificeres ved online bioinformatic pluripotency evalueringssoftware i form af et plot af to klassificeringer – pluripotency og nyhed (figur 4B). Jo højere pluripotency score, den flere den forespørgsel iPSC linje ligner de etablerede linjer. En stor nyhed score, dog kunne tyde afvigelser eller endda kromosomforandringer, trods en høj pluripotency score (f.eks. i teratocarcinoma linjer)22. Alle iPSC linjer genereret ved at følge protokollen præsenteres her har været anset for pluripotente ved flowcytometri, billedbehandling, teratom dannelse og transcriptional analysemetoder.
Figur 1: morfologiske progression af cellerne under omprogrammering. (A) fostervand og membran stamceller, som repræsenterer datakildens celler for omprogrammering, viser en typisk mesenchymale morfologi, aflange og fase-lyse (til venstre), indtil de undergår mesenchymale til epitelial overgangen (MET) som fører til erhvervelse af epitel egenskaber og dannelsen af kolonier med cobble stone-lignende celler (center). Disse kolonier formere sig og oprette uregelmæssige cellulære masserne af markedsøkonomisk celler (til højre). (B) i de senere faser af omprogrammering (starter fra omkring dag 14), kolonier af fuldt omprogrammerede celler opstår – individuelt mærkbar celler med fremtrædende kerner og nucleoli arrangeret i encellelag med veldefinerede grænser (centrum) – og er stede ved siden af MET kolonier, der er mere talrige (venstre). En fuldt omprogrammeret isolerede ældre klon er afbildet til højre. Skalalinjen = 100 µm venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Flow cytometric analyse af udtryk for ESC markører i fuld og delvis (MET) omprogrammerede celle kolonier. (A) pluripotente udtryk profil er positiv for Oct4, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81 og SSEA-4, mens negative for SSEA-1. (B) pluripotente celle kolonier – dem, der har undergået MET, men undlod at fremskridt til fuld pluripotency – er delvist positive for Oct4 og Sox2 men Nanog, TRA og SSEA antigener er fraværende. De tilknyttede morfologier medtages for side-by-side sammenligning. Skalere barer = 200 µm og 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Konfokal imaging analyse af udtryk for ESC markører i modne fostervand væske iPSC. Transkriptionsfaktorer Oct3/4A, Nanog og Sox2 er lokaliseret i kerner mens TRA og SSEA antigener er glykoproteiner lokaliseret på membranen. Skalalinjen = 50 µm. billeder af større forstørrelse (Flet 2 X) blev inkluderet for Oct3/4, Nanog og Sox2 for bedre visualisering af deres nukleare lokalisering. Skalalinjen = 25 µm. overførte – billeder erhvervet på gennemlysning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: teratom dannelse og transcriptional profilering i modne fostervand væske og membran iPSC. (A) Teratomer vokset i scid-beige mus subkutant indeholder væv repræsentativ for alle tre Kim lag (100 X forstørrelse). (B) den globale udtryk microarray profiler indsendt til online pluripotency software returnerede et plot af to klassificeringer – pluripotency og nyhed. Høj pluripotency scores og lav nyhed scores - røde Sky - angiver et udtryk profil for en typisk ESC/iPSC linje. Blue Sky repræsenterer en klynge område for differentierede celler, mens den svage blue Sky repræsenterer en klynge område for delvist pluripotente celler. Fostervand (3 linier) og membran (4 linier) iPSC ansås pluripotente af testen. En ESC linje WA25 blev medtaget som kontrol og er identificeret her med en sort pil. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den indledende fase af iPSC generation fra føtale stamceller indebærer udvinding af kildecellerne fra de føtale væv, deres kultur, ekspansion og indførelsen af de episomal omprogrammering plasmider. Denne fase efterfølges af en kultur omkring 14-18 dage før de første fuldt omprogrammeret kolonier kan udvides. Den sidste fase er modning af iPSC kloner. Den indledende ekstraktion af fostervand membran stamceller er opnået ved hjælp af en kombineret mekaniske og Enzymatisk nedbrydning af dyr. Vi fandt, at en inkubationstiden på 30 min. resulteret i det højeste antal celler udvundet med de højeste levedygtighed. Proceduren for fordøjelsen kan producere små stykker af vævs- og klumper. Hvis andelen af disse i forhold til enkelte celler er høj, anbefaler vi plating alle klumper og enkelt celler ind i en beholder, da alle kan bidrage til outgrowths af vedhængende celler. Plating fostervand væske stamceller er ligetil, som cellerne er kun blandes med næringssubstratet og inkuberes indtil kolonier af vedhængende celler når en tilstrækkelig størrelse. Regelmæssig vævskultur-behandlede plasticware der passer perfekt og vi kan ikke anbefale speciale overflader, selv om de er beregnet til forbedret primær cellekultur, da disse vi observerede lavere viabilities og vanskeligheder med den passaging proces.
Fostervand væske og membran stilk celler bør udvides og lagre frosset, men på den tidligste bekvemmelighed, cellerne kan bruges som kildecellerne for omprogrammering. Med henblik på indførelsen af de episomal plasmider ind i cellerne, Transfektion systemet anvendes her med Transfektion parametrene til 950 V, har 40 ms, og 1 puls udført meget godt, med alle linjer forsøgte i sidste ende med succes omprogrammerede) over 10 linjer). De vigtigste konkurrerende levering system opererer på et lignende princip kunne ikke frembringe et vellykket omprogrammering eksperiment i vores hænder.
Transfected cellerne udsås på vitronectin-belagt retter i AFMC medium for de første 3-5 dage, så mediet er skiftet til E8 suppleret med 100 µM natrium butyrat. Dette øger satsen for fuld pluripotency erhvervelse. De første tegn på morfologiske transformation kan ses så tidligt som i 48-72 h. Kildecellerne gennemgå MET og kolonier af celler med epitelial morfologi vises. Disse gradvist formere sig og bliver kompakt. Et undersæt af kolonierne vil erhverve de morfologiske funktioner fuldt pluripotente stamceller – individuelt mærkbar celler med fremtrædende kerner og nucleoli, observeret flade kolonier med veldefinerede grænser, i modsætning til de fuzzy grænser i delvis pluripotente MET kolonier. På tidspunktet for erhvervelsen af fuld pluripotency kompakt MET celle kolonier erhverve fremtrædende kerner og de enkelte celler blive mærkbar samtidig at skabe en unik morfologiske mønster. At et trænet øje er dette mønster et tydeligt tegn på vellykket omprogrammering. Men at en efterforsker, der mangler PSC kultur uddannelse, identifikation af kolonier, der har med held udviklet sig til fuld pluripotency kræver omhyggelig vurdering som markedsøkonomisk behandling og iPSC kloner kan forveksles med hinanden. Figur 1 og figur 2 giver eksempler på begge dele. Hvis MET kloner er plukket i stedet, grundig flow flowcytometri analyse vil afsløre fejlen, og navnlig TRA-1-60 og TRA-1-81 antigener vil højst sandsynligt være fraværende som vist i figur 2. Faktisk, TRA antigener fandtes tidligere for at være strenge pluripotency markører. Dog kunne delvist pluripotente MET celler være af interesse for kræft forskning25.
Denne kultur betingelse er ikke optimalt for kilde AFSC/AMSC og til sidst, deres spredning vil bremse og de får en fladere, fibroblast-lignende morfologi. Kildecellerne danne væv, der kan løsne sig fra overfladen under de senere faser af omprogrammering, men dette ikke berører negativt omprogrammering processen. Tværtimod fører processen undertiden til at frigøre plads til de omprogrammerede kolonier, samtidig fjerne uønskede un-omprogrammeret cellulære materiale. Fritliggende væv kan nemt blive kasseret ved hjælp af en steril pipette tip, forlader delvist og fuldt pluripotente kolonier bag, høj grad forenkle manuel udvælgelse nedstrøms.
Til manuel plukning af de fuldt omprogrammeret kolonier bruger vi en LCD imaging system, der kan placeres i sikkerhed kabinet, mangler dele fremspringende ud at ville forstyrre luftstrømmen. End denne billedbehandlingssystem, er ingen særlige udstyr nødvendig som plukning, selv kan udføres ved hjælp af regelmæssig pipetter. De plukkede kolonier er delvis adskilles i EDTA/PBS løsning før bliver forgyldt i target brønd til at vokse ud som kloner. Afhængigt af linjen og klon, for flere passager, kan kulturer være forurenet med spontant differentiere celler. Manuel manipulation og seriel passaging eliminere normalt dette problem. Kloner befængt med omfattende differentiering skal kasseres, men dyrebare kloner kan reddes med forskellige grader af succes ved gentagen manuel plukning af pluripotente kolonier i stedet bortskaffe differentiere celler. Episomal plasmider viste sig at tage omkring 15 passager til at være tabt helt fra iPSC26. Derfor er det tilrådeligt at tillade kloner til at vokse mindst antallet passager før du bruger dem for downstream applikationer og analyser, med undtagelse af rutinemæssig overvågning af TRA antigen udtryk og karyotype. TRA antigen udtryk kan nemt overvåges ved flowcytometri, som beskrevet her i protokollen, da analysen kun kræver omkring 200.000 celler, og kan udføres, når forskerne er i tvivl om, hvorvidt de kulturperler kloner fastholder pluripotency korrekt. Flow flowcytometri analyse af ESC markør udtryk er ikke anses for at være tilstrækkeligt til at bekræfte pluripotency i kandidat linjer19.
Teratom dannelse assay er standard afgørende pluripotency test27. PSC vokset i kemisk definerede, xeno-fri betingelser er særligt modtagelige for dissociation-induceret død og dermed tilføre dem subkutant som klumper er nødvendige for deres succesfulde implantation8,28. Efter injektion, normalt 4-6 uger er nok for væksten af xeno-grafts kan ses og før uge 8, kan alle være høstet, H & E-farvede og analyseret. Dyrevelfærd, omkostninger og lang test perioder behov er grunde til at udvikle alternative metoder. Genomisk analyser kombineret med avanceret, machine learning-drevne bioinformatic tilgange kan give en præcis vurdering af globale udtryk profiler. Omkostningerne ved at opnå sådanne data er sammenlignelige omkostninger ved teratom dannelse assay, dog den genomiske fremgangsmåde er betydeligt hurtigere og ingen dyr skal anvendes. En sådan analyse er en bioinformatic pluripotency evaluering software22. Det er implementeret som en online interface (Tabel af materialer). Den voksende popularitet og faldende omkostninger i RNA sekventering vil sikre kontinuiteten i denne tilgang. Et alternativ til denne pluripotency software er tilgængelig fra Johns Hopkins University23 (cellnet.hms.harvard.edu) og er baseret på en lignende fremgangsmåde og er i stand til at acceptere microarray data til at analysere transkriptom menneskelige prøver. Fordelen ved denne software er, at det har evnen til at identificere ikke kun pluripotente stamceller, men også opdelte celler og siden dens kurateret datasæt var afledt af primære væv, grad af lighed mellem in vitro vokset celler / væv og in vivo væv kan bestemmes, at levere en fremragende kvalitetskontrol for udviklingen af differentiering protokoller eller vævsmanipulering. Testen har kapacitet til at klassificere forespørgslerne i 20 forskellige celler eller vævstyper. På nuværende tidspunkt, det kræver microarray data men forfatterne arbejder på at udvide platformen muligheder til RNA sekventering så godt.
Ved at følge den præsenterede protokol, kan forskere generere iPSC linjer fra fostervand væske og membran stamceller med en meget høj reproducerbarhed i fuldt kemisk definerede og xeno-frit medium og ved hjælp af en ikke-integrere omprogrammering metode. Disse linjer kan bruges i grundforskning til at optimere differentiering protokoller og i sidste ende i sygdom modellering, stof screening eller pediatric tissue engineering undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Fonds Medizinische Forschung på universitetet i Zürich, Forschungskredit af universitetet i Zürich, The SCIEX NMSCh under stipendier 10.216 og 12.176, den schweiziske samfund kardiologi, The Swiss National Science Fundamentet under Grant [320030-122273] og [310030-143992], 7. rammeprogram, liv ventil, Europa-Kommissionen under tilskud [242008], Olga Mayenfisch Foundation, EMDO Foundation, starttilskud 2012 af Zürich Universitetshospital og interne finansiering af Mitchell Cancer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | tissue dissociation system, dissociator |
| Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) | Thermo-Fisher | 3120032 | |
| 70 µm cell strainers | Corning | 10054-456 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo-Fisher | 32404014 | |
| rocking platform | VWR | 40000-300 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339652 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339650 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC-3156 | basal medium for AFMC medium |
| FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) | Prospec Bio | CYT-218 | bFGF, supplement for AFMC medium |
| EGF Human, Pichia | Prospec Bio | CYT-332 | EGF, supplement for AFMC medium |
| LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant | Prospec Bio | CYT-022 | IGF, supplement for AFMC medium |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified | Thermo-Fisher | 10439024 | FBS |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo-Fisher | 15240062 | for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells! |
| Accutase cell detachment solution | StemCell Technologies | 07920 | cell detachment enzyme |
| CryoStor™ CS10 | StemCell Technologies | 07930 | complete freezing medium |
| PBS, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 10010023 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | for plasmid isolation |
| pEP4 E02S EN2K | Addgene | 20925 | EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4 |
| pEP4 E02S ET2K | Addgene | 20927 | ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4 |
| pCEP4-M2L | Addgene | 20926 | M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28 |
| NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000C | spectrophotometer |
| Neon® Transfection System | Thermo-Fisher | MPK5000 | transfection system, components: Neon pipette - transfection pipette Neon device - transfection device |
| Neon® Transfection System 10 µL Kit | Thermo-Fisher | MPK1025 | consumables kit for the Neon Transfection System, it contains: Neon tip - transfection tip Neon tube - transfection tube buffer R - resuspension buffer buffer E - electrolytic buffer |
| Stemolecule™ Sodium Butyrate | StemGent | 04-0005 | small molecule enhancer of reprogramming |
| TeSR-E8 | StemCell Technologies | 05940 | E8 medium |
| Vitronectin XF™ | StemCell Technologies | 07180 | VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer |
| CellAdhere™ Dilution Buffer | StemCell Technologies | 07183 | vitronectin dilution buffer |
| UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | dilute with PBS to 0.5 mM before use |
| EVOS® FL Imaging System | Thermo-Fisher Scientific | AMF4300 | LCD imaging microscope system |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | phase contrast cell culture microscope | |
| Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo-Fisher | 28908 | dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week |
| Perm Buffer III | BD Biosciences | 558050 | permeabilization buffer, chill to -20 °C before use |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 557782 | isotype control for Oct3/4A, Nanog |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 557783 | isotype control for Sox2 |
| Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 561628 | |
| Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 560791 | |
| Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 562139 | |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 401617 | isotype control for TRA-1-60 |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401618 | isotype control for TRA-1-81 |
| Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 330613 | |
| Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330705 | |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 400129 | isotype control for SSEA-1 |
| Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401321 | isotype control for SSEA-4 |
| Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 323010 | |
| Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330407 | |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 | Jackson Immunoresearch | 115-606-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 | Jackson Immunoresearch | 115-546-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D21490 | stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution |
| Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | basement membrane matrix (BMM) |
| scid-beige mice, female | Taconic | CBSCBG-F | |
| RNeasy Plus Mini Kit (50) | Qiagen | 74134 | RNA isolation kit |
| T-25 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156367 | |
| T-75 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156499 | |
| Nunc™ tissue-culture dish | Thermo-Fisher | 12-567-650 | 10 cm tissue culture dish |
| 6-well plates, tissue-culture treated | Thermo-Fisher | 140675 | |
| Neubauer counting chamber (hemacytometer) | VWR | 15170-173 | |
| Mr. Frosty™ Freezing Container | Thermo-Fisher | 5100-0001 | freezing container |
| FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml | Corning | 352058 | 5 ml polystyrene tubes |
| Eppendorf tubes, 1.5 ml | Thermo-Fisher | 05-402-96 | 1.5 ml microcentrifuge tubes |
| PCR tubes, 200 µl | Thermo-Fisher | 14-222-262 | |
| pipette tips, 100 to 1250 µl | Thermo-Fisher | 02-707-407 | narrow-bore 1 mL tips |
| pipette tips, 5 to 300 µl | Thermo-Fisher | 02-707-410 | |
| pipette tips, 0.1 to 10 µl | Thermo-Fisher | 02-707-437 | |
| wide-bore pipette tips, 1000 µl | VWR | 89049-166 | wide-bore 1 mL tips |
| glass Pasteur pipettes | Thermo-Fisher | 13-678-20A | |
| ethanol, 200 proof | Thermo-Fisher | 04-355-451 | |
| vortex mixer | VWR | 10153-842 | |
| chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass | Thermo-Fisher | 155409 | glass-bottom confocal-grade cultureware |
| 22G needles | VWR | 82002-366 | |
| insulin syringes | Thermo-Fisher | 22-253-260 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixation of explanted teratomas |
| Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip | Illumina | BD-103-0204 | expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer |
| PrimeView Human Genome U219 Array Plate | Thermo-Fisher | 901605 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest |
| GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array | Thermo-Fisher | 902482 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest |
| PluriTest® | Coriell Institute | www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data - *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data | |
| CellNet | Johns Hopkins University | cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data - *.cel files, soon to support RNA sequencing data |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 (3), 194-200 (2016).
- Schmidt, D., et al. Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source. Circulation. 116 (11 Suppl), I64-I70 (2007).
- Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth. Placenta. 32, S316-S319 (2011).
- Weber, B., et al. Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation. Biomaterials. 33 (16), 4031-4043 (2012).
- Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects. Cardiovasc. Pathol. 25 (4), 300-305 (2016).
- Slamecka, J., et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 15 (2), 234-249 (2016).
- Jiang, G., et al. Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
- Pipino, C., et al. Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking. Cell. Reprogram. 16 (5), 331-344 (2014).
- Cai, J., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells. J Biol. Chem. 285 (15), 11227-11234 (2010).
- Ge, X., et al. Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells. Stem Cells Dev. 21 (15), 2798-2808 (2012).
- Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res. Ther. 6 (1), (2015).
- Kang, N. -H., et al. Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells. Cancer Gene Ther. 19 (8), 517-522 (2012).
- Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol. Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
- Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
- Adewumi, O., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
- Müller, F. -J., et al. A bioinformatic assay for pluripotency in human cells. Nature Methods. 8 (4), 315-317 (2011).
- Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering. Cell. 158 (4), 903-915 (2014).
- Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma. STEM CELLS. 25 (3), 723-730 (2007).
- Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2014).
- Müller, F. -J., Goldmann, J., Löser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6 (5), 412-414 (2010).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
