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Developmental Biology

reprogramming प्राथमिक एमनियोटिक द्रव और झिल्ली कोशिकाओं एक्सो में Pluripotency करने के लिए-मुक्त शर्तों

Published: November 27, 2017 doi: 10.3791/56003
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 3,4,5, 1, 1
1Mitchell Cancer Institute, University of South Alabama, 2College of Medicine, University of South Alabama, 3Institute for Regenerative Medicine, University of Zurich, 4Department of Dermatology, University Hospital Zurich, 5Center for Applied Biotechnology and Molecular Medicine (CABMM), University of Zurich - Irchel Campus

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन प्राथमिक एमनियोटिक द्रव और झिल्ली mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के reprogramming में प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग कर एक गैर एकीकृत episomal दृष्टिकोण पूरी तरह से रासायनिक परिभाषित शर्तों में । निष्कर्षण, संस्कृति, reprogramming, और कड़े तरीकों द्वारा परिणामी प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं के लक्षण वर्णन की प्रक्रिया विस्तृत रहे हैं ।

Abstract

ऑटोलॉगस सेल आधारित चिकित्सा प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं की शुरूआत के साथ एक वास्तविकता के करीब कदम मिला । इस तरह के एमनियोटिक द्रव और झिल्ली mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के रूप में भ्रूण स्टेम सेल, ऊतक इंजीनियरिंग में वादा के साथ और भविष्य बाल चिकित्सा हस्तक्षेप और स्टेम सेल बैंकिंग के लिए iPSC में reprogramming के लिए एक अद्वितीय प्रकार के विभेदित कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को निकालने और संवर्धन प्राथमिक एमनियोटिक द्रव और झिल्ली mesenchymal स्टेम कोशिकाओं और उत्पादन episomal प्रेरित pluripotent इन कोशिकाओं से पूरी तरह से रासायनिक परिभाषित संस्कृति में स्टेम कोशिकाओं के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया का वर्णन मानव संयोजक vitronectin और E8 माध्यम का उपयोग शर्तें । नई लाइनों के लक्षण-प्रवाह cytometry, फोकल इमेजिंग, टेराटोमा गठन और transcriptional profiling-के कड़े तरीकों को लागू करने से वर्णन भी वर्णित है । नव जनित लाइनों भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के एक्सप्रेस मार्करों-Oct3/4a, Nanog, Sox2, तर्-1-60, तर्-1-81, SSEA-4-जबकि SSEA-1 मार्कर के लिए नकारात्मक जा रहा है । स्टेम सेल लाइनों फार्म teratomas में scid-बेज रंग चूहों में 6-8 सप्ताह और teratomas सभी तीन रोगाणु परतों के ऊतकों प्रतिनिधि होते हैं । Transcriptional वैश्विक अभिव्यक्ति microarray डेटा प्रस्तुत करने के द्वारा लाइनों की रूपरेखा एक bioinformatic pluripotency मूल्यांकन एल्गोरिथ्म समझा सभी लाइनों pluripotent और इसलिए, इस दृष्टिकोण पशु परीक्षण के लिए एक आकर्षक विकल्प है । नई iPSC लाइनें आसानी से बहाव में भिंनता और ऊतक इंजीनियरिंग के अनुकूलन शामिल प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

प्रेरित pluripotent स्टेम सेल की प्रौद्योगिकी (iPSC) संभावित सेल प्रतिस्थापन उपचार, रोग और विकासात्मक मॉडलिंग के बारे में लाता है, और दवा और विषाक्तता स्क्रीनिंग1,2,3। प्रतिस्थापन चिकित्सा वैचारिक रूप से सेल इंजेक्शन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, इन-विट्रो विभेदित ऊतक (जैसे कार्डियक पैच के रूप में) आरोपण, या ऊतक इंजीनियरिंग के माध्यम से निर्देशित पुनर्जनन. एमनियोटिक द्रव (AFSC) और झिल्ली स्टेम सेल (AMSC) इन उपायों के लिए या तो सीधे4,5,6,7 या reprogramming के लिए एक प्रारंभिक सेल जनसंख्या के रूप में कोशिकाओं का एक उत्कृष्ट स्रोत है pluripotency8,9,10,11,12में ।

प्रारंभिक दृष्टिकोण अपरिभाषित संस्कृति प्रणालियों या reprogramming तरीकों कि constructs9,10,11,12के जीनोमिक एकीकरण की आवश्यकता का इस्तेमाल किया । एक और हाल ही में अध्ययन एक एक्सो मुक्त माध्यम कार्यरत है, भले ही एक कम परिभाषित तहखाने झिल्ली लगाव मैट्रिक्स (बीएमएम), एमनियोटिक द्रव उपकला कोशिकाओं से iPSC उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हालांकि, टेराटोमा गठन परख के साथ अध्ययन में शामिल नहीं था की एक धन के साथ इन विट्रो और आणविक डेटा । एमनियोटिक द्रव उपकला कोशिकाओं को एक मोटे तौर पर 8 गुना उच्च reprogramming क्षमता है जब नवजात fibroblasts13की तुलना में पाया गया । एक अंय अध्ययन में, mesenchymal एमनियोटिक द्रव से स्टेम कोशिकाओं को भी iPSC में एक बहुत उच्च दक्षता के साथ reप्रोग्राम किया जा पाया गया12।

Pluripotent स्टेम कोशिकाओं के ऊतकों सभी 3 रोगाणु परतों के प्रतिनिधि में विभेदित किया जा सकता है और इस तरह व्यापक क्षमता है । बाल चिकित्सा रोगियों को फसल कटाई, reprogramming, और उनके ऑटोलॉगस एमनियोटिक द्रव स्टेम कोशिकाओं के ऊतक इंजीनियरिंग के जंम के पूर्व और एमनियोटिक झिल्ली स्टेम सेल perinatally से लाभ हो सकता है । इसके अलावा, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव के अपेक्षाकृत कम स्तर (वयस्क स्टेम सेल14,15) सैद्धांतिक रूप से iPSC16में स्रोत कोशिकाओं से epigenetic पूर्वाग्रह का स्वीकार्य प्रतिधारण को संबोधित करने में सहायता कर सकता है ।

यहाँ हम संयोजक vitronectin17 (VTN) episomal plasmids18का उपयोग करने पर रासायनिक रूप से परिभाषित एक्सो-मुक्त E8 माध्यम में pluripotency करने के लिए एमनियोटिक द्रव और झिल्ली स्टेम कोशिकाओं reprogramming के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । reprogramming के लिए कोशिकाओं के एक स्रोत के रूप में एमनियोटिक द्रव और झिल्ली कोशिकाओं का मुख्य लाभ उनकी उपलब्धता पूर्व में निहित है और perinatally और इस प्रकार इस दृष्टिकोण मुख्य रूप से बाल चिकित्सा ऊतक इंजीनियरिंग में अनुसंधान लाभ होगा ।

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Protocol

प्रोटोकॉल मानव अनुसंधान के लिए आचार समिति के संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन करता है । रोगी की लिखित सहमति अनुसंधान के लिए एमनियोटिक द्रव का उपयोग करने के लिए प्राप्त किया गया था ।

इस प्रोटोकॉल संस्थागत पशु देखभाल और दक्षिण अलबामा के विश्वविद्यालय के उपयोग की समिति की नीतियों के बाद ।

1. अलगाव और प्राथमिक एमनियोटिक Mesenchymal स्टेम सेल की संस्कृति

  1. एमनियोटिक द्रव कोशिकाओं की चढ़ाना
    1. एक चिकित्सक द्वारा amniocentesis की प्रक्रिया में काटा एमनियोटिक द्रव के २.५ मिलीलीटर की एक ंयूनतम प्राप्त करें ।
      नोट: जीवित कोशिकाओं और ऊतक के सभी हैंडलिंग एक बाँझ ऊतक में प्रदर्शन किया जाना चाहिए-संस्कृति कैबिनेट और उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए. बुनियादी कोशिका संस्कृति और बाँझ तकनीक के साथ अपनेपन की आवश्यकता है ।
    2. एमनियोटिक द्रव और झिल्ली सेल (सास्त्र) संस्कृति माध्यम तैयार: इबीएम-2 बेसल मध्यम, 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), bFGF के 20 एनजी/एमएल, 25 EGF के एनजी/एमएल के 10 एनजी/ प्राथमिक एमनियोटिक द्रव के रूप में अच्छी तरह से एमनियोटिक झिल्ली स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति के लिए, मध्यम एंटीबायोटिक antimycotic समाधान के साथ पूरक होना चाहिए ।
    3. दिन पर 0, T25 कुप्पी में सास्त्र संस्कृति मध्यम और प्लेट की ३.५ मिलीलीटर के साथ एमनियोटिक द्रव की २.५ मिलीलीटर मिश्रण । ३७ ° c पर मशीन और 5% सह के लिए2 कम से ४८ ज कालोनियों की उपस्थिति के लिए जांच करने से पहले परेशान ।
    4. 5 दिन, अनुयाई कोशिकाओं की कालोनियों मौजूद होना चाहिए । धीरे के लिए कोशिकाओं है कि पूरी तरह से नीचे और मलबे और निर्वात-महाप्राण खर्च मध्यम/एमनियोटिक द्रव एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर मिश्रण का पालन नहीं किया उखाड़ फेंक कुप्पी रॉक । ताजे सास्त्र माध्यम के ५ मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित करें.
    5. एक और 5 दिनों के लिए संस्कृति । परिवर्तन मध्यम हर दूसरे दिन के रूप में 1.1.4 कदम में वर्णित है ।
  2. मानव amnion से प्राथमिक mesenchymal स्टेम कोशिकाओं का अलगाव
    1. , नवीनतम में 24 घंटे के भीतर जन्म के बाद जितनी जल्दी हो सके अपरा प्राप्त सेलुलर अखंडता को अधिकतम करने के लिए । amnion के एक 9 सेमी2 खंड में कटौती, रक्त के थक्के को हटाने और एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में धोने के साथ 30 पंजाब के एमएल एंटीबायोटिक antimycotic समाधान के साथ पूरक ।
    2. एक बाँझ 10 सेमी टिशू कल्चर डिश में ठीक टुकड़े करने के लिए नश्तर की एक जोड़ी का उपयोग झिल्ली कीमा । झिल्ली के पाचन और कोशिकाओं की निकासी एक ऊतक पृथक्करण प्रणाली का उपयोग कर प्राप्त किया जाएगा । निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें ।
      नोट: नख़रेबाज़ के बाद ऊतक के महीन टुकड़े, उच्च कोशिका संख्या पाचन के बाद बरामद किया ।
    3. एक ऊतक पृथक्करण ट्यूब में स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर कीमा बनाया हुआ झिल्ली ऊतक द्रव्यमान हस्तांतरण और RPMI १६४० मध्यम के ४.७ मिलीलीटर के साथ मिश्रण । पृथक्करण एंजाइमों में मिश्रण ( सामग्री की तालिकादेखें).
    4. माउंट ऊतक dissociator पर ट्यूबों और भागो कार्यक्रम "h_tumor_01" । 30 मिनट के लिए एक कमाल का मंच पर ३७ ° c पर ट्यूबों मशीन ।
    5. इसके अलावा RPMI १६४० के ३५ मिलीलीटर के साथ निलंबन पतला और एक ७० µm एक ५० मिलीलीटर संग्रह केंद्रापसारक ट्यूब पर रखा छलनी के लिए लागू होते हैं ।
    6. कमरे के तापमान पर २०० x g में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक, supernatant त्यागें, RPMI १६४० के 5 मिलीलीटर में गोली स्थगित, एक hemacytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना, और १०,००० कोशिकाओं के घनत्व पर थाली/2 ऊतक संस्कृति में इलाज वाहिकाओं हौसले से तैयार के साथ सास्त्र माध्यम ने एंटीबायोटिक के साथ पूरक-antimycotic समाधान कया.
      नोट: अपूर्ण पाचन के मामले में, ऊतक के छोटे टुकड़े मौजूद हो जाएगा और एकल कोशिकाओं दुर्लभ हो जाएगा । फिर से नीचे स्पिन और एक T75 कुप्पी में पूरी गोली थाली ।
  3. प्राथमिक AFSC और AMSC की संस्कृति
    1. निर्वात द्वारा AFSC/AMSC के बीतने कालोनियों-aspirating एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर मध्यम खर्च और कुप्पी में सेल टुकड़ी एंजाइम के 2 मिलीलीटर जोड़ने । 5-8 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    2. कोशिकाओं को उखाड़ फेंक और सास्त्र मध्यम (एंटीबायोटिक antimycotic पूरक इस बिंदु से आवश्यक नहीं होना चाहिए की एक बराबर मात्रा के साथ निलंबन में मदद करने के लिए कुप्पी पर ठोकर) । के लिए २०० g पर केंद्रापसारक 4-5 min. supernatant या तो एक गिलास पाश्चर पिपेट या बस ट्यूब औंधा और यह एक अपशिष्ट कंटेनर में खाली करने के माध्यम से का उपयोग कर निकालें ।
    3. झटका केंद्रापसारक ट्यूब के नीचे तरल और चढ़ाना के लिए सास्त्र माध्यम के साथ मिश्रण के शेष ड्रॉप में एक ही सेल निलंबन में गोली तोड़ने के लिए । प्लेट टी में २,५०० और ५,००० कोशिकाओं के बीच एक घनत्व पर कुप्पी/
    4. मध्यम हर दूसरे दिन बदलें । 6 गद्यांश से परे कोशिका रेखाओं को कल्चर न करें । reprogramming प्रयोजनों के लिए, संभव के रूप में कम एक मार्ग के रूप में उपयोग करें ।
    5. पीठ के रूप में AFSC और AMSC के जमे हुए शेयरों तैयार-अप ठंड मध्यम का उपयोग कर । हार्वेस्ट एक सेल टुकड़ी एंजाइम का उपयोग संस्कृतियों, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए २०० ग्राम में केंद्रापसारक ।
    6. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर supernatant निकालें और ट्यूब के नीचे झटका करने के लिए गोली में कोशिकाओं singularize । 1 × 106/mL और cryovials में aliquot के घनत्व पर पूरा ठंड मध्यम में reसस्पैंड । -८० ° c पर रात भर एक फ्रीजिंग कंटेनर में स्टोर । फिर लंबी अवधि के स्टोरेज के लिए लिक्विड नाइट्रोजन ले जाएं ।

2. Pluripotency में reprogramming

  1. reprogramming plasmids प्राप्त करें
    1. एक गैर लाभ प्लाज्मिड भंडार के माध्यम से reprogramming plasmids खरीद । एक सामग्री हस्तांतरण समझौते की जरूरत है ।
    2. ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं में plasmids रूपांतरण और एक वाणिज्यिक प्लाज्मिड निष्कर्षण किट का उपयोग कर plasmids को अलग । निर्माता के निर्देशों का पालन करें ।
    3. एक spectrophotometer का उपयोग कर प्लाज्मिड डीएनए की एकाग्रता को मापने । एक उच्च परिणामस्वरूप प्लाज्मिड एकाग्रता के लिए निशाना लगाओ, आदर्श के आसपास 1 µ g/µ l अभिकर्मक के दौरान नमूने के कमजोर पड़ने से बचने के लिए.
    4. एक यूवी spectrophotometer का उपयोग कर व्यक्तिगत plasmids की सांद्रता को मापने और उन्हें व्यक्तिगत रूप से aliquot ।
    5. एक साथ मिश्रण 3 µ जी, 3 µ जी, और 2 µ जी के EN2K, ET2K और M2L plasmids, क्रमशः । यह reprogramming प्लाज्मिड समाधान है । प्लाज्मिड समाधान की मात्रा transfect 1 x 106 कोशिकाओं के लिए पर्याप्त है । ऐसे कई aliquots तैयार करें ।
    6. -८० डिग्री सेल्सियस पर सभी aliquots स्टोर ।
  2. लक्ष्य कल्चर प्लेट्स तैयार करें
    1. कोट एक 6 vitronectin के साथ अच्छी तरह से थाली-एक अच्छी तरह से और VTN स्टॉक समाधान के ४० µ l में मिश्रण में vitronectin कमजोर पड़ने बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें (1 µ जी/ कमरे के तापमान पर छोड़ दो (आरटी) या मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए ।
    2. वैक्यूम-महाप्राण एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके समाधान और प्रत्येक कुआं में सास्त्र माध्यम के २ मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित करें. ३७ डिग्री सेल्सियस पर स्टोर जब तक कोशिकाओं को चढ़ाया जा करने के लिए कर रहे हैं ।
      नोट: महत्वपूर्ण: इस चरण में प्रयोग होने वाले सास्त्र माध्यम में कोई भी एंटीबायोटिक या antimycotic समाधान नहीं होना चाहिए.
  3. हार्वेस्ट कल्चर्ड प्राइमरी AFSC/AMSC
    नोट: विस्तार AFSC/AMSC काफी संस्कृति में एक कम गद्यांश संख्या पर जमे हुए शेयरों बनाने के लिए और एक टी समर्पित reprogramming के लिए ७५ कुप्पी । के रूप में के रूप में कुछ के रूप में १००,००० कोशिकाओं को एक प्रयोग के लिए पर्याप्त हैं, ५००,००० कोशिकाओं के आसपास संचयन पर लक्ष्य के लिए घाटे की भरपाई और यदि अभिकर्मक मापदंडों या विभिंन संस्कृति की स्थिति का अनुकूलन के लिए परीक्षण किया जा रहे हैं ।
    1. कम समय बीतने पर जल्द सुविधा से कम, हार्वेस्ट AFSC/AMSC सेल टुकड़ी एंजाइम मिश्रण का उपयोग कर के रूप में 1.3.2 के लिए कदम 1.3.1 में वर्णित है । के बाद कोशिकाओं केंद्रापसारक गया है, अगले चरण के लिए आगे बढ़ें ।
    2. पंजाब के 1 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड और सीरम घटकों को धोने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण । किसी hemacytometer का उपयोग करके कक्षों की गणना करना. १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में पंजाब के 100,000/एमएल और aliquot के लिए सेल घनत्व को समायोजित करें । यह केवल एक न्यूनतम संपर्क समय कक्षों और अभिकर्मक के लिए उपयोग किया गया बफ़र के बीच सुनिश्चित करता है ।
    3. 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूबों के शीर्ष पर microcentrifuge ट्यूब प्लेस (एडेप्टर के रूप में, एक नियमित रूप से स्विंग रोटर में केंद्रापसारक की अनुमति होगी) और कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक । ट्यूबों पलटना और एक अपशिष्ट कंटेनर में supernatant त्यागें । एक निश्चित कोण रोटर का उपयोग न करें ।
    4. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए २०० x g पर एक अतिरिक्त केंद्रापसारक कदम प्रदर्शन करते हैं । इससे बचे हुए लिक्विड को ट्यूब की दीवारों से नीचे की ओर जमा करने की सुविधा मिलेगी । ध्यान से महाप्राण यह सब एक २०० µ l पिपेट का उपयोग कर.
  4. reprogramming plasmids के साथ अभिकर्मक
    1. reprogramming प्रयोगों के लिए, एक अभिकर्मक प्रणाली ( सामग्री की तालिकादेखें) कोशिकाओं में reprogramming plasmids वितरित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । अभिकर्मक टिप्स, अभिकर्मक ट्यूबों, resuspension बफर, और इलेक्ट्रोलाइटिक बफर टिशू-कल्चर कैबिनेट में रखें । जब तक वे खोल रहे हैं, तब वे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत की जाती हैं, तब तक किट एजेंट RT पर रखा जाता है ।
      नोट: हम किट के 10 µ एल संस्करण का उपयोग करें ।
    2. अभिकर्मक डिवाइस को बंद करें ताकि इसके ट्यूब स्टेशन को सीधे कैबिनेट में रखा जा सके । इलेक्ट्रोलाइटिक बफर के 3 मिलीलीटर के साथ एक अभिकर्मक ट्यूब भरें और स्लॉट के अंदर सभी तरह से धक्का द्वारा स्टेशन में ट्यूब माउंट ।
    3. reprogramming प्लाज्मिड समाधान aliquots-८० ° c संग्रहण से बाहर 2.1.5 चरण में तैयार और उंहें संस्कृति मंत्रिमंडल में आरटी पर गल की अनुमति ले लो ।
    4. अभिकर्मक डिवाइस पर, निंन अभिकर्मक पैरामीटर का चयन करें: ९५० V, ४० ms, और 1 पल्स ।
    5. 10 µ l resuspension बफर में १००,००० कोशिकाओं युक्त गोली reसस्पेंड. इस बिंदु से जल्दी से काम पर resuspension बफर के बाद से थोड़ा विषाक्त और एक काफ़ी कम सेल व्यवहार्यता में एक वृद्धि की जोखिम समय परिणाम है ।
    6. 1/10 में मिश्रण reprogramming प्लाज्मिड समाधान (समाधान aliquot कुल के लिए तैयार किया गया था 1 x 106 कक्ष) ।
    7. अभिकर्मक पिपेट पर एक अभिकर्मक टिप माउंट ।
    8. महाप्राण अभिकर्मक टिप में सेल निलंबन ध्यान से, हवा के बुलबुले के गठन से परहेज । यदि बुलबुले मनाया जाता है, निलंबन निष्कासित और आकांक्षा दोहराने । एयर बुलबुले अभिकर्मक में बाधा होगी ।
    9. अभिकर्मक ट्यूब में अभिकर्मक पिपेट डालें और अभिकर्मक डिवाइस की स्क्रीन पर "START" बटन दबाएं । स्क्रीन अभिकर्मक की सफलता के बारे में सूचित संदेश के लिए रुको और तुरंत ट्यूब से पिपेट हटा दें ।
    10. 1 में निलंबन के लक्ष्य 6 अच्छी तरह से धारा २.२ में तैयार की थाली निष्कासित । एक पड़ोसी अच्छी तरह से माध्यम में मिश्रण और दोनों कुओं में समान रूप से निलंबन वितरित (परिणामी कोशिका घनत्व 50000/
    11. AFSC/AMSC व्यक्तिगत रूप से युक्त सभी microcentrifuge ट्यूबों के लिए अभिकर्मक दोहराएं । ३७ ° c और 5% CO2पर मशीन में थाली प्लेस ।
  5. Culture of transfected AFSC/AMSC
    1. संस्कृति 2-5 दिनों के लिए transfected कोशिकाओं । तो 3 दिन पर सोडियम butyrate के १०० µ एम के साथ पूरक E8 से मिलकर मध्यम reprogramming के लिए स्विच ।
      नोट: द्वितीयक मार्ग स्रोत AFSC/AMSC के ऊंचा होने से बचने के लिए किया जा सकता है । हालांकि, passaging यह पैरामीटर ब्याज की है, तो सही ढंग से reprogramming दक्षता की गणना करने के लिए विकल्प को अक्षम कर देगा ।
    2. reprogramming मध्यम हर दिन 10 दिनों के लिए हर दूसरे दिन के लिए बदल जाते हैं । मध्यम दिन से हर दिन 10 पर बदलें ।
  6. क्लोनल विस्तार के लिए पूरी तरह से reprogramed कालोनियों के मैनुअल उठा
    1. पूरी तरह से पुनर्कार्यक्रम कालोनियों 14 दिन के आसपास दिखाई देते हैं । कालोनियों को आकार में विस्तार देने और कॉंपैक्ट बनने की अनुमति दें । वे मैंयुअल रूप से उठाया और 15-16 दिन के रूप में जल्दी के रूप में ताजा प्लेटों को हस्तांतरित किया जा सकता है ।
    2. 1 h उठा प्रक्रिया से पहले, कोट 24-अच्छी तरह से प्लेटें के साथ 8 µ एल VTN के ३०० µ एल में vitronectin कमजोर पड़ने बफर के (1 µ g/cm2) और आरटी या ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन । E8 माध्यम से सोडियम butyrate के बिना समाधान बदलें ।
    3. एक पर्याप्त आकार की कालोनियों का चयन करें (आदर्श व्यास में ४०० µm से अधिक) एक बाँझ संस्कृति कैबिनेट में । एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप या एक stereomicroscope इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    4. उठा के लिए, एक एलसीडी इमेजिंग माइक्रोस्कोप कैबिनेट में रखा के बाद से इसकी निगरानी oculars के लिए की आवश्यकता समाप्त इस्तेमाल किया जाएगा । ७०% इथेनॉल के साथ माइक्रोस्कोप चरण निष्फल ।
    5. एक नियमित चरण-कंट्रास्ट सेल कल्चर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, चुनें, चिह्नित करें, और नोट की गई कालोनियों की संख्या को चुना जाए । यह सुनिश्चित करें कि समय व्यर्थ नहीं है इस प्रक्रिया के लिए वास्तविक उठा के दौरान करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    6. ऐसे कई पीसीआर ट्यूबों को भरें जो पंजाब में ०.५ mM ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के 30 µ l के साथ चुनी जाने वाली कालोनियों की संख्या के बराबर या उससे अधिक है । कालोनियों को चढ़ाना पहले आंशिक पृथक्करण के लिए इन ट्यूबों में रखा जाएगा ।
    7. एक समय में 5 कालोनियों को चुनने की योजना एक 10 µ एल पिपेट सेट 2 µ एल का उपयोग कर प्लेटों से एक कोण पर कॉलोनी किनारे पर पिपेट टिप पकड़ और ध्यान से और धीरे से सतह से पूरी कॉलोनी परिमार्जन । तुरंत पूरी कॉलोनी को पिपेट टिप में महाप्राण और इसे EDTA के साथ तैयार पीसीआर ट्यूबों में से एक में ट्रांसफर कर दें ।
    8. शेष 4 कालोनियों के साथ दोहराएं । 4-6 मिनट के लिए आर टी पर मशीन ।
    9. प्लास्टिक निलंबन ऊपर और नीचे धीरे से एक बड़ा पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए छोटे झुरमुट में नीचे कॉलोनी तोड़ने । सिंगल सेल सस्पेंशन बनाने से बचें ।
    10. एक 24 अच्छी तरह से चरण 2.6.2 में तैयार की थाली की अच्छी तरह से एक लक्ष्य में सीधे निलंबन प्लेट । शेष कालोनियों के साथ दोहराएं ।
    11. 2.6.10 के माध्यम से 2.6.6 चरण दोहराएँ यदि 5 से अधिक कालोनियों को उठाया जा करने के लिए कर रहे हैं, लेकिन एक समय में 5 से अधिक कालोनियों को नहीं उठाओ । ३७ ° c और 5% कं2पर मशीन ।
  7. iPSC की क्लोनी विस्तार और परिपक्वता
    1. कालोनियों को बढ़ने और संकुचित बनने की अनुमति दें । 3-6 दिन पर्याप्त हैं । कल्चर मीडियम को रोजाना बदलें । सेल घनत्व के आधार पर ४०० µ एल और E8 मध्यम के 1 मिलीलीटर के बीच का उपयोग करें ।
    2. पर्याप्त कॉलोनी घनत्व के साथ 24 कुआं प्लेट के कुंए को 6-वेल प्लेटों में विस्तारित किया जाएगा । passaging से पहले 1 ज, कोट 6 VTN के साथ अच्छी तरह से प्लेटें (के रूप में 2.2.1 चरण में) । तो अच्छी तरह से E8 माध्यम से 2 मिलीलीटर के साथ में समाधान की जगह प्रति अच्छी तरह से ।
    3. महाप्राण एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर स्रोत कुओं से खर्च मध्यम और ०.५ mM EDTA के ३०० µ एल के साथ प्रतिस्थापित करने के लिए धो लो । महाप्राण तुरंत ही पिपेट टिप का उपयोग कर और ०.५ mM EDTA के ३०० µ एल के साथ फिर से बदलें, तो 5 min. महाप्राण सभी तरल एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर के लिए आर टी पर मशीन ।
    4. 1 मिलीलीटर पिपेट को क्षमता पर सेट करें, उस पर 1 मिलीलीटर चौड़ा-बोर टिप माउंट करें, और लक्ष्य से E8 माध्यम को अच्छी तरह से टिप में महाप्राण । स्रोत iPSC संस्कृति को मध्यम की एक धारा के साथ धोना ।
    5. निलंबन को लक्ष्य में अच्छी तरह से स्थानांतरित करें और 20-50 कोशिकाओं के झुरमुट में कालोनियों को तोड़ने के लिए कई बार ऊपर और नीचे प्लास्टिक । सुनिश्चित करें कि वे अच्छी तरह से कोमल कमाल और प्लेट मिलाते हुए और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर गर्मी में समान रूप से वितरित हो जाओ ।
    6. मध्यम दैनिक बदलें और हर 3 से 4 दिन बीतने । कोई फर्क कालोनियों चरण के तहत चिह्नित किया जा सकता है कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप और संस्कृति कैबिनेट में एक पिपेट टिप का उपयोग कर हटा दिया । यह उच्च गुणवत्ता शुद्ध iPSC संस्कृति के चयनात्मक प्रसार के लिए अनुमति देता है ।
    7. 1 passaging से पहले ज, कोट VTN के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली के कुओं के रूप में 2.2.1 चरण में । फिर E8 मीडियम के 2 मिलीलीटर के साथ घोल को अच्छी तरह से बदलें ।
    8. नित्य passaging ०.५ mM EDTA (steps 2.7.2 to 2.7.5) का प्रयोग कर के प्रारंभिक passaging के समान है । EDTA के 1 मिलीलीटर धोने और छोड़ने के साथ एक 6-अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से खर्च के माध्यम से बदलें ।
    9. EDTA के 1 मिलीलीटर जोड़ें और आरटी में आंशिक पृथक्करण के लिए 5-7 मिनट के लिए मशीन । यदि आवश्यक हो तो, यह सुनिश्चित करने के एक निलंबन के आसपास 20-५०-सेल के झुरमुट का उत्पादन किया है बनाने की मशीन समय का अनुकूलन । एकल कक्षों में पृथक्करण से बचें ।
    10. EDTA समाधान और महाप्राण 1 मिलीलीटर E8 माध्यम से एक चौड़े बोर पिपेट टिप में अच्छी तरह से लक्ष्य से एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर छोड़ें ।
    11. E8 माध्यम की एक धारा के साथ स्रोत iPSC संस्कृति से धो बार जब तक एक वांछित भाग की सतह से जारी किया गया था और अच्छी तरह से लक्ष्य में हस्तांतरण । इस भाग के विभाजन के अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है (उदा, संस्कृति के 1/8 एक 1:8 अनुपात के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है.)
    12. हर 3-4 दिन बीतने । iPSC लाइनों की अनुमति दें उंहें बहाव प्रयोगों में उपयोग करने से पहले उंहें कम से कम 15 मार्ग के लिए संवर्धन द्वारा परिपक्व

3. लक्षण वर्णन और Pluripotency की पुष्टि

नोट: प्रवाह cytometry और फोकल माइक्रोस्कोपी पर विवरण के लिए अनुपूरक फाइलों को देखें ।

  1. टेराटोमा गठन की परख
    1. iPSC की क्षमता के ऊतकों में अंतर करने के लिए निर्धारित करने के लिए टेराटोमा गठन परख द्वारा सभी तीन रोगाणु परतों के प्रतिनिधि, संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग के बारे में नीतियों का पालन करें, आगे की योजना बनाने के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल दाखिल करने के लिए समय की अनुमति दस्तावेज. चूहों में टेराटोमा गठन 6-10 सप्ताह के बीच ले जाएगा ।
    2. संस्कृति 4 दिनों के लिए iPSC लाइन प्रति एक 6-खैर प्लेट के 4 कुओं । एक माउस के एक पार्श्व में इंजेक्शन की कोशिकाओं की अनुमानित संख्या ०.५ 1 x 106 कोशिकाओं है । वैकल्पिक: एक अतिरिक्त अच्छी तरह से एक सेल टुकड़ी एंजाइम और गिनती के साथ एक सेल पृथक्करण के माध्यम से एक अच्छी तरह से एक प्रतिनिधि सेल संख्या का निर्धारण करने के लिए समर्पित किया जा सकता है ।
    3. E8/बीएमएम मिश्रण की मात्रा की गणना iPSC के झुरमुट में निलंबित कर दिया जाएगा: एक चूहे के दोनों पार्श्वों, प्रत्येक के झुरमुट निलंबन के १५० µ l के साथ इंजेक्ट कर रहे हैं । तीन चूहों एक iPSC लाइन के टेराटोमा गठन का परीक्षण करने के लिए पर्याप्त हैं । मृत मात्रा घटाने के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए परिणामी मात्रा में सुई प्रति एक अतिरिक्त १५० µ एल शामिल करें । प्रति माउस 1 सुई का प्रयोग किया जाता है । कुल मात्रा है इसलिए 3 * (१५० µ l * 2 + १५० µ l) = १३५० µ l
    4. आंशिक रूप से EDTA के साथ iPSC कालोनियों अलग के रूप में यदि वे थे, के रूप में कदम 2.7.10 करने के लिए 2.7.8 में वर्णित है । यह महत्वपूर्ण है कि कालोनियों के झुरमुट में असंबद्ध और एकल कोशिकाओं में अलग नहीं किया जा सकता है ।
    5. E8 मध्यम (चरण 3.3.3 से परिकलित मात्रा के आधे) के ६७५ µ l के साथ iPSC कालोनियों को धो लें, एक विस्तृत-बोर टिप का उपयोग कर । एक 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब में झुरमुट निलंबन स्थानांतरण । बर्फ पर जगह ।
    6. बीएमएम के ६७५ µ l के साथ जुडा है । इंजेक्शन तक बर्फ पर परिणामी निलंबन रखें ।
    7. Anesthetize चूहों को isoflurane का उपयोग कर उन्हें स्थिर करने के लिए. यह प्रदर्शन या vivarium के कुशल कर्मियों द्वारा निर्देशित किया जाना चाहिए ।
    8. भंवर 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब संक्षेप में और महाप्राण का झुरमुट निलंबन (४५० µ एल प्रति माउस) एक इंसुलिन एक 22 जी सुई के साथ सुसज्जित सिरिंज में । इंजेक्शन १५० µ एल सेल निलंबन के चमड़े के नीचे । इस खंड में लगभग 1 x 106 कक्ष है (चरण 3.1.2 देखें) ।
    9. iPSC लाइन प्रति 3 चूहों सुई. सभी प्रक्रियाओं के लिए उचित पशु देखभाल अभ्यास का पालन करें ।
    10. रोजाना चूहों के स्वास्थ्य पर नजर रखें ।
    11. जब teratomas १.५ के एक समापन बिंदु व्यास तक पहुँचने के लिए 2 सेमी, चूहों euthanize, explant teratomas, और उन्हें 24 ज के लिए ऊतक निर्धारण के लिए formalin समाधान में स्टोर.
    12. hematoxylin eosin (एच एंड ई) धुंधला के लिए एक प्रोटोकॉल कोर सुविधा के लिए फिक्स्ड teratomas लाओ । एक पैथोलॉजिस्ट सभी तीन रोगाणु परतों के ऊतकों की उपस्थिति ग्रेड होगा ।
      केरयोटाइपिंग के लिए नोट: लाइव iPSC संस्कृतियों कैरयोटाइप की अखंडता के परीक्षण के लिए विशेष सितोगेनिक प्रयोगशालाओं के लिए भेज दिया जाना चाहिए । यह सिफारिश की है कि इस परीक्षण हर 5 मार्ग प्रदर्शन किया जाएगा ।
  2. Transcriptional profile
    1. संस्कृति 3-4 दिनों के लिए एक 6-खैर प्लेट के 2 कुओं एक आरएनए नमूना प्राप्त करने के लिए । केवल उच्च गुणवत्ता संस्कृतियों का उपयोग करें, अंतर कोशिकाओं के साथ मामूली संदूषण उन्हें एक प्लास्टिक टिप का उपयोग कर परिमार्जन द्वारा संबोधित किया जा सकता है ।
    2. निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर iPSC संस्कृतियों से आरएनए को अलग करें । एक विशेष जीनोमिक कोर सुविधा के लिए नमूने जहाज ।
    3. microarrays का उपयोग कर iPSC लाइनों की वैश्विक transcriptional प्रोफाइल प्राप्त करें (समर्थित विकल्पों के लिए सामग्री की तालिका देखें) या आरएनए अनुक्रमण.
    4. Coriell संस्थान में एक ऑनलाइन अंतरफलक के माध्यम से pluripotency के bioinformatic आकलन के लिए "*. िदात" फ़ाइलें भेजें । वैकल्पिक रूप से, "*. cel" सेल प्रकार के bioinformatic पहचान के लिए फ़ाइलें, pluripotent स्टेम सेल सहित, जॉंस हॉपकिंस विश्वविद्यालय में एक ऑनलाइन इंटरफेस के माध्यम से प्रस्तुत करते हैं । व्यक्तिगत bioinformatic परख स्वीकार डेटा के प्रकार पर विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें ।

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Representative Results

सूचित लिखित सहमति रोगियों से आनुवंशिक परीक्षण प्रयोजनों के लिए एमनियोटिक द्रव संचयन और अनुसंधान के लिए तरल पदार्थ के एक छोटे aliquot समर्पित करने से पहले प्राप्त किया गया था । कोई सहमति अनुसंधान में एमनियोटिक झिल्ली के उपयोग के लिए आवश्यक है के रूप में अपरा चिकित्सा अपशिष्ट का प्रतिनिधित्व करता है । एमनियोटिक द्रव और झिल्ली स्टेम कोशिकाओं ठेठ mesenchymal गुण प्रदर्शन, आकृति उनके कोशिकाओं धुरी के आकार का है और चरण-उज्ज्वल हैं । reprogramming पर, कोशिकाओं mesenchymal से गुजरना करने वाली उपकला (मुलाकात) संक्रमण और cobblestone की तरह आकृति विज्ञान और कालोनियों के स्थानिक संगठन, उपकला गुणों का संकेत है. इस प्रक्रिया के रूप में शुरू के रूप में 48-72 एच reprogramming episomal plasmids की शुरूआत के बाद जल्दी । इन कालोनियों के 5 दिन से reprogramming के अभाव प्रयोग की विफलता का संकेत होगा । मुलाकाती कालोनियों की कोशिकाएं पैदा और नतीजतन, कालोनियां संकुचित हो जाती हैं, दिन 5 और 14 के बीच । कॉम्पैक्ट मिले कालोनियों में उन कोशिकाओं को शामिल कर रहे हैं जो आसानी से व्यक्तिगत रूप से प्रत्यक्ष (चित्र 1a) नहीं हैं । 14 दिन के आसपास, पूरी तरह से reनाभिकed कालोनियों एक monolayer में व्यवस्था की कोशिकाओं के साथ दिखाई देते हैं, प्रमुख, आसानी से प्रत्यक्ष और nucleoli ले । वे यांत्रिक रूप से पृथक और विस्तारित होने के लिए तैयार है जब कालोनियों एक उपयुक्त आकार तक पहुंचने और कॉंपैक्ट (आंकड़ा 1b) बन जाते हैं ।

पूरी तरह से और आंशिक रूप से reprogrammed कालोनियों में संस्कृतियों में मौजूद है पूरे reप्रोग्रामिंग अवधि, हालांकि आंशिक रूप से reprogrammed कालोनियों जरूरी पूर्ण pluripotency प्राप्त नहीं है । चित्रा 2 पूरी तरह से और आंशिक रूप से pluripotent कालोनियों और उनके इसी morphologies में भ्रूण स्टेम सेल (ESC) मार्कर अभिव्यक्ति का एक प्रतिनिधि प्रवाह cytometric विश्लेषण से पता चलता है । पूर्ण pluripotency Oct4, Nanog, Sox2, तर् एंटीजन और SSEA-4 की अभिव्यक्ति के साथ जुड़ा हुआ है, जबकि SSEA-1 एक्सप्रेशन नेगेटिव19,20,21 (फिगर 2a) है । आंशिक रूप से pluripotent कोशिकाओं, तथापि, Nanog और तर् एंटीजन20 (चित्रा बी) व्यक्त नहीं करते । की अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण ESC मार्करों की पुष्टि की जानी चाहिए immunocytochemical धुंधला और एक व्यापक क्षेत्र या फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर imaged (चित्रा 3) ।

pluripotency के एक कार्यात्मक पुष्टि scid-बेज चूहों में कोशिकाओं के teratomas निम्नलिखित चमड़े के नीचे इंजेक्शन के रूप में iPSC लाइनों की क्षमता का प्रदर्शन करके हासिल की है. अंत बिंदु आकार तक पहुंचने के लिए teratomas के लिए 6-8 सप्ताह की आवश्यकता होती है । एच एंड ई ऊतकों और एक पैथोलॉजिस्ट द्वारा परीक्षा के धुंधला तो सभी तीन रोगाणु परतों के ऊतकों प्रतिनिधि की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए प्रदर्शन किया है-अन्तः, neuroectoderm और त्वक (चित्रा 4a) । पशु परीक्षण के लिए एक विकल्प सीडीएनए microarrays22,23तरह जीनोमिक दृष्टिकोण से pluripotency के साथ जुड़े transcriptional हस्ताक्षर का विश्लेषण करने के लिए है । transcriptional प्रोफ़ाइल का अनुपात अच्छी तरह से स्थापित iPSC और ESC लाइनों के एक पूल में से एक के साथ ओवरलैप तो ऑनलाइन bioinformatic pluripotency मूल्यांकन सॉफ्टवेयर द्वारा मात्रा जा सकता है दो classifiers के एक भूखंड के रूप में – pluripotency और नवीनता (चित्रा 4B) । उच्च pluripotency स्कोर, अधिक क्वेरी iPSC रेखा की स्थापना लाइनों के जैसा होता है । एक उच्च नवीनता स्कोर, तथापि, विचलन या यहां तक कि गुणसूत्र विचलन का संकेत सकता है, एक उच्च pluripotency स्कोर के बावजूद (जैसे teratocarcinoma लाइनों में)22। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का पालन करते हुए उत्पन्न सभी iPSC लाइनों को फ्लो cytometry, इमेजिंग, टेराटोमा गठन, और transcriptional विश्लेषण विधियों द्वारा pluripotent समझा गया है ।

Figure 1
चित्रा 1: reprogramming के दौरान कोशिकाओं की प्रगति रूपात्मक. (क) एमनियोटिक द्रव और झिल्ली स्टेम कोशिकाओं, जो reprogramming के लिए स्रोत कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, एक ठेठ mesenchymal आकृति विज्ञान, लंबी और चरण उज्ज्वल (बाएं) जब तक वे mesenchymal से गुजरना करने वाली उपकला संक्रमण (मुलाकात) जो उपकला संपत्तियों के अधिग्रहण और पक्की पत्थर की तरह कोशिकाओं के साथ कालोनियों के गठन की ओर जाता है (केंद्र) । इन कॉलोनियों पैदा और मिले कोशिकाओं के अनियमित सेलुलर जनता (सही) पैदा करते हैं । (ख) reprogramming के बाद के चरणों में (14 दिन के आसपास से शुरू), पूरी तरह से reprogrammed कोशिकाओं की कालोनियों उभर-प्रमुख नाभिक और monolayers में व्यवस्थित nucleoli के साथ व्यक्तिगत रूप से स्पष्ट कोशिकाओं, अच्छी तरह से परिभाषित सीमाओं के साथ (केंद्र)-और कर रहे है वर्तमान के साथ मिले कालोनियों कि अधिक कई है (बाएं) । सही पर एक पूरी तरह से reप्रोग्राम पृथक परिपक्व क्लोन दिखाया गया है । स्केल बार = १०० µm कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: ESC मार्करों की अभिव्यक्ति का प्रवाह cytometric विश्लेषण पूरी तरह से और आंशिक रूप से (MET) पुनर्आयोजित कक्ष कॉलोनियों में. (क) pluripotent एक्सप्रेशन प्रोफाइल Oct4, Nanog, Sox2, तर्-1-60, तर्-1-81 और SSEA-४ के लिए पॉजिटिव है, जबकि SSEA-१ के लिए निगेटिव है. (ख) आंशिक रूप से pluripotent सेल कालोनियों – उन है कि मुलाकात से गुजरा है, लेकिन पूर्ण pluripotency के लिए प्रगति करने में विफल-Oct4 और Sox2 के लिए सकारात्मक हैं, लेकिन Nanog, तर् और SSEA प्रतिजनों अनुपस्थित रहे हैं । संबद्ध morphologies साथ-साथ तुलना के लिए शामिल किए गए हैं । स्केल पट्टियां = २०० µm और ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: परिपक्व एमनियोटिक द्रव iPSC में ESC मार्करों की अभिव्यक्ति का फोकल इमेजिंग विश्लेषण. प्रतिलेखन कारकों Oct3/4a, Nanog और Sox2 नाभिक में स्थानीयकृत रहे हैं, जबकि तर् और SSEA प्रतिजनों के लिए है नच झिल्ली पर स्थानीयकृत । स्केल बार = ५० µm. अधिक से अधिक आवर्धन की छवियां (2x विलय) उनके परमाणु स्थानीयकरण के बेहतर दृश्य के लिए Oct3/4, Nanog और Sox2 के लिए शामिल थे । स्केल बार = 25 µm. संचारित-छवियां पर अधिग्रहीत प्रकाश संचारित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: टेराटोमा गठन और परिपक्व एमनियोटिक द्रव और झिल्ली iPSC में transcriptional profiling । (क) Teratomas scid में उगाया-बेज रंग चूहों चमड़े के सभी तीन रोगाणु परतों (100X आवर्धन) के ऊतकों प्रतिनिधि होते हैं. (ख) वैश्विक अभिव्यक्ति microarray ऑनलाइन pluripotency सॉफ्टवेयर के लिए प्रस्तुत प्रोफाइल दो classifiers की एक साजिश-pluripotency और नवीनता लौट आए । उच्च pluripotency स्कोर और कम नवीनता स्कोर-लाल बादल-एक ठेठ ESC/iPSC लाइन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल संकेत मिलता है । नीले बादल एक क्लस्टर क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है विभेदित कोशिकाओं के लिए, जबकि बेहोश नीले बादल आंशिक रूप से pluripotent कोशिकाओं के लिए एक क्लस्टर क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है । एमनियोटिक द्रव (3 लाइनें) और झिल्ली (4 लाइनें) iPSC परीक्षण द्वारा pluripotent समझा रहे थे । एक ESC लाइन WA25 नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया था और यहां एक काला तीर के साथ पहचाना गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

भ्रूण स्टेम सेल से iPSC पीढ़ी के प्रारंभिक चरण में भ्रूण के ऊतकों से स्रोत कोशिकाओं की निकासी, उनकी संस्कृति, विस्तार, और episomal reprogramming plasmids की शुरूआत पर जोर देता है । इस चरण के बाद लगभग 14-18 दिनों की संस्कृति अवधि के बाद पहली बार पूरी तरह से पुनर्कार्यक्रम कालोनियों का विस्तार किया जा सकता है । अंतिम चरण iPSC क्लोन की परिपक्वता है । एमनियोटिक झिल्ली स्टेम कोशिकाओं के प्रारंभिक निष्कर्षण एक संयुक्त यांत्रिक और एंजाइमी amnion के पाचन के माध्यम से हासिल की है । हमने पाया है कि 30 मिनट की एक मशीन समय उच्चतम व्यवहार्यता के साथ निकाली गई कोशिकाओं की सबसे अधिक संख्या के परिणामस्वरूप । पाचन प्रक्रिया ऊतक और कोशिका के झुरमुट के छोटे टुकड़े का उत्पादन कर सकते हैं । इन एकल कोशिकाओं के सापेक्ष के अनुपात उच्च है, तो हम सभी अनुयाई कोशिकाओं के वृद्धि के लिए योगदान कर सकते हैं के बाद से एक पोत में सभी झुरमुट और एकल कोशिकाओं चढ़ाना सलाह देते हैं । चढ़ाना एमनियोटिक द्रव स्टेम कोशिकाओं के रूप में कोशिकाओं ही संस्कृति माध्यम के साथ मिश्रित कर रहे है और अनुयाई कोशिकाओं की कालोनियों तक पहुंचा रहे है एक पर्याप्त आकार तक पहुंच के रूप में सीधा है । नियमित ऊतक संस्कृति-इलाज plasticware पूरी तरह से उपयुक्त है और हम विशेषता सतहों की सिफारिश नहीं है, भले ही वे बेहतर प्राथमिक कोशिका संस्कृति के लिए इरादा कर रहे हैं, के साथ इन हम कम viabilities और passaging के साथ कठिनाइयों मनाया के साथ प्रक्रिया.

एमनियोटिक द्रव और झिल्ली स्टेम कोशिकाओं का विस्तार किया जाना चाहिए और जमे हुए स्टॉक लेकिन, जल्दी से सुविधा में, कोशिकाओं reprogramming के लिए स्रोत कोशिकाओं के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । कोशिकाओं में episomal plasmids की शुरूआत के प्रयोजन के लिए, अभिकर्मक प्रणाली ९५० V, ४० ms करने के लिए सेट अभिकर्मक पैरामीटर के साथ यहां इस्तेमाल किया, और 1 पल्स बहुत अच्छी तरह से प्रदर्शन किया है, सभी लाइनों के साथ अंततः सफलतापूर्वक reका प्रयास ( 10 से अधिक लाइनें) । मुख्य प्रतिस्पर्धा डिलीवरी एक समान सिद्धांत पर ऑपरेटिंग सिस्टम हमारे हाथ में एक सफल reprogramming प्रयोग का उत्पादन नहीं किया ।

transfected कोशिकाओं को पहले 3-5 दिनों तक सास्त्र माध्यम में vitronectin-लेपित पकवानों पर वरीयता प्राप्त होती है, फिर मध्यम से १०० µ मीटर सोडियम butyrate के साथ E8 पूरक की स्विचिंग की जाती है. इससे पूरा pluripotency अधिग्रहण की दर काफी बढ़ जाती है । रूपात्मक परिवर्तन के पहले लक्षण के रूप में 48-72 एच के रूप में जल्दी देखा जा सकता है । स्रोत कोशिकाओं उपकला आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं की मुलाकात और कालोनियों से गुजरना दिखाई देते हैं । ये धीरे-पैदा संकुचित हो जाते हैं. कालोनियों का एक सबसेट पूरी तरह से pluripotent स्टेम सेल के रूपात्मक सुविधाओं का अधिग्रहण करेगा-व्यक्तिगत रूप से प्रमुख नाभिक और nucleoli, अच्छी तरह से परिभाषित सीमाओं के साथ फ्लैट कालोनियों के साथ स्पष्ट कोशिकाओं, के रूप में फजी सीमाओं के विरोध में आंशिक रूप से मनाया pluripotent कालोनियों से मिले । पूर्ण pluripotency के अधिग्रहण के समय पर, कॉंपैक्ट मिले सेल कालोनियों प्रमुख नाभिक अधिग्रहण और व्यक्तिगत कोशिकाओं को प्रत्यक्ष हो, जबकि एक अद्वितीय रूपात्मक पैटर्न बनाने । एक प्रशिक्षित आंख करने के लिए, इस पद्धति सफल reprogramming का एक स्पष्ट संकेत है । हालांकि, एक अंवेषक है कि पीएससी संस्कृति प्रशिक्षण, कालोनियों है कि सफलतापूर्वक पूर्ण pluripotency के लिए प्रगति की पहचान की कमी के रूप में मिले और iPSC क्लोन एक दूसरे के लिए गलत हो सकता है सावधान मूल्यांकन की आवश्यकता है । चित्रा 1 और चित्रा 2 दोनों के उदाहरण प्रदान करते हैं । यदि मिले क्लोनों के बजाय उठाया जाता है, पूरी तरह से प्रवाह cytometry विश्लेषण गलती प्रकट होगा, और विशेष रूप से, तर्-1-60 और तर्-1-81 एंटीजन सबसे अधिक संभावना के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया अनुपस्थित हो जाएगा । दरअसल, तर् एंटीजन को पहले कड़े pluripotency मार्कर मिले थे. हालांकि, आंशिक रूप से pluripotent मिले कोशिकाओं कैंसर अनुसंधान25में ब्याज की हो सकती है ।

इस संस्कृति की स्थिति स्रोत AFSC/AMSC के लिए इष्टतम है और अंत में, उनके प्रसार को धीमा और वे एक चापलूसी, fibroblast की तरह आकृति विज्ञान प्राप्त होगा । स्रोत कोशिकाओं के ऊतकों कि reprogramming के बाद के चरणों के दौरान सतह से अलग कर सकते हैं, हालांकि यह नकारात्मक reprogramming प्रक्रिया को प्रभावित नहीं करता है । इसके विपरीत, यह प्रक्रिया कभी-कभार अन-रिप्रोग्राम्ड सेलुलर सामग्री को नष्ट करते हुए, फिर से प्रोग्राम की गई कालोनियों के लिए स्थान खाली करने की ओर ले जाती है । अलग ऊतकों को आसानी से एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग कर छोड़ दिया जा सकता है, आंशिक रूप से और पूरी तरह से पीछे pluripotent कालोनियों छोड़ने, बहुत मैनुअल चयन बहाव को सरल बनाने.

मैनुअल के लिए पूरी तरह से reके reyoured reotherd, हम एक एलसीडी इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करें, कि सुरक्षा कैबिनेट में रखा जा सकता है, किसी भी बाहर फैला है कि हवा का प्रवाह परेशान होगा भागों की कमी । इस इमेजिंग प्रणाली के अलावा, कोई विशेष उपकरण के रूप में उठा ही नियमित पिपेट का उपयोग किया जा सकता है की जरूरत है । चुना कालोनियों में आंशिक रूप से EDTA/पंजाबियों समाधान में असंबद्ध है से पहले लक्ष्य कुओं में चढ़ाया जा रहा है क्लोन के रूप में बाहर हो जाना । रेखा और क्लोन पर निर्भर करता है, कई मार्ग के लिए, संस्कृतियों सहज अंतर कोशिकाओं के साथ दूषित हो सकता है । मैनुअल हेरफेर और सीरियल passaging आमतौर पर इस समस्या को खत्म । व्यापक भेदभाव के साथ छलनी क्लोन खारिज कर दिया जाना चाहिए, तथापि, कीमती क्लोनों दोहराया pluripotent कालोनियों के बजाय अंतर कोशिकाओं के निपटान की मैनुअल उठा के माध्यम से सफलता के विभिंन डिग्री के साथ उबारा जा सकता है । Episomal plasmids के लिए लगभग 15 मार्ग ले दिखाए गए थे iPSC26से पूरी तरह से खो दिया है । इसलिए, यह क्लोन की अनुमति देने की सलाह दी जाती है के लिए विकसित करने के लिए कम से पहले मार्ग की संख्या है कि उंहें नीचे बहाव अनुप्रयोगों और विश्लेषण के लिए उपयोग करने के लिए, सिवाय नियमित निगरानी के लिए तर् प्रतिजन अभिव्यक्ति और कैरयोटाइप । तर् प्रतिजन अभिव्यक्ति आसानी से प्रवाह cytometry द्वारा निगरानी की जा सकती है के रूप में प्रोटोकॉल में यहां वर्णित है, के बाद से परख केवल २००,००० कोशिकाओं के आसपास की आवश्यकता है, और प्रदर्शन किया जा सकता है जब भी शोधकर्ताओं को संदेह में कर रहे है के रूप में है कि संस्कृतिपूर्ण क्लोन बनाए रखने ठीक से pluripotency । ESC मार्कर व्यंजक का प्रवाह cytometry विश्लेषण उम्मीदवार पंक्तियाँ19में pluripotency की पुष्टि करने के लिए पर्याप्त नहीं माना जाता है ।

टेराटोमा गठन परख मानक निर्णायक pluripotency परीक्षण27है । पीएससी में उगाया गया रासायनिक परिभाषित, एक्सो-मुक्त स्थितियों विशेष रूप से पृथक्करण प्रेरित मौत के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं और इसलिए, उन्हें चमड़े के झुरमुट के रूप में इंजेक्शन उनके सफल आरोपण8,28के लिए आवश्यक है. निंनलिखित इंजेक्शन, आमतौर पर 4-6 सप्ताह एक्सो के विकास के लिए पर्याप्त है-भ्रष्टाचारियों को दिखाई और 8 सप्ताह से पहले, सभी काटा जा सकता है, एच एंड ई दाग और विश्लेषण किया । पशु कल्याण, लागत, और लंबी परीक्षण अवधि की जरूरत वैकल्पिक तरीकों के विकास के लिए कारण हैं । जीनोमिक विश्लेषण के साथ संयुक्त उंनत, मशीन सीखने संचालित bioinformatic दृष्टिकोण वैश्विक अभिव्यक्ति प्रोफाइल का एक सटीक मूल्यांकन प्रदान कर सकते हैं । इस तरह के डेटा प्राप्त करने की लागत टेराटोमा गठन परख की लागत के लिए तुलनीय है, तथापि, जीनोमिक दृष्टिकोण काफी तेजी से है और कोई जानवरों का इस्तेमाल किया जा करने के लिए है । ऐसा ही एक परख एक bioinformatic pluripotency मूल्यांकन सॉफ्टवेयर22है । यह एक ऑनलाइन इंटरफेस (सामग्री की तालिका) के रूप में लागू किया जाता है । आरएनए अनुक्रमण की बढ़ती लोकप्रियता और सीसे की लागत इस दृष्टिकोण की निरंतरता को सुनिश्चित करेगा । इस pluripotency सॉफ्टवेयर के लिए एक विकल्प जॉंस हॉपकिंस विश्वविद्यालय23 (cellnet.hms.harvard.edu) से उपलब्ध है और एक समान दृष्टिकोण पर आधारित है और microarray डेटा को स्वीकार करने के लिए मानव नमूनों की transcriptome का विश्लेषण करने में सक्षम है । इस सॉफ्टवेयर का लाभ यह है कि यह न केवल pluripotent स्टेम कोशिकाओं की पहचान करने की क्षमता है, लेकिन यह भी अंतर कोशिकाओं और, के बाद से अपने उपचारात्मक डेटासेट प्राथमिक ऊतकों से व्युत्पंन थे, के बीच समानता का स्तर इन -इन विट्रो बढ़ी कोशिकाओं/ ऊतकों और इन-vivo ऊतकों, विभेदक प्रोटोकॉल या ऊतक इंजीनियरिंग के विकास के लिए एक उत्कृष्ट गुणवत्ता नियंत्रण प्रदान करने के लिए निर्धारित किया जा सकता है । परीक्षण 20 अलग सेल या ऊतक प्रकार में प्रश्नों को वर्गीकृत करने की क्षमता है । वर्तमान में, यह microarray डेटा की आवश्यकता है लेकिन लेखकों के रूप में अच्छी तरह से आरएनए अनुक्रमण करने के लिए मंच विकल्पों के विस्तार की दिशा में काम कर रहे हैं ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल का पालन करके, शोधकर्ताओं एमनियोटिक द्रव और झिल्ली स्टेम कोशिकाओं से iPSC लाइनों पूरी तरह से रासायनिक परिभाषित और एक्सो मुक्त माध्यम में एक बहुत ही उच्च reproducibility के साथ उत्पन्न कर सकते हैं और एक गैर एकीकृत reprogramming विधि का उपयोग कर. इन पंक्तियों बुनियादी अनुसंधान में भिंनता प्रोटोकॉल का अनुकूलन और रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग, या बाल चिकित्सा ऊतक इंजीनियरिंग अध्ययन में अंततः इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम के शौकीनों Medizinische Forschung ने ज्यूरिख विश्वविद्यालय, ज्यूरिख विश्वविद्यालय के Forschungskredit में समर्थित किया गया था, एनएमएस १०.२१६ और १२.१७६ के तहत SCIEX फैलोशिपCh , कार्डियोलोजी के स्विस सोसायटी, स्विस राष्ट्रीय विज्ञान अनुदान के तहत फाउंडेशन [320030-122273] और [310030-143992], 7 फ्रेमवर्क कार्यक्रम, जीवन वाल्व, यूरोपीय आयोग अनुदान के तहत [२४२००८], ओल्गा Mayenfisch फाउंडेशन, EMDO फाउंडेशन, शुरू अनुदान २०१२ विश्वविद्यालय अस्पताल ज्यूरिख के, और मिशेल कैंसर संस्थान की आंतरिक फंडिंग ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tumor Dissociation Kit, human Miltenyi Biotec 130-095-929 tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 tissue dissociation system, dissociator
Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) Thermo-Fisher 3120032
70 µm cell strainers Corning 10054-456
RPMI 1640 medium Thermo-Fisher 32404014 
rocking platform VWR 40000-300
50 ml centrifuge tubes Thermo-Fisher 339652
15 ml centrifuge tubes Thermo-Fisher 339650
EBM-2 basal medium Lonza CC-3156 basal medium for AFMC medium
FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) Prospec Bio CYT-218 bFGF, supplement for AFMC medium
EGF Human, Pichia Prospec Bio CYT-332  EGF, supplement for AFMC medium
LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant Prospec Bio CYT-022 IGF, supplement for AFMC medium
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified Thermo-Fisher 10439024 FBS
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo-Fisher 15240062  for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells!
Accutase cell detachment solution StemCell Technologies 07920 cell detachment enzyme
CryoStor™ CS10 StemCell Technologies 07930 complete freezing medium
PBS, pH 7.4 Thermo-Fisher Scientific 10010023 
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen 12362 for plasmid isolation
pEP4 E02S EN2K Addgene 20925 EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4
pEP4 E02S ET2K Addgene 20927 ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4
pCEP4-M2L Addgene 20926 M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28
NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000C spectrophotometer
Neon® Transfection System Thermo-Fisher MPK5000 transfection system, components:
Neon pipette - transfection pipette
Neon device - transfection device
Neon® Transfection System 10 µL Kit Thermo-Fisher MPK1025 consumables kit for the Neon Transfection System, it contains:
Neon tip - transfection tip
Neon tube - transfection tube
buffer R - resuspension buffer
buffer E - electrolytic buffer
Stemolecule™ Sodium Butyrate StemGent 04-0005 small molecule enhancer of reprogramming
TeSR-E8 StemCell Technologies 05940 E8 medium
Vitronectin XF™ StemCell Technologies 07180 VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer
CellAdhere™ Dilution Buffer StemCell Technologies 07183 vitronectin dilution buffer
UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo-Fisher 15575020 dilute with PBS to 0.5 mM before use
EVOS® FL Imaging System Thermo-Fisher Scientific AMF4300 LCD imaging microscope system
CKX53 Inverted Microscope Olympus phase contrast cell culture microscope
Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo-Fisher 28908 dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week
Perm Buffer III BD Biosciences 558050 permeabilization buffer, chill to -20 °C before use
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 557782 isotype control for Oct3/4A, Nanog
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 557783 isotype control for Sox2
Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 561628
Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 560791
Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 562139
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 401617 isotype control for TRA-1-60
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 401618 isotype control for TRA-1-81
Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 330613
Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 330705
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 400129 isotype control for SSEA-1
Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 401321 isotype control for SSEA-4
Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 BD Biosciences 323010
Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 BD Biosciences 330407
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 Jackson Immunoresearch 115-606-068 use at a dilution of 1:600 or further optimize
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 Jackson Immunoresearch 115-546-068 use at a dilution of 1:600 or further optimize
DAPI Thermo-Fisher Scientific D21490 stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution
Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free Corning 356231 basement membrane matrix (BMM)
scid-beige mice, female Taconic CBSCBG-F
RNeasy Plus Mini Kit (50) Qiagen 74134 RNA isolation kit
T-25 flasks, tissue culture-treated Thermo-Fisher 156367
T-75 flasks, tissue culture-treated Thermo-Fisher 156499
Nunc™ tissue-culture dish Thermo-Fisher 12-567-650  10 cm tissue culture dish
6-well plates, tissue-culture treated Thermo-Fisher 140675
Neubauer counting chamber (hemacytometer) VWR 15170-173
Mr. Frosty™ Freezing Container Thermo-Fisher 5100-0001  freezing container
FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml Corning 352058 5 ml polystyrene tubes
Eppendorf tubes, 1.5 ml Thermo-Fisher 05-402-96 1.5 ml microcentrifuge tubes
PCR tubes, 200 µl Thermo-Fisher 14-222-262
pipette tips, 100 to 1250 µl Thermo-Fisher 02-707-407 narrow-bore 1 mL tips
pipette tips, 5 to 300 µl Thermo-Fisher 02-707-410
pipette tips, 0.1 to 10 µl Thermo-Fisher 02-707-437
wide-bore pipette tips, 1000 µl VWR 89049-166 wide-bore 1 mL tips
glass Pasteur pipettes Thermo-Fisher 13-678-20A
ethanol, 200 proof Thermo-Fisher 04-355-451
vortex mixer VWR 10153-842
chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass Thermo-Fisher 155409 glass-bottom confocal-grade cultureware
22G needles VWR 82002-366
insulin syringes Thermo-Fisher 22-253-260
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L fixation of explanted teratomas
Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip Illumina BD-103-0204 expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer
PrimeView Human Genome U219 Array Plate Thermo-Fisher 901605 expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest
GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array Thermo-Fisher 902482 expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest
PluriTest® Coriell Institute www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data - *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data
CellNet Johns Hopkins University cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data - *.cel files, soon to support RNA sequencing data

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References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 (3), 194-200 (2016).
  4. Schmidt, D., et al. Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source. Circulation. 116 (11 Suppl), I64-I70 (2007).
  5. Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth. Placenta. 32, S316-S319 (2011).
  6. Weber, B., et al. Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation. Biomaterials. 33 (16), 4031-4043 (2012).
  7. Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects. Cardiovasc. Pathol. 25 (4), 300-305 (2016).
  8. Slamecka, J., et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 15 (2), 234-249 (2016).
  9. Jiang, G., et al. Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  10. Pipino, C., et al. Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking. Cell. Reprogram. 16 (5), 331-344 (2014).
  11. Cai, J., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells. J Biol. Chem. 285 (15), 11227-11234 (2010).
  12. Ge, X., et al. Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells. Stem Cells Dev. 21 (15), 2798-2808 (2012).
  13. Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res. Ther. 6 (1), (2015).
  14. Kang, N. -H., et al. Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells. Cancer Gene Ther. 19 (8), 517-522 (2012).
  15. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol. Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  16. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  18. Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  19. Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
  20. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  21. Adewumi, O., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
  22. Müller, F. -J., et al. A bioinformatic assay for pluripotency in human cells. Nature Methods. 8 (4), 315-317 (2011).
  23. Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering. Cell. 158 (4), 903-915 (2014).
  24. Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma. STEM CELLS. 25 (3), 723-730 (2007).
  25. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
  26. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2014).
  27. Müller, F. -J., Goldmann, J., Löser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6 (5), 412-414 (2010).
  28. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक १२९ iPSC एमनियोटिक द्रव amnion reprogramming episomal E8 माध्यम vitronectin
reprogramming प्राथमिक एमनियोटिक द्रव और झिल्ली कोशिकाओं एक्सो में Pluripotency करने के लिए-मुक्त शर्तों
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Slamecka, J., Laurini, J., Shirley, T., Hoerstrup, S. P., Weber, B., Owen, L., McClellan, S. Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions. J. Vis. Exp. (129), e56003, doi:10.3791/56003 (2017).

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