Summary
يصف لنا وضع بروتوكول لتحديد البروتينات ملزم الجيش الملكي النيبالي ورسم خريطة مناطقها ربط الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية باستخدام فوتوكروسلينكينج بوساطة الأشعة فوق البنفسجية والطيف الكتلي.
Abstract
الكشف فضله تلعب أدواراً هامة في العديد من العمليات النووية، بما في ذلك تنظيم التعبير الجيني وهيكل الكروماتين، وإصلاح الحمض النووي. وفي معظم الحالات، هو عمل الكشف فضله توسط البروتينات التي تتمثل مهامها في دورة تنظمها هذه التفاعلات مع الكشف فضله. وتمشيا مع هذا، أفيد أن عددا متزايداً من البروتينات المشاركة في المهام النووية ربط الحمض النووي الريبي، وفي بعض الحالات مناطق ربط الحمض النووي الريبي هذه البروتينات تم تعيينها، غالباً من خلال طرق شاقة، على أساس المرشح.
هنا، نحن تقرير بروتوكول مفصل لأداء بطاقة هوية غير متحيزة الفائق، والبروتين على نطاق المنظومة الحمض النووي الريبي ملزم البروتينات ومناطقها ربط الحمض النووي الريبي. المنهجية تعتمد على إدماج uridine فوتوريكتيفي التناظرية في الرنا الخلوية، تليها crosslinking البروتين بوساطة الأشعة فوق البنفسجية-الجيش الملكي النيبالي، وتحليل الطيف الكتلي لتكشف عن الجيش الملكي النيبالي كروسلينكيد الببتيدات داخل البروتين. على الرغم من أننا تصف الإجراءات المتعلقة بالخلايا الجذعية الجنينية الماوس، ينبغي تكييف البروتوكول بسهولة إلى مجموعة متنوعة من الخلايا المستزرعة.
Introduction
وغرض الأسلوب RBR-معرف هو تحديد رواية الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية) وخريطة مناطقها ربط الحمض النووي الريبي (ربرس) مع القرار مستوى الببتيد لتسهيل تصميم طفرات الحمض النووي الريبي الملزمة، والتحقيق في البيولوجية والبيوكيميائية وظائف لتفاعلات البروتين-الجيش الملكي النيبالي.
الحمض النووي الريبي فريدة من نوعها بين الجزيئات الحيوية يمكن على حد سواء بمثابة رسول يحمل المعلومات الوراثية وإضعاف أيضا في هياكل ثلاثية الأبعاد المعقدة مع الوظائف البيوكيميائية أشبه بتلك البروتينات1،2. مجموعة متزايدة من الأدلة تشير إلى أن الكشف فضله (نكرناس) تلعب أدواراً هامة في مختلف الجينات مسارات تنظيمية وجينيه،3،4،5 ، وعادة، وساطة هذه المهام التنظيمية في الحفل مع البروتينات التي تتفاعل مع الحمض النووي الريبي معين على وجه التحديد. أهمية خاصة، مؤخرا تم تحديد مجموعة من البروتينات المتفاعلة لنكرنا طويلة درس مكثف (لنكرنا) زيست، توفير نظرة ثاقبة قيمة كيف يتوسط لنكرنا هذه المنظمة إكستشروموسومي في خلايا الإناث6،7 ،8. جدير بالذكر أن العديد من هذه البروتينات زيست التفاعل لا تحتوي على أي المجالات الملزمة الجيش الملكي النيبالي9المتعارف عليه، ولذلك لا يمكن أن يكون نشاطهم الحمض النووي الريبي الملزمة المتوقعة في السيليكون استناداً إلى تسلسل الأولية بها وحدها. وبالنظر إلى أن آلاف لنكرناس يتم التعبير عنها في أي خلية معينة10، فمن المعقول أن نفترض أن العديد منهم قد تتصرف عن طريق التفاعلات مع بعد أن اكتشف الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية). ولذلك سيسهل استراتيجية تجريبية لتحديد هذه الممارسات التجارية التقييدية رواية مهمة تشريح الوظيفة البيولوجية نكرناس.
اعتمدت المحاولات السابقة لتحديد الممارسات التجارية التقييدية تجريبيا على الحمض النووي الريبي التحديد بوليا + بالإضافة إلى الطيف الكتلي (مللي ثانية)11،،من1213،،من1415. على الرغم من أن هذه التجارب إضافة العديد من البروتينات إلى قائمة المفترضة الممارسات التجارية التقييدية، حسب التصميم هم من الكشف عن بروتينات ملزمة للنصوص بوليادينيلاتيد فقط. ومع ذلك، معظم الكشف الصغيرة والعديد من لنكرناس لا بوليادينيلاتيد. 16 , 17 وعلى البروتينات المتفاعلة، وأن المرجح أن قد ضاعت في هذه التجارب. دراسة أجريت مؤخرا تطبيق التعلم آلة للبروتين-بروتين إينتيراكتومي قواعد البيانات لتحديد البروتينات التي تنقية يشترك مع الممارسات التجارية التقييدية المعروفة متعددة وأظهرت أن هؤلاء الشركاء الممارسات التجارية التقييدية المتكررة أكثر تعرضا لامتلاك الجيش الملكي النيبالي-ربط أنشطة18. بيد أن هذا النهج يعتمد على التعدين قواعد البيانات الموجودة بتفاعل كبير ويمكن فقط تحديد البروتينات التي يمكن تنقية شاركت في ظروف غير يشوه مع الممارسات التجارية التقييدية معروفة، وبالتالي تستبعد من التحليل غير قابلة للذوبان، وجزءاً لا يتجزأ من الغشاء، وندرة البروتينات.
تحديد البروتين ك حسن النية الممارسات التجارية التقييدية كثيرا ما لا تؤدي تلقائياً معلومات عن الوظيفة البيولوجية و/أو الكيميائية الحيوية للتفاعل البروتين-الجيش الملكي النيبالي. لمعالجة هذه النقطة، من المستحسن عادة تحديد البروتين من الأحماض الأمينية والمجال المخلفات تشارك في التفاعل بحيث يمكن تصميم طفرات محددة لاختبار وظيفة ربط الحمض النووي الريبي في سياق رواية كل الممارسات التجارية التقييدية19، 20-الجهود السابقة من مجموعتنا وغيرها استخدمت شظايا البروتين المؤتلف وطفرات الحذف لتحديد الحمض النووي الريبي ربط المناطق (ربرس)19،20،،من2122؛ مثل هذا النهج غير كثيفة العمالة ويتنافى مع التحليلات الفائق. في الآونة الأخيرة، وصفت دراسة استراتيجية تجريبية لخريطة الأنشطة الملزمة الجيش الملكي النيبالي بطريقة الفائق باستخدام الطيف الكتلي23؛ بيد أن هذا النهج يعتمد على تشكيلة بوليا مزدوجة + الجيش الملكي النيبالي وثم قام نفس قيود اقتراب تحديد الممارسات التجارية التقييدية المذكورة أعلاه.
قمنا بتطوير تقنية، ووصف الجيش الملكي النيبالي ملزمة المنطقة تحديد الهوية (معرف RBR)، الذي يستغل فوتوكروسلينكينج البروتين-الجيش الملكي النيبالي والكمية الكتلي للتعرف على البروتينات والبروتين مناطق التفاعل مع الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية دون صنع وبالتالي بما في ذلك الممارسات التجارية التقييدية الافتراض في حالة بوليادينيليشن الجيش الملكي النيبالي، ملزمة بالكشف بوليا24. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب تعتمد حصرا على كروسلينكينج وليس لديها مطالب على الذوبان في البروتين أو إمكانية الوصول وهو بالتالي مناسبة لتعيين أنشطة الجيش الملكي النيبالي ملزمة داخل الأغشية (مثلاً المغلف النووية) أو (مقصورات ضعيفة الذوبان مثلاً المصفوفة النووية). نحن تصف الخطوات التجريبية لتنفيذ RBR-معرف لنواة الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (ميسكس) ولكن مع إدخال تعديلات طفيفة عليها ينبغي أن يكون هذا البروتوكول مناسبة لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، شريطة أن أنها يمكن أن تتضمن كفاءة 4SU من الثقافة المتوسطة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الثقافة والتوسع في ميسكس
ملاحظة: الخلايا الجذعية الجنينية الماوس سهلة للثقافة ويمكن توسيعها بسرعة للأرقام الكبيرة المطلوبة بتجارب الكيمياء الحيوية بفضل وقتهم ركوب الدراجات بسرعة. ميسكس صحية مرتين كل 12 h.
أبقى- ميسكس التوسيع إلى العدد المطلوب في لوحات مهيلم في مسك المتوسطة (انظر أدناه) في حاضنة زراعة الأنسجة في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5% 2، و > 95% رطوبة.
ملاحظة: ينبغي إعداد لوحات ما يكفي ل replicates البيولوجية 3-5 + نموذج 4SU وعنصر التحكم--4SU. 10-سم لوح واحد (أي 5 مليون من الخلايا) أكثر من كافية لكل تكرار البيولوجية. - المتوسط ميسكس يتكون من دولبيكو ' s تعديل النسر ' s المتوسطة (دميم) وتستكمل مع 15% الجنيني البقري المصل (FBS)، 2 مم ل الجلوتامين، 0.5 x البنسلين/ستربتوميسين، 1 x الأحماض الأمينية غير الضرورية، 100 ميكرومتر بيتا-ميركابتوثانول، 1,000 يو /mL اللوكيميا العوامل المثبطة (LIF)، 3 ميكرومتر 1 ميكرومتر، CHIR99021 PD0325901.
- قبل باساجينج ميسكس، إعداد العدد المطلوب من لوحات 10 سم.
- بإضافة 4 مل جيلاتين 0.1% في الماء مع التأكد من أن تغطي كامل سطح اللوحة؛ واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT)؛ وإزالة الحل الجيلاتين.
- مرور الخلايا عندما تصل إلى 10 مليون من الخلايا كل لوح، عادة ح ~ 48 عقب التطعيم.
ملاحظة: ميسكس تنمو في مستعمرات كثيفة، لوحات ينبغي ابدأ السماح للوصول إلى كونفلوينسي 100% كما لوحظ لخطوط الخلايا التي تنمو في مونولاييرس (مثل HEK293 أو الخلايا 3T3). ينبغي أن يكون باساجيد صفيحة ©جميع عندما ~ 50% المتلاقية والتأكيد قبل المتوسط يتحول إلى اللون الأصفر.- لفصل الخلايا، غسل الأطباق مع الثقافات ©جميع كثيفة مرة واحدة في 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وتستكمل مع 2 مم يدتا، ثم إضافة التربسين 0.05% حله في دميم وإرجاع اللوحة إلى حاضنة لمدة 5 دقائق (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5% 2، و > 95% الرطوبة)-
- إزالة لوحة من الحاضنة وريسوسبيند الخلايا مع تساوي حجم دميم من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات بقوة- عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير
- وضمان أن تشكل الخلايا تعليق خلية واحدة (أي لا توجد مجموعات)، ثم الطرد المركزي خلية ز 500 x المخلوط لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 1-2 مل دميم.
- تلقيح خلايا في كثافة 10,000 الخلايا/سم 2 في مسك المتوسطة (أي ~ 800,000 الخلايا كل لوح 10 سم) باستخدام لوحات المغلفة بالجيلاتين إعدادها في الخطوة 1.3.1.
2. التشعب من البروتين – "التفاعلات الحمض النووي الريبي" في "الخلايا العيش"
ملاحظة: هو توسط crosslinking الجيش الملكي النيبالي من البروتين ريبونوكليوسيدي صور أكتيفاتابل التناظرية 4-ثيوريديني (4SU). 4SU بحد أقصى امتصاص أطول من الذاتية النيوكليوتيدات ويمكن إدراجها فقط في الجيش الملكي النيبالي؛ ولذلك يمكن استخدام الأشعة فوق البنفسجية من الطول الموجي المتوسط بصورة انتقائية التشعب الحمض النووي الريبي للبروتينات 25 ، 26. علاج الأشعة فوق البنفسجية 4SU تعامل الخلايا يؤدي إلى كروسلينكس التساهمية بين 4SU التي تحتوي على الحمض النووي الريبي والأحماض الأمينية، مع تفضيل المبلغ عنها لصور، الراديكالي ويلتقي Lys Cys 27-
- ميسكس التوسيع إلى العدد المطلوب من لوحات 10 سم كما هو موضح في الخطوة 1-
ملاحظة: ينبغي إعداد لوحات ما يكفي ل replicates البيولوجية 3-5 + نموذج 4SU وعنصر التحكم--4SU. 10-سم لوح واحد (أي 5 مليون من الخلايا) كافية لكل تكرار البيولوجية. - قبل بلوغ اللوحات كونفلوينسي، إضافة 4SU مباشرة في المتوسط بتركيز نهائي من 500 ميكرومتر. ترك-4SU مراقبة الأطباق دون علاج.
- لوحات هزة برفق لتوزيع 4SU البلوتينيوم في جميع أنحاء المتوسط. إعادتها إلى نفس الحاضنة زراعة الأنسجة ح 2 (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5% 2، و > 95% رطوبة).
- بنقل اللوحات إلى دلو الجليد وتجاهل المتوسطة-
- شطف لوحة بلطف مع 5 مل من برنامج تلفزيوني المثلج.
ملاحظة: شطف بلطف أو يمكن فصل الخلايا. - إضافة 2 مل لوحات برنامج تلفزيوني ومكان المثلج دون أغطية في كروسلينكير مجهزة بالمصابيح التي تنبعث منها الأشعة فوق البنفسجية (312 نيوتن متر). تشعيع لوحات في وضع الطاقة من 1 ي/سم 2-
ملاحظة: من المهم أن تتم إزالة الأغطية البلاستيكية أو أنها قد تحمي الخلايا من الأشعة فوق البنفسجية ومنع كروسلينكينج.
جمع الخلايا باستخدام الخلية رباعا - ونقل إلى برنامج تلفزيوني المثلج في أنابيب مخروطية الشكل. أجهزة الطرد المركزي في 2,000 س ز لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني المثلج 5 مل مع 2 مم يدتا و 0.2 مم فلوريد فينيلميثيلسولفونيل (بمسف)- حساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير
- . تتوقع الخلايا 5-10 و 10 مليون من لوحات 10 سم و 15 سم على التوالي-
- أجهزة الطرد المركزي في 2,000 س ز لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية.
ملاحظة: الخلايا الأعلاف مباشرة يمكن للخطوة 3 أو يمكن فلاش المجمدة في النتروجين السائل وتخزينه في-80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى. هذا احتمال وقف نقطة.
3. عزلة نوى
ملاحظة: نواة معزولة لإزالة البروتينات هيولى وزيادة تغطية بروتينات النووية. يمكن استبدال هذه الخطوة مع أشكال أخرى من وجود الهاتف الخلوي لدراسة الممارسات التجارية التقييدية في الأقسام الخلوية المختلفة.
- تحضير الجليد الباردة المخزن المؤقت (10 ملم تريس-HCl الرقم الهيدروجيني 7.9، 4 درجة مئوية، 1.5 مم مجكل 2، 10 مم بوكل). استخدام على الأقل 2.5 مل لكل 10 مليون من الخلايا (كما المحسوبة في الخطوة 2.9) لاستخراج.
ملاحظة: يمكن إعدادها مسبقاً مخزونات من المخزن المؤقت A (مثل زجاجة 500 مل) والمخزنة في 4 درجات مئوية لمدة 6 أشهر.- قبل الشروع في الاستخدام، إضافة ديثيوثريتول 0.5 مم (DTT) و 0.2 مم بمسف إلى المبلغ المطلوب (2.5 مل كل الخلايا 10 مليون) من المخزن المؤقت المثلج ألف
- غسل الخلايا باستخدام 2 مل المخزن المؤقت بكل الخلايا 10 مليون. تدور في 2,500 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- تجاهل المادة طافية، إضافة المخزن المؤقت باستكمالها بنسبة 0.2 في المائة منظفات النطاق، غير يشوه، مثل أوكتيل-فينوكسي-بوليثوكسي-الإيثانول (انظر الجدول للمواد)، 500 ميليلتر كل الخلايا 10 مليون. تدوير لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- أجهزة الطرد المركزي في 2,500 س ز للحد الأدنى 5
- إزالة المادة طافية؛ وبيليه تضم نواة سليمة خالية من السيتوبلازم-
ملاحظة: يمكن استخدامها فورا للخطوة 4 أو فلاش المجمدة في النتروجين السائل النوى والمخزنة في-80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى. هذا احتمال وقف نقطة.
4. تحلل نوى
ملاحظة: يتم تفكيك نوى كروسلينكيد في المخزن مؤقت كتلة المتوافقة مع قياس الطيف الكتلي للإفراج عن البروتينات ومجمعات البروتين-الجيش الملكي النيبالي.
- إضافة تحلل المخزن المؤقت (اليوريا م 9، 100 ملم تريس-HCl pH 8.0، 24 درجة مئوية)، 200 ميليلتر كل الخلايا 10 مليون. Sonicate للقص الكروماتين استخدام 1/8 " التحقيق في تحديد السعة 50% على 5-10 س.
- تدور في 12 × ز لمدة 5 دقائق و 175 جمع ميليلتر من المادة طافية لتجنب بيليه.
ملاحظة: سيتم استخدام 100 ميليلتر لمعرف RBR الخطوات المقبلة، ويمكن تخزين ميليلتر 75 المتبقية من ليساتي في-80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق و/أو تحليل لطخة غربية- - قياس تركيز البروتين عن طريق فحص برادفورد أو تقنية مماثلة 28. تخفف من تركيز البروتين في عينات مختلفة إلى 1 مغ/مل أو أدنى تركيز العينة باستخدام الكميات المناسبة من المخزن المؤقت لتحلل.
ملاحظة: من نواة ميسكس 10 مليون نتوقع 100-200 ميكروغرام من البروتين-
5. الهضم التربسين
ملاحظة: يتم هضم البروتينات لتوليد الببتيدات sأويتابل للتحليل التصاعدي الطيف الكتلي (MS).
- DTT إضافة إلى حل للنووي ليستي (5 ملم النهائي)؛ احتضانها ح 1 في الرايت
- إضافة إيودواسيتاميدي من الأسهم الطازجة (النهائي 14 مم)؛ واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام-
- ديلوت مع 5 مرات حجم 50 ملم NH 4 HCO 3
- إضافة التربسين (البروتين ميكروغرام: التربسين ميكروغرام = 200:1)؛ احتضانها في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
6. الملحي من الببتيدات
- إعداد واحد نصيحة المرحلة مصنوعة خصيصا كل عينة.
- 6.1.1. ضع قرص المواد استخراج C18 المرحلة الصلبة في الجزء السفلي من تلميح ماصة 200 ميليلتر.
- إضافة 50 ميليلتر من اليغو R3 عكس راتنج المرحلة على رأس القرص C18. ضع نصيحة المرحلة داخل محول الطرد المركزي ونصيحة المكان مع محول داخل أنبوب [ميكروفوج] 1.5 مل.
- إضافة 100 ميليلتر الاسيتو الانيتريل 100% إلى نصائح لغسل. أجهزة الطرد المركزي في 1000 غ س ل 1 دقيقة لإزالة المذيب.
- اكويليبراتي مع 50 ميليلتر 0.1% حامض trifluoroacetic (تفا). أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ز للحد الأدنى 1
- إضافة حمض الفورميك 100% للعينة هضم البروتين لخفض درجة الحموضة إلى 2-3-
ملاحظة: ينبغي أن يتطلب هذا ميليلتر ~ 5 في 1 مل عينة الببتيد المخفف، ولكن ينبغي أن تكون درجة الحموضة حمض الفورميك أكثر ويقاس أضيف إذا لزم الأمر- - العينة التحميل على تلميح المرحلة مصنوعة خصيصا، أجهزة الطرد المركزي في ز 1000 x لمدة 1 دقيقة حتى كل من عينة يمر عبر الحافة.
- أغسل ملزمة الببتيدات مع 50 ميليلتر 0.1% تفا. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ز للحد الأدنى 1
- الوتي الببتيدات بإضافة 50 ميليلتر شطف العازلة (75% الاسيتو الانيتريل، 0.025% تفا) لنصيحة المرحلة وأجهزة الطرد المركزي في 1000 غ س ل 1 دقيقة لفرض المخزن المؤقت شطف خارج الحافة.
- الجاف للعينة باستخدام أجهزة الطرد مركزي فراغ عند 150 س ز والجيش الشعبي الكوري 1-3 حاء – 1
ملاحظة: الببتيدات المجففة يمكن تخزينها في-80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى. هذا احتمال وقف نقطة.
7. إزالة من "الجيش الملكي النيبالي كروسلينكيد"
ملاحظة: علاج الببتيدات مع نوكلاس لإزالة الحمض النووي الريبي كروسلينكيد.
- ريسوسبيند بيليه في 50 ميليلتر 2 × نوكلاس المخزن المؤقت (100 ملم NH 4 HCO 3، 4 مم مجكل 2)-
- الببتيد قياس تركيز استخدام امتصاص في 280 nm افتراض 1 ملغ/مل الببتيدات ل A 280 1.
ملاحظة: أن تركيز المتوقع 1 ملغ/مل. - ضبط جميع العينات إلى 1 مغ/مل أو أدنى تركيز استخدام 2 × العازلة نوكلاس.
- إعداد مزيج رئيسي 50 ميليلتر ح 2 س + 1 ميليلتر نوكلاس درجة نقاء عالية (≥ 250 يو) (راجع الجدول للمواد) كل عينة.
- أخذ 50 ميكروليتر من عينة الببتيد وإضافة 50 ميليلتر من ح 2 س + نوكلاس سيد ميكس-
- إينكوباتي في 37 درجة مئوية حاء 1 المضي قدما لإجراء الكتلي.
ملاحظة: الببتيدات جاهزة الآن الكتلي. يمكن تحليلها فورا أو تخزينها في-80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى. هذا احتمال وقف نقطة.
8. نانو اللوني السائل، وقياس الطيف الكتلي، وتجهيز البيانات الخام
ملاحظة: نظراً للتغييرات 4SU-كروسلينكينج كتلة الببتيد، هذه الأيونات لا تحتسب كثافة الببتيد غير كروسلينكيد خلال LC-MS/MS، ولذلك الذي يظهر ليكون انخفض كروسلينكينج. درجة واتساق هذا الانخفاض يعكس درجة crosslinking البروتين-الجيش الملكي النيبالي لكل الببتيد 24-
- [هبلك] إعداد المخازن كما يلي: حمض الفورميك 0.1% في المياه [هبلك]-الصف (المخزن المؤقت A)؛ وحمض الفورميك 0.1% في الصف [هبلك] الاسيتو الانيتريل (المخزن المؤقت ب)-
- إذا كان متوفراً، نانو-[هبلك] الاتصال نانو-عمود مع المواصفات التالية: قطرها الداخلي 75 ميكرون؛ محملة بالجسيمات C18-AQ؛ طول 20-25 سم.
ملاحظة: إذا كان يتم تشغيل [هبلك] المتاحة في أعلى معدلات تدفق استخدام حجم عمود الصحيح لمعدل التدفق المشار إليه. ارتفاع التدفق اللوني يقلل حساسية- - برنامج الأسلوب [هبلك] على النحو التالي: تدفق بمعدل 250-300 nL الدقيقة؛ وتدرج من 2 إلى 28% مخزن ب في 120 دقيقة، من 28 إلى 80% ب للمقبل مدة 5 دقائق و isocratic 80% ب 10 دقيقة
ملاحظة: إذا لم يكن لديه [هبلك] تحميل عينة سابقة الموازنة الآلي عمود، بدء تشغيل البرنامج مع 10 دقيقة في 0% ب قبل تحميل العينة.
برنامج - أسلوب الحصول على مرض التصلب العصبي المتعدد لأداء اقتناء البيانات تعتمد على (DDA) كتجارب البروتيوميات بندقية قياسية. ينبغي أن البديل دورة واجب أداة مسح مرض التصلب العصبي المتعدد كامل مع جنبا إلى جنب MS مسح (أو MS/MS) من الإشارات الأكثر كثافة. استخدام الإعدادات المثلى لتشغيل البروتيوميات MS.
ملاحظة: للحصول على ثقة من النتائج، تفحص استخدام الأدوات التي يمكن أن تؤدي على الأقل ماجستير كاملة في وضع عالية الدقة (مثل أوربيتراب، وقت الطيران). للقياس الكمي الدقيق، تأكد من أن الفواصل الزمنية بين مسح مرض التصلب العصبي المتعدد كامل لم تعد من أطول س. 3 واجب دورات قد يحول دون تعريف دقيق لايون المستخرجة تشروماتوجرامس.
تحميل 1-2 ميكروغرام من العينة على العمود [هبلك] - وتشغيل الأسلوب [هبلك]-MS/MS المبرمجة. لكل تكرار البيولوجية أداء يدير المستقلة اثنين على الأقل ونعاملهم replicates التقنية-
- "بعد مرض التصلب العصبي المتعدد"، استيراد ملفات raw في حزمة برامج البروتيوميات لتحديد الأطياف MS/MS الببتيد عن طريق استخراج أيون اللوني. نوصي بحزم البرمجيات التي يمكن أن تؤدي محاذاة الكروماتوغرافي متعددة يمتد مرض التصلب العصبي المتعدد (انظر الجدول للمواد) 29 ، 30-
- إذا كان الخيار متوفراً في جناح البرمجيات، تمكين " "المباراة بين تشغيلات" " قبل البدء بتجهيز البيانات-
- بمجرد الانتهاء من التحليل، بتصدير قائمة الببتيد جنبا إلى جنب مع قيم القياس الكمي-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويصور الشكل 1 معرف RBR سير العمل. نظراً لكفاءة crosslinking منخفضة نسبيا لهذا الأسلوب، من المهم جداً للنظر في كل من مستوى استنفاد والاتساق للتأثير الملاحظ (قيمةP-) عبر replicates البيولوجية. ويبين الشكل 2 قطعة بركان RBR-معرف النتيجة. إظهار الببتيدات التي تتداخل مع المجال الحافز (المقرر) الاعتراف بالحمض النووي الريبي استنفاد متسقة عالية المستوى. المجالات المقرر استخدامها كعنصر إيجابي لتحليل RBR-معرف.
يمكن استخدام معرف RBR خريطة ربرس في الخلايا الحية. يمكن حساب درجة RBR-معرف لكل الببتيد في تقدير إمكانات ربط الحمض النووي الريبي: نقاط RBR-معرف =-تسجيل2(طبيعية + 4SU كثافة/تطبيع-كثافة 4SU) x (سجل10(قيمةP-))2. ويبين الشكل 3 heatmap عشرات معرف RBR المتوقعة على السطح فرعية سبليسيوسومال U1-70 كيلو. لون أحمر في المنطقة المجاورة لجهة الاتصال، والجيش الملكي النيبالي حسبما حددته بنية بلورية، يشير إلى الهوية الصحيحة للتفاعل البروتين-الجيش الملكي النيبالي.
عند التعرف على رواية الممارسات التجارية التقييدية وبهم ربرس، المستحسن جداً تأكيد نشاطهم الحمض النووي الريبي ملزم بطريقة مستقلة. لدينا الدراسة السابقة24، حددنا TET2 كرواية الممارسات التجارية التقييدية وتعيين نشاط الجيش الملكي النيبالي الملزمة إلى منطقة ج-طرفية، كما هو مبين في الشكل 4A برسم نقاط RBR-معرف على طول التسلسل الرئيسي للبروتين. الشكل 4B وتبين أن اشتراط هذه الرواية RBR يمكن التحقق منها عن طريق إجراء الاسمية-كليب26 استخدام تسلسل WT ومقارنة للإشارة إلى أن متحولة تفتقر RBR المتوقعة. مراقبة إضافية وشرح أكثر تفصيلاً لهذه التجربة التحقق من صحة متوفرة في أنه et al. 24من عام 2016.
رقم 1: نظرة عامة على معرف RBR. بتوليدا الماوس يتم التعامل مع 4SU أو لا (1-2) والمشع مع 312 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية (3). هي نواة معزولة (4) ومقتطفات هضمها بحوزتي ونوكلاس، مما أسفر عن الببتيدات كروسلينكيد وأونكروسلينكيد (5). أدوكتس التساهمية الجيش الملكي النيبالي في التشعب مواقع تغيير كتلة الببتيد، مما أدى إلى خفض مماثل في كثافة الطيف الشامل في الببتيد أونكروسلينكيد (6، السهم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: معرف RBR البروتين على نطاق المنظومة في ميسكس. بركان مؤامرات إظهار طي سجل التغيرات في كثافة الببتيد على المحور x والطالب t-اختبار فالقيم على المحور y لعلاجات 4SU ± (312 نيوتن متر). الببتيدات تداخل المجالات المقرر المشروح باللون الأزرق. يتم تمييز الحمض النووي الريبي ملزمة ببتيد من هنرنبك باللون الأحمر. سبق نشرها في أنه et al. عام 201624. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: معرف RBR خرائط مواقع تفاعلات البروتين – الجيش الملكي النيبالي- التكبير في مناطق بنية بلورية U1 سنرنب (معرف PDB: 4PJO31) عرض البروتين السطوح مرمزة وفقا لدرجة RBR-معرف والتفاعل الكشف عن U1-70 كيلو. سبق نشرها في أنه et al. عام 201624. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التحقق من RBR TET2- (أ) تسلسل الأولية والمجالات المعروفة ل TET2؛ مستوى بقايا ممهدة RBR-معرف النتيجة المرسومة على طول التسلسل الأساسي (الأوسط)؛ والخطة جزء المجال الحفاز معلم حانمه (CD) وحذف RBR (CDΔRBR) بنيات المستخدمة للتحقق من صحة (أسفل). (ب) الاسمية-مقطع من عابر أعرب مؤتمر نزع السلاح TET2 و ΔCDΔRBR في الخلايا HEK293. أوتوراديوجرافي ل 32ف المسمى الحمض النووي الريبي (أعلى) والتحكم لطخة غربية (أسفل). سبق نشرها في أنه et al. عام 201624. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكننا وصف بروتوكول تجريبي مفصلة لأداء RBR-معرف في ميسكس، ومع إدخال التعديلات المناسبة، في أي خلية يمكن دمج 4SU في الجيش الملكي النيبالي. أنواع خلايا أخرى قد تتطلب التحسين النهج لضمان إشارة كافية إلى نسبة الضوضاء. بالإضافة إلى ذلك، بينما وصف البروتوكول هنا يركز على دراسة الممارسات التجارية التقييدية النووية، ينبغي أن تكون التكنولوجيا RBR-معرف بسهولة تكييف الأقسام الخلوية المختلفة، مثل سيتوسول أو العضيات المحددة، باستخدام تجزئة مختلفة الاستراتيجيات. المعلمات التي قد تتطلب التحسين تشمل وقت تركيز وإدماج 4SU، فضلا عن الطاقة من الأشعة فوق البنفسجية كروسلينكينج. هذه المعلمات تعتبر هامة لضمان كفاءة تشكيل الجيش الملكي النيبالي بالبروتين كروسلينكس وتعطي إشارة مرضية إلى نسبة الضوضاء. أننا أظهرنا أن 312 ضوء الأشعة فوق البنفسجية في شمال البحر الأبيض المتوسط أكثر كفاءة بكثير في كروسلينكينج الكشف المحتوية على 4SU للبروتينات مقارنة 365 نيوتن متر فوق البنفسجية المستخدمة عادة في مقطع الاسمية32. مباشرة إجراء مقارنة لمعرف RBR مع 312 نانومتر و 365 نانومتر أظهرت أن 312 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية أسفرت عن تحديد نسبة أكبر من الممارسات التجارية التقييدية المعروفة24.
طريقتين أخرى متاحة للقيام بتحديد الممارسات التجارية التقييدية البروتين على نطاق المنظومة. واحد، يسمى ربدماب، مشابه لمعرف RBR في أن فإنه يستخدم الأشعة فوق البنفسجية crosslinking والسيدة ربدماب استخدمت لتحديد الممارسات التجارية التقييدية وخريطة أنشطتها ربط الحمض النووي الريبي في الخلايا هيلا23. هذا الأسلوب يعتمد على تحديد هوية إيجابية من الببتيدات المتاخمة لمواقع الجيش الملكي النيبالي-الربط ويعتمد على سحب متتابعة اليغو-dT اثنين-هبوطاً، مما يوحي بأنه قد يكون معدل إيجابية كاذبة أقل من RBR-معرف. مع ذلك، تسمح السحب هبوطاً فقط تحديد الممارسات التجارية التقييدية التي تربط إلى بوليا + الجيش الملكي النيبالي، وتتطلب كميات كبيرة من المواد المدخلة، تصل إلى 10-100 مرة أكثر من معرف RBR يمكن أن يؤديها RBR-معرف مع أقل قدر من 5 ميكروغرام من البروتين لتكرار البيولوجية (~ 2 ميكروغرام كل تكرار التقنية)، التي يمكن جمعها من عدد قليل من الخلايا 250,000.
الأسلوب الثاني، ووصف سونار، تعتمد على استخراج البيانات من قواعد التفاعل البروتين البروتين الكبيرة للكشف عن البروتينات التي كثيرا ما يشترك تنقية مع الممارسات التجارية التقييدية المعروفة والذي تفاعل مع هذه الممارسات التجارية التقييدية قد توسط ذلك الحمض النووي الريبي18. وهذا النهج ذكية قوية جداً ويسمح للتعرف على الممارسات التجارية التقييدية رواية دون إجراء أي تجربة مختبر الرطب، شريطة أن تتوفر قواعد بيانات مناسبة؛ ولكن لا يمكن الكشف عن مواقع التفاعل ولذلك هي تكميلية ولكن لا بديل RBR-معرف.
وباختصار، يمكن تحديد الممارسات التجارية التقييدية رواية لدينا تقنية RBR-معرف وخريطة ربرس بهم مع كميات محدودة نماذج الإدخال ودون اشتراط أي التنقية البيوكيميائية من المجمعات كروسلينكيد البروتين-الجيش الملكي النيبالي. الأسلوب الذي يجعل لا افتراض على النوع من الحمض النووي الريبي ملزمة بالممارسات التجارية التقييدية التي تم تحديدها ولذلك يمكن تعيين النشاط ملزمة الجيش الملكي النيبالي من البروتينات التي تربط إلى غير بوليادينيلاتيد، كثير منها من فضله، مما يوحي بأن معرف RBR قد يكون أسلوباً مفيداً لدراسة أدوار تنظيمية للكشف فضله.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
سنغ أيده البرنامج علماء سيرل، ومؤسسة سميث قد (C1404)، وفي آذار/مارس من الدايمات مؤسسة (1-السنة المالية-15-344). وتسلم B.A.G منح دعم من المعاهد الوطنية للصحة R01GM110174 و R01AI118891 المعاهد الوطنية للصحة، فضلا عن وزارة الدفاع منح BC123187P1. رو-ت. وأيد منح التدريب في المعاهد الوطنية للصحة T32GM008216.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed - Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
References
- Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
- Rinn, J. L., Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).
- Goff, L. A., Rinn, J. L. Linking RNA biology to lncRNAs. Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).
- Holoch, D., Moazed, D. RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression. Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cabili, M. N., et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6, 10127 (2015).
- Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nat Commun. 7, 11212 (2016).
- Wilusz, J. E., et al. A triple helix stabilizes the 3' ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails. Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).
- Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).
- Brannan, K. W., et al. SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes. Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).
- Bonasio, R., et al. Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes. Elife. 3, e02637 (2014).
- Kaneko, S., et al. Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin. Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).
- Kaneko, S., et al. Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA. Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).
- Saldana-Meyer, R., et al. CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53. Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).
- Castello, A., et al. Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells. Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
- He, C., et al. High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells. Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).
- Favre, A., et al. 4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
- Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions. J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition. Elife. 4, (2015).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. J Vis Exp. (41), (2010).
