Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Published: September 28, 2017 doi: 10.3791/56004
Automatic Translation
1,4, 1,2, 1,3, 1,3, 1,2
1Epigenetics Institute, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 3Department of Biochemistry and Biophysics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Graduate Group in Biochemistry and Biophysics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Summary

Vi beskriver en protokol for at identificere RNA-bindende proteiner og kortlægge deres RNA-bindende regioner i levende celler ved hjælp af UV-medieret photocrosslinking og massespektrometri.

Abstract

Noncoding RNA'er spiller vigtige roller i flere nukleare processer, herunder regulering af genekspression, kromatin struktur og DNA reparation. I de fleste tilfælde, er virkningen af noncoding RNA'er medieret af proteiner hvis funktioner er igen underlagt disse interaktioner med noncoding RNA'er. I overensstemmelse hermed, et stigende antal proteiner involveret i nuklear funktioner er blevet rapporteret til at binde RNA og i et par tilfælde regionerne RNA-bindende af disse proteiner er kortlagt, ofte gennem møjsommelige, kandidat-baserede metoder.

Her rapporterer vi en detaljeret protokol til at udføre en høj overførselshastighed, proteom-wide objektiv identifikation af RNA-bindende proteiner og RNA-bindende regioner. Metoden er baseret på inkorporering af en fotoreaktivt uridine analog i den cellulære RNA, efterfulgt af UV-medieret protein-RNA crosslinking og massespektrometri analyser at afsløre RNA-crosslinked peptider inden for proteomet. Selv om vi beskrive proceduren for musen embryonale stamceller, bør protokollen tilpasses nemt til en række kulturperler celler.

Introduction

Formålet med metoden RBR-ID er at identificere roman RNA-bindende proteiner (RBPs) og kortlægge deres RNA-bindende regioner (RBRs) med peptid-niveau beslutning at lette udformningen af RNA-bindende mutanter og undersøgelse af biologiske og biokemiske funktioner af protein-RNA interaktioner.

RNA er enestående blandt biomolekyler, da det kan både fungere som en budbringer, der bærer genetisk information og også fold i komplekse tredimensionale strukturer med biokemiske funktioner mere beslægtet med dem af proteiner1,2. En voksende mængde af beviser tyder på, at noncoding RNA'er (klarlægning) spiller vigtige roller i forskellige gen regulerende og epigenetiske veje3,4,5 , og typisk disse regulerende funktioner er medieret i koncert med proteiner, der interagerer med en given RNA. Af særlig relevans, var et sæt af interagerende proteiner for nylig udpeget for det intenst undersøgt lange ncRNA (lncRNA) Xist, at give værdifuld indsigt i, hvordan denne lncRNA medierer x-kromosom Inaktiveringen i kvindelige celler6,7 ,8. Navnlig, flere af disse Xist-interagere proteiner indeholder ikke nogen kanoniske RNA-bindende domæner9, og derfor deres RNA-bindende aktivitet kunne ikke forudset i siliciummangan baseret på deres primære sekvens alene. I betragtning af, at tusindvis af lncRNAs er udtrykt i en given celle10, er det rimeligt at antage, at mange af dem kan handle via interaktioner med endnu at blive opdaget RNA-bindende proteiner (RBPs). En eksperimentel strategi til at identificere disse roman RBPs vil derfor i høj grad lette opgave at dissekere den biologiske funktion af klarlægning.

Tidligere forsøg på at identificere RBPs empirisk har påberåbt sig polyA + RNA udvalg koblet til massespektrometri (MS)11,12,13,14,15. Selv om disse forsøg tilføjes listen over formodede RBPs mange proteiner, ved design kunne de kun registrere proteiner bundet til polyadenylated udskrifter. De fleste små RNA'er og mange lncRNAs er imidlertid ikke polyadenylated. 16 , 17 og deres interagerende proteiner ville sandsynligvis have været savnet i disse eksperimenter. En nylig undersøgelse anvendes maskinen læring på protein-protein interactome databaser at identificere proteiner, der co renset med flere kendte RBPs og viste, at disse tilbagevendende RBP partnere var mere tilbøjelige til at besidde RNA-bindende aktiviteter18. Men denne tilgang afhængig mining eksisterende store interaktion databaser og kan kun identificere proteiner, der kan være co renset i ikke-denatureringen betingelser med kendte RBPs, dermed udelukke fra analyse uopløselige, membran-indlejret og knappe proteiner.

Identifikation af et protein som en Bonafide RBP ofte ikke automatisk giver oplysninger om de biologiske og/eller biokemiske funktion af protein-RNA interaktion. For at løse dette punkt, er det typisk ønskeligt at identificere de protein domæne og aminosyre rester involveret i samspillet, således at specifikke mutanter kan være designet til at teste funktionen af RNA bindende i forbindelse med hver roman RBP19, 20. tidligere indsats af vores gruppe og andre har brugt rekombinante protein fragmenter og sletning mutanter for at identificere RNA bindende regioner (RBRs)19,20,21,22; men sådanne tilgange er arbejdskrævende og uforenelig med høj overførselshastighed analyser. For nylig beskrev en undersøgelse en eksperimentel strategi for at kortlægge RNA-bindende aktiviteter i en høj overførselshastighed mode ved hjælp af massespektrometri23; men denne fremgangsmåde påberåbt sig en dobbelt polyA + RNA udvalg, og således foretaget de samme begrænsninger som RBP identifikation metoder beskrevet ovenfor.

Vi udviklet en teknik, kaldet RNA bindende region identifikation (RBR-ID), som udnytter protein-RNA photocrosslinking og kvantitativ massespektrometri til at identificere proteiner og protein regioner interagere med RNA i levende celler uden at gøre antagelse om RNA polyadenylation status, herunder således RBPs bundet til polyA-RNA'er24. Desuden, denne metode afhængig udelukkende af crosslinking og har ingen krav på protein opløselighed eller tilgængelighed og er således egnet til at knytte RNA-bindende aktiviteter inden for membraner (f.eks. den nukleare kuvert) eller () tungtopløselige rum f.eks. den nukleare matrix). Vi beskriver de eksperimenterende trin for at udføre RBR-ID for kerner af musen embryonale stamceller (mESCs) men med mindre ændringer denne protokol skal være egnet til en lang række celletyper, forudsat at de effektivt kan optage 4SU fra kulturen medium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. kultur og udvidelse af mESCs

NOTE: mus embryonale stamceller er nemme at kultur og hurtigt kan udvides til det store antal kræves af biokemiske eksperimenter takket være deres hurtige cykel tid. Sund mESCs dobbelt hver 12 h.

  1. Udvid mESCs til det ønskede nummer på forklistres plader i mESC medium (se nedenfor) i en vævskultur inkubator holdt ved 37 ° C, 5% CO 2, og > 95% luftfugtighed.
    Bemærk: Nok plader bør være forberedt på 3-5 biologiske flergangsbestemmelser for de + 4SU prøve og - 4SU kontrol. En 10-cm plade (dvs. 5-10 millioner celler) er mere end tilstrækkelig nemlig hver biologiske replikat.
  2. Medium for mESCs er sammensat af Dulbecco ' s ændret Eagle ' s medium (DMEM) suppleret med 15% føtal bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 0,5 x penicillin/streptomycin, 1 x ikke-essentielle aminosyrer, 100 µM beta-mercaptoethanol, 1.000 U /mL leukæmi hæmmende faktor (LIF), 3 µM CHIR99021, 1 µM PD0325901.
  3. Inden passaging mESCs, forberede det ønskede antal 10 cm plader.
    1. Tilsættes 4 mL af 0,1% gelatine i vand og sørg for, at hele overfladen af pladen er dækket, inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur (RT), fjerne gelatine løsning.
  4. Passage celler, når de når ~ 10 millioner celler pr. plade, typisk ~ 48 h efter podning.
    Bemærk: Som mESCs vokser i tætte kolonier, plader bør aldrig kunne nå 100% confluency, som observeres for cellelinjer, der vokser i encellelag (f.eks. HEK293 eller 3T3 celler). En mESC plade skal være passaged når ~ 50% sammenflydende og helt sikkert før mediet bliver gul.
    1. At løsne celler, vaske tallerkener med tætte mESC kulturer en gang i 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) suppleret med 2 mM EDTA, derefter tilføje 0,05% trypsin opløst i DMEM og returnere plade til rugemaskine for 5 min (37 ° C, 5% CO 2, og > 95% luftfugtighed).
    2. Fjerne pladen fra inkubator og resuspend celler med lige saa stort volumen af DMEM af pipettering op og ned kraftigt flere gange.
    3. Tælle celler ved hjælp af hemocytometer og sikre, at cellerne danner en enkelt celle suspension (dvs. ingen klynger), derefter centrifugeres celle blanding 500 x g i 5 min ved stuetemperatur. Fjern supernatanten og resuspend celle pellet i 1-2 mL DMEM.
    4. Podes celler med en tæthed på 10.000 celler/cm 2 i mESC medium (dvs. ~ 800.000 celler pr. 10 cm plade) ved hjælp af gelatine-belagt pladerne forberedt i trin 1.3.1.

2. Bitmapgenkendelse af Protein – RNA interaktioner i levende celler

Bemærk: RNA-protein crosslinking er medieret af den foto-activatable ribonucleoside analog 4-thiouridine (4SU). 4SU har en længere absorbans maksimum end endogene nukleotider og kan kun indgå i RNA; intermediate-bølgelængde UVB kan derfor anvendes til selektivt bitmapgenkendelse RNA-proteiner 25 , 26. UVB behandling af 4SU-behandlede celler fører til kovalente krydsbindinger mellem 4SU-holdige RNA og aminosyrer med en rapporteret præference for Tyr, Trp, Met, Lys og Cys 27.

  1. Udvid mESCs det nødvendige antal 10 cm plader som beskrevet i trin 1.
    Bemærk: Nok plader bør være forberedt på 3-5 biologiske flergangsbestemmelser for de + 4SU prøve og - 4SU kontrol. En 10-cm plade (dvs. 5-10 millioner celler) er tilstrækkelig for hver biologiske replikat.
  2. Inden pladerne når confluency, føje 4SU direkte i medium til en slutkoncentration på 500 µM. Lad - 4SU kontrol retter ubehandlet.
  3. Ryst plader forsigtigt at distribuere 4SU ensartet i hele medium. Bringe dem tilbage til den samme vævskultur inkubator for 2 h (37 ° C, 5% CO 2, og > 95% fugtighed).
  4. Overføre plader til en isspand og kassér medium.
  5. Skylles pladen forsigtigt med 5 mL iskold PBS.
    Bemærk: Skyl forsigtigt eller celler kunne frigøre.
  6. Tilsættes 2 mL iskold PBS og sted plader uden låg i en crosslinker udstyret med UVB-emitting pærer (312 nm). Bestråle plader på en energi indstilling af 1 J/cm 2.
    Bemærk: Det er afgørende, at plast låg er fjernet, eller de kan beskytte celler fra UV-lys og forhindre crosslinking.
  7. Indsamle celler ved hjælp af celle løftere og overføre til iskolde PBS i koniske rør. Der centrifugeres ved 2.000 x g i 5 min, 4 ° C.
  8. Fjern supernatanten og resuspend celle pellet i 5 mL iskold PBS med 2 mM EDTA og 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF).
  9. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer. Forventer 5-10 og 10-20 millioner celler fra 10 cm og 15 cm plader hhv.
  10. Der centrifugeres ved 2.000 x g i 5 min, 4 ° C.
    Bemærk: Pelleted celler kan straks bruges til trin 3 eller de kan være flash-frosset i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C på ubestemt tid. Dette er en potentiel afslutningspunkt.

3. Isolering af kerner

Bemærk: kerner er isoleret til fjerne cytoplasmatisk proteiner og øge dækningen af nukleare proteiner. Dette trin kan erstattes med andre former for cellulære fraktionering at studere RBPs i forskellige cellulære rum.

  1. Forbered is kold Buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,9, 4 ° C, 1.5 mM MgCl 2, 10 mM KCl). Bruge mindst 2,5 mL pr 10 millioner celler (som tælles i trin 2.9) for udvinding.
    Bemærk: Bestande af Buffer A (f.eks. en 500 mL flaske) kan være forberedt på forhånd og opbevares ved 4 ° C for 6 måneder.
    1. Før brug, tilføje 0,5 mM dithiothreitol (DTT) og 0,2 mM PMSF til den ønskede mængde (2,5 mL pr 10 millioner celler) af iskold buffer A.
  2. Vaske celler ved hjælp af 2 mL Buffer A pr. 10 millioner celler. Spin på 2.500 x g i 5 min. ved 4 ° C.
  3. Kassere supernatanten, tilføje Buffer A suppleret med 0,2% af en nonionisk, ikke-denatureringen vaskemiddel, såsom octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol (Se Tabel af materialer), 500 µL pr. 10 millioner celler. Roter i 5 min. ved 4 ° C.
  4. Centrifugering ved 2500 x g i 5 min.
  5. Fjern supernatanten; pellet omfatter intakt kerner cytoplasma.
    Bemærk: Kerner kan anvendes straks for trin 4 eller flash-frosset i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C på ubestemt tid. Dette er en potentiel afslutningspunkt.

4. Lysis af kerner

Bemærk: Crosslinked kerner er mængden i en masse massespektrometri-kompatible buffer til at frigive proteiner og protein-RNA komplekser.

  1. Tilføj lysisbuffer (9 M urinstof, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 24 ° C), 200 µL pr. 10 millioner celler. Du kan forskyde kromatin ved hjælp af en 1/8 der sonikeres " sonde på 50% amplitude indstilling for 5-10 s.
  2. Spin på 12.000 x g i 5 min og indsamle 175 µL af supernatanten at undgå toerstoffet.
    Bemærk: 100 µL bliver brugt til de næste skridt, RBR-ID og de resterende 75 µL af lysate kan opbevares ved-80 ° C til senere brug og/eller western blot analyse.
  3. Foranstaltning proteinkoncentration via Bradford assay eller lignende teknik 28. Fortynd proteinkoncentration i de forskellige prøver på 1 mg/mL eller den laveste prøve koncentration ved hjælp af passende mængder af lysisbuffer.
    Bemærk: Fra kerner af 10 millioner mESCs forvente 100-200 µg protein.

5. Trypsin fordøjelsen

Bemærk: proteiner er fordøjet for at generere peptider Sørensenuitable for bottom up massespektrometri (MS) analyse.

  1. Tilføje DTT løsning til nukleare lysate (5 mM endelige); Inkuber i 1 time på RT.
  2. Tilføje iodoacetamide fra frisk lager (14 mM endelige); der inkuberes i 30 min. ved RT i mørke.
  3. Dilute lysate med 5 gange volumen på 50 mM NH 4 HCO 3
  4. Tilføje trypsin (µg protein: µg trypsin = 200:1); der inkuberes ved 37 ° C natten.

6. Afsaltning af peptider

  1. udarbejder en skræddersyet fase tip pr. sample.
    1. 6.1.1. Anbring en disk af faste fase udvinding C18 materiale ind i bunden af en 200 µL pipette tip.
    2. Tilsættes 50 µL af oligo R3 omvendt fase harpiks på toppen af C18-disk. Placer fase tip inde centrifugering adapter og sted spidsen med adapter inde en 1,5 mL mikrofuge tube.
    3. Tilsættes 100 µL 100% acetonitril til tips til at vaske. Der centrifugeres ved 1000 x g i 1 min til at fjerne opløsningsmidlet.
    4. Ekvilibreres med 50 µL 0,1% trifluoreddikesyre (TFA). Der centrifugeres ved 1000 x g i 1 min.
  2. Tilføje 100% myresyre til fordøjet protein prøve at sænke pH til 2-3.
    Bemærk: Dette bør kræve ~ 5 µL pr. 1 mL fortyndet peptid prøve, men pH bør måles og mere myresyre syre tilføjet evt.
  3. Belastning prøve på skræddersyede fase tip, centrifugeres ved 1000 x g i 1 min indtil alle prøve går gennem spidsen.
  4. Vask bundet peptider med 50 µL 0,1% TFA. Der centrifugeres ved 1000 x g i 1 min.
  5. Elueres peptider ved at tilføje 50 µL eluering buffer (75% acetonitril, 0.025% TFA) til fase tip og centrifugeres ved 1000 x g i 1 min til at tvinge eluering buffer ud af spidsen.
  6. Tør prøve ved hjælp af et vakuum centrifuge ved 150 x g og 1-3 kPa for 1 h.
    Bemærk: Tørret peptider kan opbevares ved-80 ° C på ubestemt tid. Dette er en potentiel afslutningspunkt.

7. Fjernelse af Crosslinked RNA

Bemærk: behandle peptider med nukleasen fjerne crosslinked RNA.

  1. Resuspenderes i 50 µL 2 x nukleasen buffer (100 mM NH 4 HCO 3, 4 mM MgCl 2).
  2. Foranstaltning peptid koncentration ved hjælp af absorbans på 280 nm antages 1 mg/mL af peptider for en A 280 1.
    NOTE: Den forventede koncentration er 1 mg/mL.
  3. Justere alle prøver til 1 mg/mL eller den laveste koncentration med 2 x nukleasen buffer.
  4. Udarbejde en master mix af 50 µL H 2 O + 1 µL høj renhed nukleasen (≥ 250 U) (der henvises til Tabel af materialer) pr. prøve.
  5. Tage 50 µL af peptid prøven og der tilsættes 50 µL af H 2 O + nukleasen master mix.
  6. Incubate ved 37 ° C i 1 h. Fortsæt at udføre massespektrometri.
    Bemærk: Peptider er nu klar til massespektrometri. De kan analyseres straks eller opbevares ved-80 ° C på ubestemt tid. Dette er en potentiel afslutningspunkt.

8. Nano væskekromatografi og massespektrometri rå databehandling

Bemærk: fordi 4SU-crosslinking ændrer massen af peptid, deres ioner, tæller ikke med intensiteten af den ikke-krydsbundet peptid under LC-MS/MS, der synes derfor at være faldet med crosslinking. Grad og konsekvens af dette fald afspejler graden af protein-RNA crosslinking for hver peptid 24.

  1. Forberede HPLC buffere som følger: 0,1% myresyre i vand af HPLC-renhed (buffer A); 0,1% myresyre i HPLC-grade acetonitril (Buffer B).
  2. Hvis en nano-HPLC er tilgængelig, skal du slutte en nano-kolonne med følgende specifikationer: indre diameter 75 µm; pakket med C18-AQ partikler; længde 20-25 cm.
    Bemærk: Hvis HPLC tilgængelige kører med højere strømningshastigheder bruge en ordentlig kolonne størrelse for den angivne strømningshastighed. Højere flow kromatografi nedsætter følsomheden.
  3. Program HPLC-metoden som følger: flow hastighed 250-300 nL/min; gradient fra 2 til 28% buffer B i 120 min, fra 28 til 80% B for de næste 5 min og isocratic 80% B for 10 min.
    Bemærk: Hvis HPLC ikke har en automatiseret kolonne ækvilibrering forudgående prøve lastning, starter programmet med 10 min til 0% B før pålæsning prøven.
  4. Program MS erhvervelse metode til at udføre data-afhængige erhvervelse (DDA) som standard shotgun proteomics eksperimenter. Instrument normeret maksimalydelse bør suppleant fuld MS scanninger med tandem MS scanninger (eller MS/MS) af de mest intense signaler. Bruge de optimale indstillinger for proteomics MS kører.
    Bemærk: For sikker resultater, bruge instrumenter, der kan udføre mindst fuld MS Skan i høj opløsning (f.eks. orbitrap, time of flight). For nøjagtig kvantificering, Sørg for, at intervallerne mellem fuld MS scanninger er ikke længere end 3 s. længere duty cycles kan forhindre nøjagtig definition af uddraget ion kromatogrammer.
  5. Indlæse 1-2 µg prøve HPLC kolonne og metoden HPLC-MS/MS som programmeret. For hver biologiske replikat udføre mindst to uafhængige kører og behandle dem som teknisk replikater.
  6. Efter MS, importere raw-filer til en proteomics softwarepakke til MS/MS-spektre identifikation og peptid kvantificering via udpakkede ion kromatografi. Vi anbefaler softwarepakker, der kan udføre kromatografiske justering af flere MS kører (Se Tabel af materialer) 29 , 30.
  7. Hvis indstillingen er tilgængelig i programpakke, aktiverer " Match mellem kører " før du starter databehandling.
  8. Når analysen er færdig, eksporterer listen peptid og kvantificering værdierne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser arbejdsprocessen RBR-ID. På grund af den relativt lave crosslinking effektivitet af denne teknik er det meget vigtigt at overveje både udtynding niveau og sammenhængen i den observerede effekt (P -værdi) på tværs af biologiske replikater. Figur 2 viser en vulkan plot af RBR-ID resultat. Peptider, der overlappes RNA anerkendelse motiv (RRM) domæne viser meget konsekvent udtynding niveau. RRM domæner kan bruges som en positiv kontrol for RBR-ID analyse.

RBR-ID kan bruges til at kortlægge RBRs i levende celler. En RBR-ID score kan beregnes for hver peptid at anslå RNA-bindende potentiale: RBR-ID score = - log2(normaliseret + 4SU intensitet/normaliseret-4SU intensitet) x (log10(P -værdi))2. Figur 3 viser en heatmap af RBR-ID scores projiceret op på overfladen af spliceosomal subunit U1 - 70 k. Den lyse røde farve i nærhed af RNA-kontakt, angiver som bestemmes fra krystalstruktur, korrekt identifikation af protein-RNA interaktion.

Efter identifikation af roman RBPs og deres RBRs anbefales det, at deres RNA-bindende aktivitet være bekræftet af en uafhængig metode. I vores tidligere undersøgelse24, vi identificeret TET2 som en roman RBP og tilknyttet en C-terminale region, RNA-bindende aktivitet, som vist i figur 4A af plotte RBR-ID score langs den primære sekvens af protein. Figur 4B viser, at kravet om denne roman RBR kunne kontrolleres ved at udføre PARI-klip26 bruger WT sekvens og sammenligne signal til, at en mutant mangler forventede RBR. Yderligere kontrol og mere detaljeret forklaring af dette eksperiment, validering er tilgængelige i han et al. 201624.

Figure 1
Figur 1: RBR-ID oversigt. Musen sektorrådene behandles med 4SU eller ej (1 - 2) og bestrålet med 312 nm UV (3). Kerner er isolerede (4) og ekstrakter fordøjes med protease og nukleasen, giver både crosslinked og uncrosslinked peptider (5). Kovalente RNA adukter på bitmapgenkendelse websteder ændre peptid massen, fører til et tilsvarende fald i intensiteten af uncrosslinked peptid masse spektrum (6, pil). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: proteom-wide RBR-ID i mESCs. Vulkan observationsområder viser log-fold ændringer i peptid intensiteter på x -aksen og Student's t-test P -værdier på y -aksen for ± 4SU behandlinger (312 nm). Peptider overlappende kommenteret RRM domæner er i blå. Et RNA-bindende peptid fra HNRNPC er fremhævet med rødt. Tidligere udgav han et al. 201624. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: RBR-ID kort lokaliteter af protein-RNA interaktioner. Zoomet i regioner af krystalstruktur af U1 snRNP (FBF-ID: 4PJO31) viser protein overflader farvekodede ifølge deres RBR-ID score og interagere RNA'er for U1 - 70 K. Tidligere udgav han et al. 201624. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: validering af RBR af TET2. (A) primære sekvens og kendte domæner for TET2; glattede restkoncentrationsniveauet RBR-ID score afbildet langs den primære sekvens (midten); og ordning af epitop-tagged katalytiske domæne fragment (CD) og RBR-slettet (CDΔRBR) konstruktioner bruges til validering (nederst). (B) PARI-klip af forbigående udtrykt TET2 CD og ΔCDΔRBR i HEK293 celler. Autoradiografi for 32P-mærket RNA (øverst) og kontrol vestlige skamplet (nederst). Tidligere udgav han et al. 201624. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver en udførligt beskrevet forsøgsplan for at udføre RBR-ID i mESCs og med passende ændringer i alle celler, der kan integrere 4SU i RNA. Andre celletyper kan kræve optimering af tilgang til at sikre et tilstrækkeligt signal til støjforhold. Derudover, mens protokollen beskrevet heri fokuserer på gennemgangen af nukleare RBPs, bør RBR-ID-teknologi være let tilpasses til forskellige cellulære rum, såsom cytosol eller specifikke organeller, ved brug af forskellige fraktionering strategier. Parametre, der kan kræve optimering omfatter 4SU koncentration og indarbejdelse tid samt UV crosslinking energi. Disse parametre er vigtigt at sikre effektiv dannelsen af RNA-protein krydsbindinger og give en tilfredsstillende signal / støjforhold. Vi har vist, at 312 nm UVB lys er meget mere effektivt på crosslinking 4SU-holdige RNA'er til proteiner i forhold til 365 nm UVA bruges typisk i PAR-klip32. Direkte sammenligning af RBR-ID udført med 312 nm og 365 nm viste at 312 nm UVB resulterede i identifikation af en meget større del af kendte RBPs24.

To andre metoder er tilgængelige til at udføre proteom-wide RBP identifikation. En, kaldet RBDmap, ligner RBR-ID i at det udnytter UV crosslinking og MS. RBDmap blev brugt til at identificere RBPs og kortlægge deres RNA-bindende aktiviteter i HeLa celler23. Denne metode bygger på positiv identifikation af peptider støder op til RNA-bindingssteder og bygger på to sekventielle oligo-dT pull-downs, tyder på, at det kan have en lavere falsk positiv rate end RBR-ID. Men pull-downs tillader kun identifikation af RBPs, der binder til polyA + RNA og kræver store mængder råmateriale, op til 10 - 100 gange mere end RBR-ID. RBR-ID kan udføres med så lidt som 5 µg protein per biologiske replikat (~ 2 µg pr. tekniske replikat), som kan indsamles fra så få som 250.000 celler.

Den anden metode, betegnes som SONAR, bygger på datamining af store protein-protein interaktion databaser til at opdage proteiner der ofte Co rense med kendte RBPs og hvis interaktion med disse RBPs kan derfor være medieret af RNA18. Denne kloge tilgang er meget kraftfuld og giver mulighed for identifikation af roman RBPs uden at udføre nogen våde lab eksperiment, forudsat at passende databaser er tilgængelige; men det kan ikke afsløre interaktion websteder og derfor er komplementære, men ikke alternative RBR-id.

Sammenfattende kan vores RBR-ID teknik identificere roman RBPs og kortlægge deres RBRs med begrænset input prøve beløb og uden at kræve nogen biokemiske rensning af protein-RNA crosslinked komplekser. Teknikken gør ingen antagelse på typen af RNA bundet af de identificerede RBPs og derfor kan knytte RNA bindende aktivitet af proteiner, der binder til ikke-polyadenylated, hvoraf mange er noncoding, tyder på, at RBR-ID kan bevise en nyttig teknik til at studere den regulerende roller noncoding RNA'er.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

R.B. blev støttet af Searle lærde Program, WW Smith Foundation (C1404) og marts Dimes Foundation (1-FY-15-344). Pose anerkender støtte fra NIH grants R01GM110174 og NIH R01AI118891, samt DOD give BC123187P1. R.W.-T. blev støttet af NIH uddannelse grant T32GM008216.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KnockOut DMEM Fisher Scientific 10829018
Fetal bovine serum, qualified, US origin Fisher Scientific 26140079
L-Glutamine solution 200 mM Sigma G7513
Penicillin-Streptomycin solution Sigma P0781
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) Sigma M7145
2-Mercaptoethanol Sigma M3148
ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) EMD Millipore ESG1106
CHIR99021 Tocris 4423
PD0325901 Sigma PZ0162
Gelatin solution,2% in water Sigma G1393
4-thiouridine Sigma T4509 50 mM stock in water
Spectrolinker XL-1500 Fisher Scientific 11-992-90
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma 78830
IGEPAL CO-630 Sigma 542334 Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent
Iodoacetamide Sigma I6125
Trypsin, sequencing grade Promega V5111
Empore solid phase extraction disk 3M 66883
OLIGO R3 Reversed - Phase Resin Fisher Scientific 1133903
Benzonase Sigma E8263 High purity nuclease
Sonic Dismembrator Model 100 Fisher Scientific discontinued updated with FB505110
HPLC grade acetonitrile Fisher Chemical A955-4
HPLC grade water Fisher Scientific W6 4
TFA Fisher Scientific A11650
Ammonium Bicarbonate Sigma A6141
Acetic Acid Sigma 49199
Formic Acid Sigma F0507
ReproSil-Pur 18-AQ Dr. Maisch GmbH HPLC r13.aq.0003 Packing material for HPLC column
Capillary for nano columns (75 µm) Molex 1068150017
MaxQuant software Max Planck Institute for Biochemistry Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
  2. Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
  3. Rinn, J. L., Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).
  4. Goff, L. A., Rinn, J. L. Linking RNA biology to lncRNAs. Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).
  5. Holoch, D., Moazed, D. RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression. Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).
  6. Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  7. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
  8. Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
  9. Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
  10. Cabili, M. N., et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).
  11. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  12. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  13. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
  14. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6, 10127 (2015).
  15. Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nat Commun. 7, 11212 (2016).
  16. Wilusz, J. E., et al. A triple helix stabilizes the 3' ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails. Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).
  17. Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).
  18. Brannan, K. W., et al. SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes. Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).
  19. Bonasio, R., et al. Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes. Elife. 3, e02637 (2014).
  20. Kaneko, S., et al. Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin. Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).
  21. Kaneko, S., et al. Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA. Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).
  22. Saldana-Meyer, R., et al. CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53. Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).
  23. Castello, A., et al. Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells. Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
  24. He, C., et al. High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells. Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).
  25. Favre, A., et al. 4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).
  26. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
  27. Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions. J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).
  28. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  29. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  30. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  31. Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition. Elife. 4, (2015).
  32. Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. J Vis Exp. (41), (2010).

Tags

Biokemi sag 127 Protein-RNA interaktioner RNA-bindende domæne RNA-bindende region massespektrometri noncoding RNA'er UV crosslinking
Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warneford-Thomson, R., He, C.,… More

Warneford-Thomson, R., He, C., Sidoli, S., Garcia, B. A., Bonasio, R. Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions. J. Vis. Exp. (127), e56004, doi:10.3791/56004 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter