Summary
We beschrijven een protocol te identificeren van RNA-bindende proteïnen en kaart van de regio's hun RNA-bindende in levende cellen met behulp van UV-gemedieerde photocrosslinking en massaspectrometrie.
Abstract
Noncoding RNAs spelen een belangrijke rol in verschillende nucleaire processen, waaronder regulering van de expressie van genen, structuur van de chromatine en DNA-herstel. In de meeste gevallen is het optreden van noncoding RNAs gemedieerd door eiwitten waarvan de functies zijn op hun beurt weer gereguleerd door deze interacties met noncoding RNAs. In overeenstemming met dit, een groeiend aantal eiwitten die betrokken zijn in nucleaire functies hebben gemeld RNA binden en in enkele gevallen de RNA-bindende regio's van deze proteïnen zijn toegewezen, vaak door middel van moeizame, kandidaat-gebaseerde methoden.
Wij rapporteren hier een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van een hoge-doorvoer, Proteoom bestrijkende onbevooroordeelde identificatie van RNA-bindende proteïnen en hun RNA-bindende regio's. De methodologie steunt op de opneming van een fotoreactief uridine analoge in de cellulaire RNA, gevolgd door UV-gemedieerde eiwit-RNA crosslinking en spectrometrische analyse te onthullen van RNA-kruisverwijzende peptiden binnen het proteoom. Hoewel we de procedure voor de muis embryonale stamcellen beschrijven, moet het protocol gemakkelijk worden aangepast aan een verscheidenheid van gekweekte cellen.
Introduction
Het doel van de methode van de RBR-ID is het identificeren van de roman RNA-bindende proteïnen (RBPs) en hun RNA-bindende regio's (RBRs) kaart met peptide tabelniveau resolutie ter vergemakkelijking van het ontwerp van RNA-bindende mutanten en het onderzoek van de biologische en biochemische functies van eiwitten-RNA interacties.
RNA is uniek onder biomoleculen zoals het kan fungeren als een boodschapper uitvoering van genetische informatie én ook in complexe driedimensionale structuren met biochemische functies meer verwant aan die van eiwitten1,2 vouwen. Een groeiende hoeveelheid bewijs suggereert dat noncoding RNAs (ncRNAs) spelen een belangrijke rol in verschillende gene regelgevings- en epigenetische trajecten3,4,5 , en meestal deze regelgevende taken zijn gemedieerde in concert met eiwitten die ermee specifiek een bepaalde RNA. Van bijzonder belang zijn, werd een aantal interacterende eiwitten onlangs geïdentificeerd voor de intens bestudeerde lange ncRNA (lncRNA) Xist, waardevolle inzicht bijbrengen in hoe deze lncRNA x-chromosoom inactivatie in vrouwelijke cellen6,7 bemiddelt ,8. Met name verscheidene van deze Xist-interactie proteïnen bevatten geen canonieke RNA-bindende domeinen9, en daarom hun RNA-bindende activiteit niet kon worden voorspeld in silico gebaseerd op hun primaire volgorde alleen. Gezien het feit dat duizenden lncRNAs worden uitgedrukt in een bepaalde cel10, is het redelijk te veronderstellen dat velen van hen via interacties met handelen misschien nog worden ontdekt RNA-bindende proteïnen (RBPs). Een experimentele strategie om te identificeren deze roman RBPs zou daarom de taak van de ontrafeling van de biologische functie van ncRNAs aanzienlijk kunnen vergemakkelijken.
Eerdere pogingen om te identificeren RBPs empirisch hebben vertrouwd op polyA + RNA selectie gekoppeld aan massaspectrometrie (MS)11,12,13,14,15. Hoewel deze experimenten toegevoegd veel eiwitten aan de lijst van vermeende RBPs, door ontwerp, dat ze kon alleen het detecteren van eiwitten gebonden polyadenylated uitgeschreven. De meeste kleine RNAs en vele lncRNAs zijn echter niet polyadenylated. 16 , 17 en hun interacterende eiwitten zou waarschijnlijk hebben gemist in deze experimenten. Een recente studie toegepast machinaal leren op eiwit-eiwitinteractie interactome-databases op het identificeren van eiwitten die samen met meerdere bekende RBPs gezuiverd en toonde aan dat deze terugkerende RBP partners waren meer kans om te bezitten van RNA-bindende activiteiten18. Echter, deze aanpak is gebaseerd op mijnbouw bestaande grote interactie databases en herkent alleen eiwitten die mede gezuiverde in niet-denaturerende omstandigheden met bekende RBPs kunnen, dus met uitzondering van de analyse onoplosbare membraan-embedded en schaarse eiwitten.
De identificatie van een eiwit als een bona fide RBP vaak geen automatisch informatie over de biologische en/of biochemische functie van de interactie eiwit-RNA oplevert. Om aan dit punt, is het meestal wenselijk om de eiwit domein en aminozuur residuen betrokken bij de interactie te identificeren, zodat specifieke mutanten kunnen worden ontworpen om de functie van RNA-bindende testen in het kader van elke roman RBP19, 20. vorige inspanningen van onze fractie en anderen hebben gebruikt recombinant eiwit fragmenten en schrapping mutanten te identificeren van RNA-bindende regio's (RBRs)19,20,21,22; echter, dergelijke benaderingen zijn arbeidsintensief en onverenigbaar met hoge gegevensdoorvoer analyses. Meer recentelijk, een studie beschreven een experimentele strategie om de kaart van RNA-bindende activiteiten in een high-throughput mode met behulp van massaspectrometrie23; echter deze aanpak gebaseerd op een dubbele polyA + RNA-selectie, en dus uitgevoerd dezelfde beperkingen als de RBP identificatie benaderingen zoals hierboven beschreven.
We ontwikkelden een techniek, genoemd RNA bindende regio identificatie (RBR-ID), die exploiteert eiwit-RNA photocrosslinking en kwantitatieve massaspectrometrie om eiwitten en eiwit regio's interactie met RNA in levende cellen zonder te identificeren veronderstelling over de status van de polyadenylatie RNA, dus met inbegrip van RBPs afhankelijk van polyA-RNAs24. Bovendien, deze methode berust uitsluitend op crosslinking en stelt geen speciale eisen op eiwit oplosbaarheid of toegankelijkheid en is dus geschikt voor RNA-bindende werkzaamheden binnen membranen (bijvoorbeeld de nucleaire envelop) of slecht oplosbare compartimenten (kaart bijvoorbeeld de nucleaire matrijs). We beschrijven de experimentele stappen voor het uitvoeren van de RBR-ID voor de kernen van muis embryonale stamcellen (mESCs) maar met kleine aanpassingen dit protocol moet geschikt zijn voor allerlei soorten cellen, mits ze efficiënt 4SU van de cultuur opnemen kunnen medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cultuur en uitbreiding van mESCs
Opmerking: muis embryonale stamcellen zijn eenvoudig te cultuur en kan snel worden uitgebreid tot de grote aantallen voorgeschreven biochemische experimenten dankzij hun snelle fietsen tijd. Gezonde mESCs verdubbelen elk 12 h.
- Uitvouwen mESCs naar het gewenste nummer op gelatinized platen in mESC medium (zie hieronder) in een incubator weefselkweek bewaard bij 37 ° C, 5% CO 2, en > 95% vochtigheid.
Opmerking: Genoeg platen moeten worden voorbereid voor de biologische replicatieonderzoeken 3-5 voor de + 4SU monster en de controle van de - 4SU. Een 10-cm plaat (dat wil zeggen 5-10 miljoen cellen) is meer dan voldoende voor elke biologische repliceren. - Het medium voor het mESCs is samengesteld uit Dulbecco ' s bewerkt Eagle ' s medium (DMEM), aangevuld met 15% foetale runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 0,5 x penicilline/streptomycine, 1 x niet-essentiële aminozuren, 100 µM bèta-mercaptoethanol, 1.000 U /mL leukemie remmende factor (LIF), 3 µM CHIR99021, 1 µM PD0325901.
- Voordat hij passaging mESCs, stelt het gewenste aantal platen van 10 cm.
- Voeg 4 mL 0,1% gelatine in water om ervoor te zorgen dat het gehele oppervlak van de plaat is gedekt; Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT); verwijderen van gelatine oplossing.
- Passage van cellen wanneer ze bereiken ~ 10 miljoen cellen per plaat, meestal ~ 48 h na inoculatie.
Opmerking: Aangezien mESCs in dichte kolonies groeien, platen nooit worden toegestaan tot 100% confluentie zoals waargenomen voor cellijnen die in monolayers (bijvoorbeeld HEK293 of 3T3 cellen groeien). Een mESC plaat moet worden gepasseerd wanneer de kleur omslaat naar geel ~ 50% confluente en zeker vóór het medium.- Loskoppelen van cellen, spoel de platen met dichte mESC culturen eens in 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), aangevuld met 2 mM EDTA, dan toevoegen van 0,05% trypsine opgelost in DMEM en terug te keren plaat incubator voor 5 min (37 ° C, 5% CO 2, en > 95% vochtigheid).
- Plaat verwijderen incubator en resuspendeer de cellen met gelijk volume DMEM door op en neer herhaaldelijk krachtig pipetteren.
- Telling van cellen met behulp van hemocytometer en ervoor te zorgen dat cellen een eencellige schorsing vormen (d.w.z. geen clusters), vervolgens Centrifugeer cel mengsel 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijderen van supernatant en resuspendeer de pellet cel in 1-2 mL DMEM.
- Enten cellen bij een dichtheid van 10.000 cellen/cm 2 in mESC medium (d.w.z. ~ 800.000 cellen per 10-cm plaat) met behulp van de gelatine beklede platen bereid in stap 1.3.1.
2. Dwarslijn van eiwit – RNA interacties in levende cellen
Opmerking: RNA-eiwit crosslinking wordt gemedieerd door de foto-gevechts ribonucleoside analoge 4-thiouridine (4SU). 4SU heeft een langere absorptie maximaal dan endogene nucleotiden en kan alleen worden opgenomen in RNA; intermediair-golflengte UVB kan daarom worden gebruikt om selectief dwarslijn RNA naar eiwitten 25 , 26. UVB behandeling van 4SU-behandelde cellen leidt tot covalente crosslinks tussen 4SU-bevattende RNA en aminozuren, met een gerapporteerde voorkeur voor Tyr, Trp, BMO en Lys Cys 27.
- Uitvouwen mESCs om het vereiste aantal 10-cm platen als beschreven in stap 1.
Opmerking: Genoeg platen moeten worden voorbereid voor de biologische replicatieonderzoeken 3-5 voor de + 4SU monster en de controle van de - 4SU. Een 10-cm plaat (dat wil zeggen 5-10 miljoen cellen) is voldoende voor elke biologische repliceren. - Voordat de platen confluentie bereiken, 4SU direct tot medium aan toevoegen een eindconcentratie van 500 µM. laat - 4SU control gerechten onbehandeld.
- Shake platen zachtjes te verspreiden de 4SU homogeen gedurende het medium. Terugsturen naar de dezelfde weefselkweek incubator voor 2 h (37 ° C, 5% CO 2, en > 95% vochtigheid).
- Platen overbrengen in een ijsemmer en negeren middellange.
- Spoel de plaat zachtjes met ijskoude PBS 5 mL.
Opmerking: Spoel zachtjes of cellen kunnen loskoppelen. - Voeg toe 2 mL ijskoud PBS en plaats platen zonder deksels in een crosslinker uitgerust met UVB-emitting bollen (312 nm). Bestralen platen bij de instelling van een energie van 1 J/cm 2.
Opmerking: Het is cruciaal dat plastic deksels zijn verwijderd of ze misschien beschermen de cellen van UV-licht en voorkomen van crosslinking. - Cellen met behulp van cell lifters verzamelen en overbrengen van ijskoude PBS in conische buisjes. Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 5 min, 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 5 mL ijskoud PBS met 2 mM EDTA en 0,2 mM phenylmethylsulfonyl-fluoride (PMSF).
- Cellen tellen met behulp van een hemocytometer. 5-10 en 10-20 miljoen cellen uit 10-cm en 15 cm platen respectievelijk verwachten.
- Centrifuge op 2.000 x g gedurende 5 minuten, 4 ° C.
Opmerking: Ingehuld cellen direct inzetbaar voor stap 3 of ze kunnen worden flash-bevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij-80 ° C voor onbepaalde tijd. Dit is een potentieel stopplaats.
3. Isolatie van kernen
Opmerking: kernen zijn geïsoleerde verwijderen cytoplasmatische eiwitten en het vergroten van de dekking van nucleaire eiwitten. Deze stap kan worden vervangen door andere vormen van cellulaire fractionering te bestuderen van de RBPs in andere cellulaire compartimenten.
- Voorbereiden ijskoud Buffer een (10 mM Tris-HCl pH 7,9, 4 ° C, 1.5 mM MgCl 2, 10 mM KCl). Gebruik van ten minste 2,5 mL per 10 miljoen cellen (zoals geteld in stap 2.9) voor extractie.
Opmerking: Voorraden Buffer A (bijvoorbeeld een 500 mL fles) kunnen worden voorbereid en opgeslagen bij 4 ° C voor 6 maanden.- Voorafgaand aan het gebruik, het toevoegen van 0.5 mM dithiothreitol (DTT) en 0.2 mM PMSF tot het gewenste bedrag (2,5 mL per 10 miljoen cellen) van de ijskoude buffer A.
- Wassen van cellen met behulp van 2 mL Buffer A per 10 miljoen cellen. Spin bij 2.500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Discard supernatant, Buffer A aangevuld met 0,2% van een nonionic, niet-denaturering wasmiddel, zoals octyl-fenoxy-polyethoxy-ethanol toevoegen (Zie de Tabel van materialen), 500 µL per 10 miljoen cellen. Roteren voor 5 min bij 4 ° C.
- Centrifugeer bij 2.500 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant; de pellet omvat intact kernen verstoken cytoplasma.
Opmerking: Kernen kunnen worden onmiddellijk gebruikt voor stap 4 of flash-bevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij-80 ° C voor onbepaalde tijd. Dit is een potentieel stopplaats.
4. Lysis van de kernen
Opmerking: kruisverwijzende kernen in een massa spectrometrie-compatibele buffer om release eiwitten en eiwit-RNA complexen zijn lysed.
- Toevoegen lysis-buffermengsel (9 M ureum, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 24 ° C), 200 µL per 10 miljoen cellen. Bewerk ultrasone trillingen ten als u wilt schuintrekken chromatine met behulp van een 1/8 " sonde bij 50% amplitude instelling voor 5-10 s.
- Spin op 12.000 x g gedurende 5 minuten en verzamelen 175 µL van supernatans dat om te voorkomen dat de pellet.
Opmerking: 100 µL zal worden gebruikt voor de volgende stappen van de RBR-ID en de resterende 75 µL van lysate kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C voor later gebruik en/of westelijke vlekkenanalyse. - Maatregel eiwitconcentratie via analyse van Bradford of soortgelijke techniek 28. Verdun eiwitconcentratie in de verschillende monsters tot 1 mg/mL of de laagste monster met behulp van de juiste hoeveelheid lysis-buffermengsel.
Opmerking: Van de kernen van 10 miljoen mESCs verwachten 100-200 µg eiwit.
5. Spijsvertering van de trypsine
Opmerking: eiwitten zijn verteerd voor het genereren van peptiden suitable onderop massaspectrometrie (MS) p.a..
- Oplossing van de DTT toevoegen aan nucleaire lysate (5 mM definitieve); Incubeer gedurende 1 h op RT.
- Iodoacetamide uit verse voorraad (14 mM definitieve) toevoegen; Incubeer gedurende 30 min op RT in het donker.
- Dilute lysate met 5 keer volume van 50 mM NH 4 HCO 3
- Toevoegen van trypsine (µg eiwit: µg trypsine = 200:1); Incubeer bij 37 ° C's nachts.
6. Ontzouten van peptiden
- een op maat gemaakte fase tip per monster bereiden.
- 6.1.1. plaats een schijf van vaste fase extractie C18 materiaal in de bodem van een tip van 200 µL Pipetteer.
- Toevoegen 50 µL van oligo R3 omgekeerd fase hars op de top van de C18-schijf. Plaats fase tip binnen centrifugeren adapter en de plaats tip met adapter in een 1,5 mL microfuge buis.
- Voeg 100 µL 100% acetonitril tips om te wassen. Centrifugeer bij 1000 x g gedurende 1 minuut te verwijderen van het oplosmiddel.
- Uitgebalanceerd met 50 µL 0,1% trifluorazijnzuur (TFA). Centrifugeer bij 1000 x g gedurende 1 min.
- 100% mierenzuur toevoegen aan verteerd eiwitSteekproef te verlagen de pH ten slotte op 2-3.
Opmerking: Dit mocht ~ 5 µL per 1 mL verdunde peptide monster, maar pH moet worden gemeten en meer mierenzuur zuur toegevoegd zonodig. - Load monster naar op maat gemaakte fase tip, centrifuge op 1000 x g voor 1 min totdat alle monster doorloopt het puntje.
- Wassen gebonden peptiden met 50 µL 0,1% TFA. Centrifugeer bij 1000 x g gedurende 1 min.
- Elueer peptiden door toevoeging van 50 µL elutie buffer (75% acetonitril, 0,025% TFA) fase tip en centrifuge bij 1000 x g gedurende 1 minuut te dwingen de elutie buffer uit het topje.
- Droog het monster met behulp van een vacuüm centrifuge ingesteld bij 150 x g en 1-3 kPa voor 1 h.
Opmerking: Gedroogde peptiden kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C voor onbepaalde tijd. Dit is een potentieel stopplaats.
7. Verwijdering van kruisverwijzende RNA
Opmerking: behandelen van peptiden met nuclease verwijderen kruisverwijzende RNA.
- Resuspendeer de pellet in 50 µL 2 x nuclease buffer (100 mM NH 4 HCO 3, 4 mM MgCl 2).
- Maatregel peptide concentratie met behulp van extinctie op 280 nm uitgaande van peptiden voor een A-280 1 1 mg/mL.
Opmerking: De verwachte concentratie is 1 mg/mL. - Passen alle monsters tot 1 mg/mL of bij de laagste concentratie met 2 x nuclease buffer.
- Voorbereiding van een master mix van 50 µL H 2 O + 1 µL hoge zuiverheid nuclease (≥ 250 U) (Zie de Tabel van materialen) per monster.
- Neem 50 µL van peptide monster en voeg 50 µL van H 2 O + nuclease meester mix.
- Incubate bij 37 ° C gedurende 1 h. treed toe tot het uitvoeren van massaspectrometrie.
Opmerking: De peptiden zijn nu klaar voor massaspectrometrie. Zij kunnen worden geanalyseerd onmiddellijk of opgeslagen bij-80 ° C voor onbepaalde tijd. Dit is een potentieel stopplaats.
8. Nano Liquid Chromatography, Spectrometrie van de massa en verwerking van Raw Data
Opmerking: omdat 4SU-crosslinking de massa van de peptide verandert, hun ionen tellen niet mee naar de intensiteit van de niet-kruisverwijzende peptide tijdens LC-MS/MS, dat lijkt dus te worden verlaagd door het crosslinking. De mate en de consistentie van deze daling weerspiegelt de mate van eiwit-RNA crosslinking voor elke peptide 24.
- Bereiden HPLC buffers als volgt: 0,1% mierenzuur in HPLC-grade water (buffer A), 0,1% mierenzuur in HPLC-grade acetonitril (Buffer B).
- Als een nano-HPLC beschikbaar is, sluit een nano-kolom met de volgende specificaties: inwendige diameter 75 µm; boordevol C18-AQ deeltjes; lengte 20-25 cm.
Opmerking: Als de HPLC beschikbaar prestatiestatus hoger debiet gebruiken een juiste kolom formaat voor het aangegeven debiet. Hogere stroom chromatografie vermindert gevoeligheid. - Program de HPLC-methode als volgt: stroom tarief 250-300 nL/min; gradiënt van 2 naar 28% buffer B in 120 min, vanaf 28 tot 80% B voor de volgende 5 min en isocratic 80% B voor 10 min.
Opmerking: Als de HPLC niet over een geautomatiseerde kolom evenwichtsinstelling voorafgaande monster laden beschikt, start het programma met 10 min op 0% B vóór het laden van het monster. - Program de MS overname methode uit te voeren gegevens-afhankelijke acquisition (DDA) als standaard geweer proteomics experimenten. De taakcyclus instrument moet volledige MS scans met tandem MS scans (of MS/MS) van de meest intense signalen worden afgewisseld. De optimale instellingen gebruiken voor proteomics MS loopt.
Opmerking: Voor de resultaten van het vertrouwen, gebruik van instrumenten die op zijn minst de volledige MS uitvoeren kunnen scannen in hoge resolutiemodus (bijvoorbeeld orbitrap, time-of-flight). Voor nauwkeurige kwantificering, zorg ervoor dat de intervallen tussen volledige MS scans niet langer zijn dan 3 s. langere cycli van de plicht ertoe leiden dat nauwkeurige definitie van uitgepakte ion chromatogrammen. - Laden van 1-2 µg van monster op de HPLC-kolom en de HPLC-MS/MS methode run zoals geprogrammeerd. Voor elke biologische repliceren uitvoeren van ten minste twee onafhankelijke runs en behandel ze als technische replicatieonderzoeken.
- Na MS, de raw-bestanden importeren in een softwarepakket van proteomics voor MS/MS spectra identificatie en kwantificering van de peptide via uitgepakte ion-chromatography. Raadzaam softwarepakketten die chromatografische uitlijning van meerdere uitvoeren kunnen MS loopt (Zie de Tabel van materialen) 29 , 30.
- Als de optie beschikbaar in de softwaresuite is, inschakelen " Match tussen Runs " vóór het opstarten van gegevensverwerking.
- Zodra de analyse is voltooid, de peptide lijst samen met de kwantificering waarden exporteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de workflow van de RBR-ID. Als gevolg van de relatief lage crosslinking efficiëntie van deze techniek is het zeer belangrijk dat zowel het niveau van de uitputting en de consistentie van het waargenomen effect (P -waarde) over biologische wordt gerepliceerd. Figuur 2 toont een vulkaan plot van RBR-ID resultaat. Peptiden dat RNA erkenning motief (SRM) domein overlapt geven zeer consistente uitputting graad. SRM domeinen kunnen als positieve controle worden gebruikt voor analyse van de RBR-ID.
RBR-ID kan worden gebruikt om de kaart van de RBRs in levende cellen. Een score van RBR-ID kan worden berekend voor elke peptide te schatten van RNA-bindende potentieel: RBR-ID score = - log2(genormaliseerde + 4SU intensiteit/genormaliseerd-4SU intensiteit) x (log10(P -waarde))2. Figuur 3 toont een heatmap van RBR-ID scores op het oppervlak van de spliceosomal-subunit U1 - 70 k geprojecteerd. De heldere rode kleur in de nabijheid van de RNA-contactpersoon, geeft bepaald vanuit de kristalstructuur, juiste identificatie van de interactie eiwit-RNA.
Na identificatie van nieuwe RBPs en hun RBRs, is het sterk aanbevolen dat hun RNA-bindende activiteit worden bevestigd door een onafhankelijke methode. In onze eerdere studie24, we TET2 geïdentificeerd als een roman RBP en de RNA-bindende activiteit toegewezen aan een C-terminal gebied, zoals aangegeven in figuur 4A door het uitzetten van de score van de RBR-ID langs de primaire opeenvolging van het eiwit. Figuur 4B toont aan dat de eis voor deze roman RBR kon worden geverifieerd door het uitvoeren van PAR-CLIP26 met behulp van de WT-reeks en het signaal dat van een mutant ontbreekt de voorspelde RBR te vergelijken. Extra controle en meer gedetailleerde uitleg van dit experiment validatie zijn beschikbaar in hij et al. 201624.
Figuur 1: overzicht van de RBR-ID. Muis SER's of niet worden behandeld met 4SU (1 - 2) en bestraald met 312 nm UV (3). Kernen zijn geïsoleerd (4) en extracten verteerd met protease en nuclease, levert zowel kruisverwijzende en uncrosslinked peptiden (5). Covalente RNA adducten op dwarslijn sites wijzigen de peptide massa, wat leidt tot een overeenkomstige daling in de intensiteit van de uncrosslinked peptide de massaspectrum (6, pijl). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Proteoom bestrijkende RBR-ID in mESCs. Vulkaan percelen weergegeven: log-voudige veranderingen in peptide intensiteiten op de x -as en de Student t-test P -waarden op de y -as voor ± 4SU behandelingen (312 nm). Peptiden overlappende geannoteerde SRM domeinen zijn in het blauw. Een RNA-bindende peptide uit HNRNPC is rood gemarkeerd. Eerder gepubliceerd in hij et al. 201624. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: RBR-ID kaarten de sites van eiwit-RNA interacties. In-of uitgezoomd-in regio's van de kristalstructuur van U1 snRNP (VOB-ID: 4PJO31) tonen eiwit oppervlakken kleurgecodeerde volgens hun score RBR-ID en de interactie van RNAs voor U1 - 70 K. Eerder gepubliceerd in hij et al. 201624. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: validatie van de RBR van TET2. (A) primaire volgorde en bekende domeinen voor TET2; afgevlakte residu-level RBR-ID-score uitgezet langs de primaire opeenvolging (midden); en regeling van katalytische domein epitoop-gelabeld fragment (CD) en constructies van de RBR-verwijderd (CDΔRBR) gebruikt voor validatie (onder). (B) PAR-CLIP van Transient uitgedrukt TET2 CD- en ΔCDΔRBR in HEK293 cellen. Autoradiografie voor 32P-geëtiketteerden RNA (boven) en controle westelijke vlek (onder). Eerder gepubliceerd in hij et al. 201624. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven een gedetailleerde experimenteel protocol standaardinteracties RBR-ID in mESCs en met adequate wijzigingen, in een willekeurige cel die 4SU in RNA kunt opnemen. Andere celtypes voorschrijven optimalisatie van de aanpak om ervoor te zorgen een voldoende signaal / ruisverhouding. Bovendien, terwijl het protocol hierin richt zich op de behandeling van nucleaire RBPs beschreven, moet de technologie van de RBR-ID worden gemakkelijk aangepast aan verschillende cellulaire compartimenten, zoals het cytosol of specifieke organellen, door gebruik van verschillende fractionering strategieën. Parameters waarvoor optimalisatie kunnen omvatten 4SU tijd voor concentratie en integratie, alsmede de energie van UV crosslinking. Deze parameters zijn belangrijk voor het garanderen van efficiënte vorming van crosslinks RNA-eiwit en opleveren van een goede signaal / ruisverhouding. We hebben aangetoond dat 312 nm UVB licht veel efficiënter op crosslinking 4SU-bevattende RNAs aan eiwitten in vergelijking met de 365 nm UVA meestal gebruikt in PAR-CLIP32. Directe vergelijking van de RBR-ID uitgevoerd met 312 nm en 365 nm aangetoond dat 312 nm UVB in de identificatie van een veel groter deel van de bekende RBPs24 resulteerde.
Twee andere methoden zijn beschikbaar voor het uitvoeren van Proteoom RBP identificatie. Een, genaamd RBDmap, is vergelijkbaar met RBR-ID in dat het maakt gebruik van UV crosslinking en MS. RBDmap werd gebruikt om RBPs te identificeren en hun RNA-bindende activiteiten in HeLa cellen23kaart. Deze methode is afhankelijk van de positieve identificatie van peptiden grenzend aan het RNA-bindende plaatsen en is gebaseerd op twee opeenvolgende oligo-dT pull-downs, wat suggereert dat het wellicht een valse positieve lager dan RBR-ID. Echter, de pull-downs toestaan alleen de identificatie van RBPs die binden aan polyA + RNA en vereisen grote hoeveelheid uitgangsmateriaal, tot 10 - 100 keer meer dan RBR-ID. RBR-ID kan worden uitgevoerd met zo weinig als 5 µg eiwit per biologische repliceren (~ 2 µg per technische repliceren), die van zo weinig als 250.000 cellen kan worden verzameld.
De tweede methode, SONAR, genoemd, is afhankelijk van datamining van grote eiwit-eiwit interactie databases voor het detecteren van eiwitten die zuiveren vaak samen met de bekende RBPs en waarvan interactie met deze RBPs kan daarom worden gemedieerd door RNA18. Deze slimme aanpak is zeer krachtig en maakt de identificatie van roman RBPs zonder het uitvoeren van een natte lab experiment, mits geschikt databases beschikbaar zijn; echter het kan niet onthullen de interactie sites en daarom is aanvullende, maar niet alternatieve RBR-id.
Kortom, kan onze techniek RBR-ID identificeren van roman RBPs en kaart van hun RBRs met beperkte invoer steekproef bedragen en zonder enige biochemische zuivering van de eiwit-RNA kruisverwijzende complexen. De techniek maakt geen veronderstelling op het type van RNA gebonden door de geïdentificeerde RBPs en daarom kan de kaart van de RNA-bindende activiteit van proteïnen die zich binden aan niet-polyadenylated, waarvan vele noncoding zijn, suggereren dat RBR-ID zou kunnen een nuttige techniek blijken te studeren de regelgevende rol van noncoding RNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
R.B. werd ondersteund door het programma van de geleerden Searle, de W.W. Smith Foundation (C1404) en de March of Dimes Foundation (1-FY-15-344). B.A.G erkent ondersteuning van NIH grants R01GM110174 en NIH R01AI118891, en DOD verlenen BC123187P1. R.W.-T. werd gesteund door de NIH opleiding grant T32GM008216.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed - Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
References
- Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
- Rinn, J. L., Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).
- Goff, L. A., Rinn, J. L. Linking RNA biology to lncRNAs. Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).
- Holoch, D., Moazed, D. RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression. Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cabili, M. N., et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6, 10127 (2015).
- Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nat Commun. 7, 11212 (2016).
- Wilusz, J. E., et al. A triple helix stabilizes the 3' ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails. Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).
- Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).
- Brannan, K. W., et al. SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes. Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).
- Bonasio, R., et al. Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes. Elife. 3, e02637 (2014).
- Kaneko, S., et al. Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin. Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).
- Kaneko, S., et al. Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA. Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).
- Saldana-Meyer, R., et al. CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53. Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).
- Castello, A., et al. Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells. Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
- He, C., et al. High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells. Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).
- Favre, A., et al. 4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
- Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions. J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition. Elife. 4, (2015).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. J Vis Exp. (41), (2010).
