Summary
Les auteurs décrivent un protocole pour identifier des protéines de liaison à l’ARN et de cartographier leurs régions de liaison à l’ARN dans des cellules vivantes psoralen médiée par les UV et spectrométrie de masse.
Abstract
ARN non codants joue des rôles importants dans plusieurs processus nucléaires, y compris la régulation de l’expression des gènes, structure de la chromatine et la réparation de l’ADN. Dans la plupart des cas, l’action d’ARN non codants est médiée par des protéines dont les fonctions sont à leur tour régies par ces interactions avec les ARN non codants. Conformément à cela, un nombre croissant de protéines impliquées dans des fonctions nucléaires ont été signalé à lier RNA et dans certains cas les régions de liaison à l’ARN de ces protéines ont été cartographiées, souvent par le biais de méthodes laborieux, axée sur le candidat.
Nous rapportons ici un protocole détaillé pour effectuer une identification non biaisée haut-débit, à l’échelle du protéome de leurs régions de liaison à l’ARN et de protéines de liaison à l’ARN. La méthodologie s’appuie sur l’incorporation d’un uridine photoréactive analogique à l’ARN cellulaire, suivi par réticulation UV induite par la protéine-ARN et spectrométrie de masse pour révéler des peptides de RNA-réticulé au sein du protéome. Bien que nous décrivons la procédure pour les cellules souches embryonnaires de souris, le protocole devrait être facilement adapté à une variété de cellules cultivées.
Introduction
La méthode RBR-ID vise à identifier de nouvelles protéines de liaison à l’ARN (pratiques commerciales restrictives) et de cartographier leurs régions de liaison à l’ARN (IPR) avec une résolution de peptide-niveau pour faciliter la conception des mutants de la liaison à l’ARN et l’enquête de la biologique et biochimique fonctions des interactions de protéine-ARN.
L’ARN est unique parmi les biomolécules car il peut agir comme un messager porteur d’informations génétiques et aussi incorporer des structures tridimensionnelles complexes avec des fonctions biochimiques plus semblables à celles des protéines1,2. Un corps croissant d’évidence suggère que les ARN non codants (ncRNA) joue un rôle important dans divers gènes voies réglementaires et épigénétiques3,4,5 et, en général, ces fonctions de régulation sont véhiculées en concert avec les protéines qui interagir spécifiquement avec un ARN donné. Une importance particulière, un ensemble de protéines qui interagissent a récemment été désigné pour l’ARNnc long intensément étudié (lncRNA) Xist, fournissant de précieuses informations sur la façon dont cette lncRNA intervient dans l’inactivation du chromosome x dans les cellules femelles6,7 ,,8. Notamment, plusieurs de ces protéines interagissant Xist ne contiennent pas de n’importe quel canonique de domaines de liaison à l’ARN9, et leur activité de liaison à l’ARN ne pouvait donc pas être prédite en silico issu de leur séquence primaire seul. Considérant que des milliers de lncRNAs sont exprimés dans une cellule donnée10, il est raisonnable de supposer que bon nombre d'entre eux pourraient agir via des interactions avec encore à découvrir les protéines de liaison à l’ARN (pratiques commerciales restrictives). Une stratégie expérimentale pour identifier ces pratiques commerciales restrictives roman donc grandement faciliterait la tâche de disséquer la fonction biologique de ncRNA.
Les tentatives précédentes pour identifier des pratiques commerciales restrictives empiriquement comptent sur RNA sélection de polyA + couplée à la spectrométrie de masse (MS)11,12,13,14,15. Bien que ces expériences a ajouté beaucoup de protéines à la liste des pratiques commerciales restrictives putatifs, par leur conception, qu'ils pourraient seulement détecter les protéines liés aux transcriptions polyadénylé. Cependant, la plupart des petits ARN et lncRNAs beaucoup ne sont pas polyadénylé. 16 , 17 et leurs protéines interagissants auraient probablement été manqués dans ces expériences. Une étude récente appliquée apprentissage artificiel à des bases de données de protéine-protéine interactome pour identifier les protéines qui co purifié avec de multiples pratiques commerciales restrictives connues et a montré que ces partenaires RBP récurrentes étaient plus susceptibles de posséder des activités de liaison à l’ARN18. Toutefois, cette approche s’appuie sur l’exploitation minière des bases de données existantes grande interaction et peut seulement identifier les protéines qui peuvent être co purifiés dans des conditions non-dénaturisation avec connus aux pratiques commerciales restrictives, ce qui exclut de l’analyse insoluble, intégrée à la membrane et rare protéines.
L’identification d’une protéine comme un bona fide RBP souvent ne cède pas automatiquement les informations sur la fonction biologique ou biochimique de l’interaction de protéine-ARN. Pour remédier à ce point, il est généralement souhaitable d’identifier les domaine et acide aminé résidus protéiques impliqués dans l’interaction afin que des mutants spécifiques peuvent être conçus pour tester la fonction de liaison de RNA dans le contexte de chaque roman RBP19, 20. précédente des efforts déployés par notre groupe et d’autres ont utilisé des fragments de protéines recombinantes et mutants de délétion d’identifier RNA binding régions (IPR)19,20,21,22; Toutefois, ces démarches sont fastidieuses et incompatible avec les analyses de haut débit. Plus récemment, une étude décrit une stratégie expérimentale pour mapper les activités de liaison à l’ARN d’une façon haut-débit à l’aide de la spectrométrie de masse23; Toutefois, cette approche s’est fondée sur une double ARN polyA + sélection et ainsi transportés les mêmes limitations que les approches d’identification RBP décrits ci-dessus.
Nous avons développé une technique, appelée RNA binding région d’identification (IPR-ID), qui exploite la protéine-ARN psoralen et spectrométrie de masse quantitative afin d’identifier des protéines et des régions de protéines interagissent avec l’ARN dans des cellules vivantes sans faire hypothèse sur l’état de polyadénylation RNA, y compris les pratiques commerciales restrictives lié à ARN polyA24. En outre, cette méthode s’appuie exclusivement sur la réticulation et a pas d’exigence sur la solubilité des protéines ou de l’accessibilité et est donc adaptée à la carte des activités de liaison à l’ARN dans les membranes (p. ex. l’enveloppe nucléaire) ou compartiments peu solubles ( par exemple la matrice nucléaire). Nous décrivons les étapes expérimentales pour exécuter RBR-ID pour les noyaux des cellules souches embryonnaires de souris (mESCs) mais avec des modifications mineures ce protocole devrait être adapté à une variété de types de cellules, pourvu qu’ils peuvent intégrer efficacement 4SU de la culture milieu.
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Protocol
1. culture et Expansion de mESCs
Remarque : cellules souches embryonnaires de souris sont faciles de culture et peut être rapidement étendus à un grand nombre requis par des expériences biochimiques grâce à leur durée de cycle rapide. MESCs sains doubler chaque 12 h.
- MESCs Expand jusqu'à la valeur souhaitée sur plaques gélatinisés dans mESC moyen (voir ci-dessous) dans un incubateur de culture de tissus maintenus à 37 ° C, 5 % de CO 2, et > 95 % d’humidité.
Remarque : Assez plaques doivent être préparées pour 3 à 5 répétitions biologiques pour le + échantillon 4SU et contrôle - 4SU. Une plaque de 10 cm (soit 5 millions de cellules) est plus que suffisante pour chaque réplicat biologique. - Le support pour les mESCs se compose de Dulbecco ' s modified Eagle ' s moyenne (DMEM) additionné de 15 % sérum bovin fœtal (SVF), 2 mM de L-glutamine, 0,5 x pénicilline/streptomycine, 1 acides aminés non-essentiels de x, 100 µM bêta-mercaptoéthanol, 1 000 U / ml facteur inhibiteur de leucémie (LIF), 3 µM CHIR99021, 1 µM PD0325901.
- Avant passage mESCs, préparer le nombre désiré de plaques de 10 cm.
- Ajouter 4 mL de 0,1 % de gélatine dans l’eau en s’assurant que toute la surface de la plaque est recouverte, incuber pendant 10 min à température ambiante (RT), enlever la solution de gélatine.
- Passage des cellules lorsqu’ils atteignent 10 millions de cellules par plaque, généralement ~ 48 h après inoculation.
Remarque : Comme les mESCs poussent en colonies denses, plaques jamais puisse rejoindre la confluence de 100 %, tel qu’observé pour les lignées de cellules qui se développent en monocouches (p. ex. HEK293 ou cellules 3 t 3). Une plaque de mESC devrait être repiquée lorsqu’environ 50 % confluente et certainement avant le milieu se colore en jaune.- Pour détacher des cellules, laver les plaques avec des cultures denses mESC une fois dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), additionnée de 2 mM EDTA, puis ajouter 0,05 % trypsine dissoute dans DMEM et retourner la plaque à l’incubateur pendant 5 min (37 ° C, 5 % de CO 2, et > 95 % humidité).
- Retirer la plaque de l’incubateur et remettre en suspension les cellules avec un volume égal de DMEM en pipettant également monter et descendre plusieurs fois vigoureusement.
- Compter les cellules à l’aide de hémocytomètre et faire en sorte que les cellules forment une suspension de cellules individuelles (c'est-à-dire sans clusters), puis centrifuger cellule mélange 500 g pendant 5 min à température ambiante. Éliminer le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 à 2 mL DMEM.
- Ensemencer les cellules à une densité de 10 000 cellules/cm 2 dans un milieu mESC (c.-à-d. ~ 800 000 cellules par plaque de 10 cm) en utilisant les plaques de gélatine-enduit préparés à l’étape 1.3.1.
2. Crosslink de protéine – Interactions ARN dans les cellules vivent
Remarque : ARN-protéines réticulation est médiée par le ribonucléosides activable par photo analogiques 4-thiouridine (4SU). 4SU dispose d’un maximum d’absorption plu qu’endogène nucléotides et peuvent seulement être incorporé à ARN ; par conséquent, intermédiaire-longueur d’onde UVB peut servir à sélectivement crosslink RNA de protéines 25 , 26. Traitement UVB des cellules traitées 4SU mène à des liaisons covalentes entre 4SU contenant les ARN et les acides aminés, avec une préférence déclarée pour Tyr, Trp, Met, Lys et Cys 27.
- MESCs Expand le nombre requis de plaques de 10 cm comme décrit dans étape 1.
Remarque : Assez plaques doivent être préparées pour 3 à 5 répétitions biologiques pour le + échantillon 4SU et contrôle - 4SU. Une plaque de 10 cm (soit 5 millions de cellules) est suffisante pour chaque réplicat biologique. - Avant les plaques atteignent confluence, ajouter 4SU directement dans le milieu à une concentration finale de 500 µM. laissez - 4SU plats de contrôle n’est pas traités.
- Plaques de secouer doucement pour distribuer le 4SU homogène tout au long de la moyenne. Retourner à l’incubateur de culture de tissus même pendant 2 h (37 ° C, 5 % de CO 2, et > 95 % d’humidité).
- Plaques de transfert à un seau à glace et ne milieu.
- Rincer la plaque doucement avec 5 mL de PBS glacee.
Remarque : Rincer doucement ou cellules pourraient se détacher. - Ajouter 2 mL de plaques de PBS et lieu glacés sans couvercle dans une RETICULATION équipée avec des lampes émettant des rayons UVB (312 nm). Irradier les plaques avec un valeur de l’énergie de 1 J/cm 2.
Remarque : Il est essentiel que les couvercles en plastique sont retirés ou ils pourraient protéger les cellules contre la lumière UV et prévenir la réticulation. - Prélever des cellules à l’aide de poussoirs de cellule et transfert à PBS glacée en tubes coniques. Centrifuger à 2 000 x g pendant 5 min, 4 ° C.
- Enlever le surnageant et Resuspendre le culot dans 5 mL PBS glacé avec 2 mM EDTA et 0,2 mM le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF).
- Comte de cellules utilisant un hémocytomètre. Attendre 5-10 et 10 millions de cellules de plaques de 10 cm et 15 cm respectivement.
- Centrifugeuse à 2 000 x g pendant 5 min, 4 ° C.
Remarque : Les cellules granulés peuvent être immédiatement utilisées pour l’étape 3 ou ils peuvent être flash congelés dans l’azote liquide et conservés indéfiniment à-80 ° C. Il s’agit d’un potentiel point d’arrêt.
3. Isolement des noyaux
Remarque : noyaux sont isolés pour éliminer les protéines cytoplasmiques et accroître la couverture des protéines nucléaires. Cette étape peut être remplacée avec d’autres formes de fractionnement cellulaire afin d’étudier les pratiques commerciales restrictives dans les différents compartiments cellulaires.
- Préparation glacée tampon (10 mM Tris-HCl pH 7,9, 4 ° C, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl). Utilisation d’au moins 2,5 mL par 10 millions de cellules (comme comptées à l’étape 2,9) pour l’extraction.
Remarque : Stocks de tampons A (par exemple une bouteille de 500 mL) peuvent être préparés à l’avance et conservés à 4 ° C pendant 6 mois.- Avant utilisation, ajouter 0,5 mM le dithiothréitol (DTT) et 0,2 mM PMSF à la quantité désirée (2,5 mL / 10 millions de cellules) du tampon glacee A.
- Laver les cellules à l’aide de 2 mL tampons A par 10 millions de cellules. Essorage à 2 500 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Jeter surnageant, ajouter des tampons A additionné de 0,2 % de détergent non ionique, non dénaturants, tels que l’octyl-phénoxy-polyéthoxy-éthanol (voir la Table des matières), 500 µL par 10 millions de cellules. Tournez pendant 5 min à 4 ° C.
- Centrifugeuse à 2 500 g pendant 5 min.
- Enlever le surnageant, le culot est composé des noyaux intacts dépourvue de cytoplasme.
Remarque : Les noyaux peuvent être utilisés immédiatement pour l’étape 4 ou flash-congelés dans l’azote liquide et conservés à-80 ° C indéfiniment. Il s’agit d’un potentiel point d’arrêt.
4. Lyse des noyaux
Remarque : noyaux réticulé sont lysées dans un tampon de spectrométrie de masse compatible pour libérer des protéines et des complexes protéine-ARN.
- Tampon de lyse Add (9 M urée, 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 24 ° C), 200 µL par 10 millions de cellules. Laisser agir la chromatine à l’aide d’un 1/8 de cisaillement " sonde au réglage d’amplitude de 50 % pour les 5-10 s.
- Spin à 12 000 x g pendant 5 min et virés 175 µL de surnageant pour éviter le pellet.
Remarque : 100 µL servira pour les prochaines étapes de l’IPR-ID et le µL 75 restants du lysat peuvent être stockées à-80 ° C pour une utilisation ultérieure ou analyse par western blot. - Concentration de protéine de mesure par analyse de Bradford ou similaires technique 28. Diluer la concentration de protéines dans les différents échantillons à 1 mg/mL ou la plus faible concentration de l’échantillon en utilisant des quantités appropriées de tampon de lyse.
Remarque : Dans les noyaux de 10 millions mESCs attendre 100-200 µg de protéines.
5. La Digestion trypsique
Remarque : les protéines sont digérées pour générer des peptides sconvient pour l’analyse de bas en haut la spectrométrie de masse (MS).
- Ajouter TNT solution nucléaire lysat (5 mm final) ; Incuber pendant 1 heure à température ambiante.
- Ajouter iodoacétamide stock frais (14 mM final) : incuber 30 min à ta dans l’obscurité.
- Diluer lysat avec 5 fois le volume de 50 mM NH 4 HCO 3
- Ajouter la trypsine (µg de protéines : la trypsine µg = 200:1) ; Incuber à 37 ° C jusqu’au lendemain.
6. Déssalement des peptides
- préparer un Conseil sur mesure étape par exemple.
- 6.1.1. Placez un disque de matériel d’extraction C18 phase solide dans le fond d’un cône de pipette de 200 µL.
- Ajouter 50 µL d’oligo R3 inversé résine de phase sur le dessus le disque de C18. Placez la pointe de la scène à l’intérieur de l’adaptateur de la centrifugation et la pointe de lieu avec l’adaptateur à l’intérieur d’un tube de microtubes de 1,5 mL.
- Ajouter 100 µL 100 % acétonitrile à conseils pour laver. Centrifuger à 1000 x g pendant 1 min éliminer le solvant.
- Stabiliser avec 50 µL 0,1 % d’acide trifluoroacétique (TFA). Centrifuger à 1000 x g pendant 1 min.
- Ajouter 100 % d’acide formique à échantillon de protéines digérées pour diminuer le pH à 2-3.
Remarque : Cela devrait exiger ~ 5 µL par 1 mL d’échantillon dilué de peptide, mais pH doit être mesurée et plus formique acide ajouté si nécessaire. - Échantillon charge sur pointe du stade sur mesure, centrifuger à 1000 x g pendant 1 min, jusqu'à ce que tous d’échantillon passe par la pointe.
- Lavage lié peptides avec 50 µL 0,1 % TFA. Centrifuger à 1000 x g pendant 1 min.
- Éluer les peptides en ajoutant 50 µL de tampon d’élution (75 % d’acétonitrile, 0.025 % TFA) au bout de la scène et centrifuger à 1000 x g pendant 1 min forcer le tampon d’élution de la pointe.
- Sécher l’échantillon en utilisant une centrifugeuse vide fixé à 150 x g et 1-3 kPa pendant 1 h.
Remarque : Peptides séchées peuvent être stockés indéfiniment à-80 ° C. Il s’agit d’un potentiel point d’arrêt.
7. Suppression de l’ARN réticulé
Remarque : traiter des peptides avec une nucléase à supprimer réticulé RNA.
- Resuspendre le culot dans 50 µL 2 x nucléase tampon (100 mM NH 4 HCO 3, 4 mM MgCl 2). Concentration
- peptide de mesure à l’aide d’absorbance à 280 nm, en supposant que 1 mg/mL de peptides pour un A 280 1.
Remarque : La concentration attendue est de 1 mg/mL. - Ajuster tous les échantillons à 1 mg/mL, ou à la concentration la plus faible à l’aide de 2 x tampon nucléase.
- Préparer un mélange maître 50 µL H 2 O + nucléase de haute pureté 1 µL (≥ 250 U) (voir la Table des matières) par exemple.
- Prendre 50 µL de l’échantillon de peptide et ajouter 50 µL d’H 2 O + nucléase master mix.
- Incuber à 37 ° C pendant 1 h. procédez pour la spectrométrie de masse.
NOTE : Les peptides sont maintenant prêts pour la spectrométrie de masse. Ils peuvent être analysés immédiatement ou stockées indéfiniment à-80 ° C. Il s’agit d’un potentiel point d’arrêt.
8. Nano chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et traitement des données brutes
Remarque : puisque 4SU-réticulation change la masse de peptide, leurs ions ne comptent pas dans l’intensité du peptide non réticulé en LC-MS/MS, qui semble donc être diminuée par la réticulation. Le degré et la cohérence de cette diminution reflète le degré de réticulation de protéine-ARN pour chaque peptide 24.
- Préparer HPLC met en mémoire tampon comme suit : acide formique 0,1 % dans l’eau de qualité CLHP (tampons A) ; 0,1 % d’acide formique en qualité HPLC acétonitrile (tampon B).
- Si un nano-HPLC est disponible, raccorder une nano-colonne avec les caractéristiques suivantes : diamètre intérieur 75 µm ; rempli de particules de C18-AQ ; longueur 20-25 cm.
Remarque : Si l’HPLC disponible fonctionne à des débits plus élevés utiliser une taille de colonne appropriée pour le débit indiqué. Chromatographie de débit plus élevée diminue la sensibilité. - Programmer la méthode CLHP comme suit : débit taux 250-300 nL/min ; dégradé de 2 à 28 % tampon B à 120 min, de 28 à 80 % B pour les prochaine 5 min et isocratique 80 % B pendant 10 min.
Remarque : Si l’HPLC ne dispose pas d’un chargement d’échantillon préalable équilibration colonne automatisé, lancez le programme avec 10 min à 0 % B avant de charger l’échantillon.
La méthode d’acquisition de MS pour effectuer dépendant des données acquisition (DDA) comme des expériences de protéomique fusil standard du programme - . Cycle d’utilisation de l’instrument doit alterner les analyses complètes de MS avec le tandem MS scans (ou MS/MS) des signaux plus intenses. Utilisez les paramètres optimaux pilotée par protéomique MS.
Remarque : Pour obtenir les résultats confiants, instruments à usage pouvant effectuer au moins la MS complet scan en mode haute résolution (p. ex. Orbitrap valant, temps de vol). Pour une quantification précise, s’assurer que les intervalles entre les analyses complètes de MS ne sont plus que 3 s. cycles de service plus longs pourraient empêcher la définition exacte des chromatogrammes ion extrait. - Charger 1-2 µg d’échantillon sur la colonne CLHP et exécuter la méthode HPLC-MS/MS comme programmé. Pour chaque réplicat biologique effectuer au moins deux essais indépendants et traitez-les comme technique de réplicats.
- Après MS, importez les fichiers raw dans un progiciel de protéomique pour MS/MS spectres identification et quantification de peptide par chromatographie ionique extraite. Nous vous recommandons de paquets de logiciels qui peuvent effectuer des alignements chromatographique de multiple MS fonctionne (voir la Table des matières) 29 , 30.
- Si l’option est disponible dans la suite logicielle, activez " Match entre pistes " avant de commencer le traitement des données.
- Une fois l’analyse terminée, exportez la liste des peptides ainsi que les valeurs de quantification.
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Representative Results
La figure 1 illustre le flux de travail IPR-ID. En raison de l’efficacité de la réticulation relativement faible de cette technique, il est très important de tenir compte tant le niveau de déplétion et la cohérence de l’effet observé (P -value) à travers des réplicats biologiques. La figure 2 montre une parcelle de volcan de résultat RBR-ID. Peptides qui chevauchaient domaine de motif (MRR) de reconnaissance RNA afficher le niveau de déplétion très cohérent. Domaines de MRR peuvent servir de témoin positif pour l’analyse de l’IPR-ID.
RBR-ID peut être utilisé pour mapper les IPR dans des cellules vivantes. Un score de RBR-ID peut être calculé pour chaque peptide estimer le potentiel de liaison à l’ARN : score de RBR-ID = - log2(normalisée + 4SU intensité/normalisé-4SU intensité) x (log10(P -value))2. La figure 3 montre un heatmap des scores de RBR-ID projetée sur la surface de la sous-unité splicéosomal U1 - 70 k. La couleur rouge vif à proximité du contact RNA, tel que déterminé par la structure cristalline, indique une identification correcte de l’interaction de protéine-ARN.
Après identification de nouvelles pratiques commerciales restrictives et leur IPR, il est fortement recommandé que leur activité de liaison à l’ARN confirmé par une méthode indépendante. Dans notre précédente étude24, nous avons identifié les TET2 comme un roman RBP et cartographié l’activité de liaison à l’ARN à une région C-terminale, comme illustré à la Figure 4 a en traçant le score RBR-ID le long de la séquence primaire de la protéine. Figure 4 b montre que l’exigence de ce roman RBR a pu être vérifiée en effectuant PAR-CLIP26 à l’aide de la séquence WT et comparant le signal à celle d’un mutant manque la RBR prédit. Un contrôle supplémentaire et une explication plus détaillée de cette expérience de validation existent en He et al. 24de 2016.
Figure 1 : vue d’ensemble de l’IPR-ID. Ces souris sont traitées avec 4SU ou pas (1 - 2) et irradié avec 312 nm UV (3). Les noyaux sont extraits digérés par la protéase et la nucléase, produisant des peptides fois réticulé et non (5) et isolé (4). RNA covalent adduits à crosslink sites altérer la masse de peptide, conduisant à une diminution correspondante de l’intensité du spectre de masse de peptide angles (6, flèche). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : ensemble du protéome RBR-ID dans mESCs. Volcan parcelles montrant journal-pli changements dans des intensités de peptide sur l’axe x et de Student t- P -valeurs sur l’axe des y pour ± 4SU traitements d’essai (312 nm). Chevauchement des domaines de MRR annotés les peptides sont en bleu. Un peptide de liaison à l’ARN d’HNRNPC est surligné en rouge. Précédemment publié dans He al 201624. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : RBR-ID mappe les sites des interactions de protéine-ARN. Zoom-dans les régions de la structure cristalline des snRNP U1 (PDB ID : 4PJO31) montrant la protéine surfaces codés par couleur en fonction de leur score de RBR-ID et interacting RNAs pour U1 - 70 K. Précédemment publié dans He al 201624. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Validation de l’IPR de TET2. Séquence primaire (A) et des domaines connus pour TET2 ; score de RBR-ID-teneur en résidus lissés tracées le long de la séquence principale (au milieu) ; et le schéma de domaine catalytique épitope-tag fragment (CD) et des constructions de RBR-supprimé (CDΔRBR) utilisées pour la validation (en bas). (B) PAR-CLIP du CD de TET2 et ΔCDΔRBR transitoirement exprimé dans les cellules HEK293. Autoradiographie pour 32RNA marqué P (en haut) et la tache occidentale de contrôle (en bas). Précédemment publié dans He al 201624. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous décrivons un plan expérimental détaillé pour effectuer RBR-ID dans mESCs et, avec les modifications appropriées, dans n’importe quelle cellule qui peut incorporer 4SU dans l’ARN. Autres types de cellules peuvent exiger l’optimisation de l’approche pour assurer un signal / bruit suffisant. En outre, alors que le protocole décrit ci-après met l’accent sur l’examen des pratiques commerciales restrictives nucléaires, la technologie de RBR-ID devrait être facilement adaptables aux différents compartiments cellulaires, tels que le cytosol ou organites spécifiques, par l’utilisation de fractionnement différente stratégies. Les paramètres qui peuvent nécessiter des optimisation comprennent 4SU temps de concentration et d’intégration ainsi que l’énergie de la réticulation UV. Ces paramètres sont importants pour assurer une formation efficace des ARN-protéine crosslinks et donnent un satisfaisant rapport signal sur bruit. Nous avons montré que 312 lumière UVB de nm est beaucoup plus efficace à réticulation contenant 4SU RNAs aux protéines par rapport à la 365 nm UVA généralement utilisée dans le CLIP PAR32. Direct Comparaison de RBR-ID effectuée avec 312 nm et 365 nm ont démontré que 312 nm UVB a permis l’identification d’une partie beaucoup plus grande de connus de pratiques commerciales restrictives24.
Deux autres méthodes sont disponibles pour réaliser l’identification RBP proteome-échelle. Un, appelé RBDmap, est semblable à RBR-ID dans qu’il utilise la réticulation UV et MS. RBDmap servait à identifier les pratiques commerciales restrictives et carte de leurs activités de liaison à l’ARN de cellules HeLa23. Cette méthode repose sur une identification positive des peptides adjacents aux sites de liaison à l’ARN et s’appuie sur deux séquentiel oligo-dT pull-down, ce qui suggère qu’il pourrait avoir un plus faible taux de faux positifs que RBR-ID. Cependant, le pull-down permettre seulement l’identification des pratiques commerciales restrictives qui lient à ARN polyA + et nécessitent de grandes quantités de matières entrantes, pouvant atteindre de 10 à 100 fois plus que RBR-ID. RBR-ID peut être effectuée avec aussi peu que 5 µg de protéines par réplicat biologique (~ 2 µg par réplicat technique), qui peut être collecté à partir d’aussi peu que 250 000 cellules.
La deuxième méthode, appelée SONAR, repose sur l’exploration de données de bases interaction protéine-protéine grand pour détecter les protéines que purifier souvent conjointement avec des pratiques commerciales restrictives connues et dont l’interaction avec ces pratiques commerciales restrictives peut-être donc être médiée par RNA18. Cette approche intelligente est très puissante et permet d’identifier de nouvelles pratiques commerciales restrictives sans effectuer toute expérience aqualabo, pourvu que les bases de données appropriées sont disponibles ; Néanmoins, il ne peut pas révéler les sites d’interaction, est complémentaire, mais ne le remplacent pas à RBR-ID.
En résumé, notre technique de RBR-ID peut identifier les nouvelles pratiques commerciales restrictives et carte leur IPR avec quantités d’échantillon d’entrée limité et sans nécessiter aucune purification biochimique des complexes protéine-ARN réticulé. La technique ne fait aucune hypothèse sur le type d’ARN lié par les pratiques commerciales restrictives identifiés et par conséquent peut mapper l’activité RNA de liaison des protéines qui se lient aux non-polyadénylé, dont beaucoup sont non codantes, suggérant que les RBR-ID pourrait s’avérer une technique utile pour étudier la rôles régulateurs d’ARN non codants.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
R.B. a été pris en charge par le programme des boursiers Searle, la W.W. Smith Foundation (C1404) et la marche des dix sous fondation (1-FY-15-344). B.A.G reconnaît l’appui du NIH subventions R01GM110174 et NIH R01AI118891, ainsi que de DOD accorder BC123187P1. R.W.-T. était appuyée par une subvention de formation NIH T32GM008216.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed - Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
References
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