Summary
Descriviamo un protocollo per identificare le proteine RNA-leganti e mappare loro regioni di RNA-binding in cellule vive utilizzando photocrosslinking UV-mediati e spettrometria di massa.
Abstract
RNA non codificanti svolgono i ruoli importanti in diversi processi nucleari, tra cui che regolano l'espressione genica, struttura della cromatina e riparazione del DNA. Nella maggior parte dei casi, l'azione di RNA non codificante è mediato dalle proteine le cui funzioni sono a loro volta regolate da queste interazioni con RNA non codificanti. Coerentemente con questo, un numero crescente di proteine coinvolte in funzioni nucleari è stato segnalato per legare RNA e in alcuni casi le regioni di RNA-binding di queste proteine sono state mappate, spesso attraverso metodi laboriosi, basati su candidati.
Qui, segnaliamo un protocollo dettagliato per eseguire un'alto-rendimento, tutto il proteoma imparziale identificazione di proteine RNA-leganti e le loro regioni di RNA-binding. La metodologia si basa sull'incorporazione di un uridina fotoreattivo analogico in RNA cellulare, seguito da reticolazione UV-mediata della proteina-RNA e analisi di spettrometria di massa per rivelare RNA-reticolato peptidi all'interno del proteoma. Anche se Descriviamo la procedura per cellule staminali embrionali di topo, il protocollo deve essere facilmente adattato ad una varietà di cellule coltivate.
Introduction
Lo scopo del metodo RBR-ID è di identificare nuove proteine RNA-leganti (RBPs) e mappare le loro regioni di RNA-binding (RBRs) con risoluzione di peptide-livello per facilitare la progettazione di mutanti di RNA-binding e l'indagine del biologico e biochimico funzioni delle interazioni della proteina-RNA.
il RNA è unica tra le biomolecole come può agire come un messaggero che trasportano informazioni genetiche sia anche piegare in complesse strutture tridimensionali con funzioni biochimiche più simili a quelle di proteine1,2. Un corpo crescente di prova suggerisce che il RNA non codificante (ncRNAs) svolgono un ruolo importante in vari gene vie regolamentazione ed epigenetici3,4,5 e, in genere, queste funzioni di regolamentazione sono mediate in concerto con proteine che interagiscono specificamente con un determinato RNA. Di particolare rilevanza, recentemente è stato identificato un insieme di proteine che interagiscono per il ncRNA lungo intensamente studiato (lncRNA) Xist, fornendo informazioni preziose in come questo lncRNA media inattivazione del cromosoma x in cellule femminili6,7 ,8. In particolare, molte di queste proteine interagenti Xist non contengono alcun canonico RNA-binding domini9, e quindi loro attività RNA-binding non poteva essere previsto in silico basata alla loro sequenza primaria da solo. Considerando che migliaia di lncRNAs è espressi in qualsiasi data cellula10, è ragionevole presumere che molti di loro potrebbe agire tramite interazioni con ancora di essere scoperto le proteine RNA-leganti (RBPs). Una strategia sperimentale per identificare queste RBPs romanzo sarebbe pertanto facilitare notevolmente il compito di sezionare la funzione biologica di ncRNAs.
Precedenti tentativi di identificare RBPs empiricamente si affidano di polyA + RNA selezione accoppiata a spettrometria di massa (MS)11,12,13,14,15. Anche se questi esperimenti aggiunto molte proteine alla lista dei presunti RBPs, da design che potrebbe rilevare solo proteine legate alle trascrizioni di poliadenilazione. Tuttavia, la maggior parte dei piccoli RNA e molti lncRNAs non sono poliadenilazione. 16 , 17 e le loro proteine interagenti sarebbero probabilmente stati mancati in questi esperimenti. Un recente studio applicato apprendimento automatico ai database Interactoma proteina-proteina per identificare le proteine che co-purificato con più noto RBPs e ha mostrato che questi partner RBP ricorrenti erano più probabili di possedere attività di legame al RNA18. Tuttavia, questo approccio si basa sul database di grande interazione esistenti di data mining e può identificare solo proteine che possono essere co-purificate in condizioni di non-denaturante con RBPs noti, così escludendo dall'analisi insolubile, membrana incorporato e scarse proteine.
L'identificazione di una proteina come una bona fide RBP spesso non produce automaticamente informazioni sulla funzione biologica e/o biochimica dell'interazione proteina-RNA. Per risolvere questo punto, è in genere appropriato per identificare i residui proteici dell'aminoacido e dominio coinvolti nell'interazione, in modo che mutanti specifici possono essere progettati per testare la funzione di legame al RNA nel contesto di ogni romanzo RBP19, 20. gli sforzi precedenti dal nostro gruppo e altri hanno utilizzato frammenti della proteina ricombinante e mutanti di delezione per identificare RNA binding regioni (RBRs)19,20,21,22; Tuttavia, tali approcci sono laboriosi e incompatibile con le analisi di alto-rendimento. Più recentemente, uno studio descritto una strategia sperimentale per mappare attività RNA-binding a una moda di alto-rendimento mediante spettrometria di massa23; Tuttavia, questo approccio invocata una selezione doppia polyA + RNA e così ha trasportato le stesse limitazioni di RBP identificazione approcci descritti sopra.
Abbiamo sviluppato una tecnica, denominata identificazione di regione di associazione di RNA (RBR-ID), che sfrutta la proteina-RNA photocrosslinking e quantitativa spettrometria di massa per identificare proteine e regioni della proteina che interagiscono con il RNA in cellule vive senza fare assunta lo stato di poliadenilazione di RNA, includendo così RBPs associato a polyA-RNAs24. Inoltre, questo metodo si basa esclusivamente sulla reticolazione e non prevede alcun requisito sulla solubilità della proteina o accessibilità ed è quindi adatto per mappare attività RNA-binding all'interno di membrane (ad es. l'involucro nucleare) o compartimenti scarsamente solubili ( ad esempio la matrice nucleare). Descriviamo la procedura sperimentale per eseguire RBR-ID per i nuclei delle cellule staminali embrionali di topo (mESCs) ma con modifiche minori questo protocollo dovrebbe essere adatto per una varietà di tipi cellulari, purché essi possono incorporare efficientemente 4SU dalla cultura medio.
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Protocol
1. cultura e l'espansione delle mESCs
NOTE: cellule staminali embrionali di topo sono facili da cultura e può essere rapidamente ampliate ai grandi numeri richiesti da esperimenti biochimici grazie al loro tempo in bicicletta veloce. Sano mESCs raddoppiare ogni 12 h.
- MESCs Espandi il numero desiderato sulle piastre gelatinizzati in mESC medio (Vedi sotto) in un'incubatrice di coltura del tessuto mantenuto a 37 ° C, 5% CO 2, e > 95% di umidità.
Nota: Abbastanza piatti devono essere preparati per 3-5 replicati biologici per il + 4SU campione e controllo - 4SU. Una piastra di 10 cm (ossia 5 milioni di cellule) è più che sufficiente per ogni replica biologico. - Il mezzo per mESCs è composto da Dulbecco ' s modificato Eagle ' medio s (DMEM) completati con 15% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-Glutammina, 0,5 x penicillina/streptomicina, 1 x non essenziali aminoacidi, 100 µM beta-mercaptoetanolo, 1.000 U fattore inibitorio di /ml leucemia (LIF), 3 µM CHIR99021, 1 µM PD0325901.
- Prima passaggio mESCs, preparare il numero desiderato di piatti da 10 cm.
- Aggiungere 4 mL di 0,1% di gelatina in acqua facendo attenzione che l'intera superficie della piastra è coperta; Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (TA); rimuovere la soluzione di gelatina.
- Passage cellule quando raggiungono 10 milioni di cellule per piastra, tipicamente ~ 48 h dopo l'inoculazione.
Nota: Come mESCs crescere in grandi colonie, piastre non dovrebbero mai essere consentiti raggiungere confluency di 100% come osservato per linee cellulari che crescono negli strati monomolecolari (ad esempio HEK293 o cellule 3T3). Una piastra mESC dovrebbe essere attraversata quando ~ 50% confluenti e sicuramente prima il mezzo diventa giallo.- Per staccare le cellule, lavare le piastre con denso mESC culture una volta in 1x tampone fosfato salino (PBS) completato con 2 mM EDTA, poi aggiungere tripsina 0.05% disciolta in DMEM e restituire lastra di incubatore per 5 min (37 ° C, 5% CO 2, e > 95% umidità).
- Rimuovere la piastra dall'incubatore e risospendere le cellule con un volume uguale di DMEM pipettando su e giù vigorosamente diverse volte.
- Contare le celle utilizzando un emocitometro e garantire che le cellule formano una sospensione unicellulare (cioè non cluster), poi centrifugare cella miscela 500 x g per 5 min a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1-2 mL DMEM.
- Inoculare cellule ad una densità di 10.000 cellule/cm 2 in mezzo mESC (cioè ~ 800.000 cellule per piastra di 10 cm) utilizzando le piastre rivestite con gelatina preparate al punto 1.3.1.
2. Reticolazione della proteina – interazioni RNA nelle cellule Live
Nota: reticolazione della RNA-proteina è mediato da foto-activatable ribonucleoside analogico 4-thiouridine (4SU). 4SU ha un massimo di assorbanza maggiore rispetto endogeno nucleotidi e possono solo essere inglobati in RNA; pertanto intermedio-lunghezza d'onda UVB può essere utilizzato per selettivamente crosslink RNA a proteine 25 , 26. Trattamento di UVB delle cellule trattate 4SU porta a legami crociati covalenti tra 4SU-contenente RNA e aminoacidi, con una preferenza segnalata per Tyr, Trp, Met, Lys e Cys 27.
- MESCs di espandere il numero di piastre di 10 cm come descritto nel passo 1.
Nota: Abbastanza piatti devono essere preparati per 3-5 replicati biologici per il + 4SU campione e controllo - 4SU. Una piastra di 10 cm (ossia 5 milioni di cellule) è sufficiente per ogni replica biologico. - Prima le piastre hanno raggiunto confluency, aggiungere 4SU direttamente in mezzo ad una concentrazione finale di 500 µM. lasciare - 4SU piatti di controllo non trattati.
- Piastre agitare delicatamente per distribuire il 4SU in modo omogeneo in tutto il mezzo. Restituirli nell'incubatore di coltura del tessuto stesso per 2 h (37 ° C, 5% CO 2, e > 95% di umidità).
- Piastre di trasferimento di un secchio di ghiaccio ed eliminare terreno.
- Risciacquare la piastra delicatamente con 5 mL di PBS ghiacciata.
Nota: Sciacquare delicatamente o cellule potrebbero staccare. - Aggiungere 2 mL di piastre ghiacciate di PBS e posto senza coperchi in un reticolante dotati di bulbi emettitori di UVB (312 nm). Irradiare piastre a un'impostazione di energia di 1 J/cm 2.
Nota: È fondamentale che coperchi di plastica sono rimossi o potrebbero proteggere le cellule da luce UV e prevenire reticolazione. - Raccogliere le cellule utilizzando sollevatori di cella e trasferimento a PBS ghiacciata in provette coniche. Centrifugare a 2.000 x g per 5 min, 4 ° C.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di PBS ghiacciata con 2 mM EDTA e 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF).
- Conteggio celle utilizzando un emocitometro. Aspettare 5-10 e 10 milioni di cellule da piastre di 10 cm e 15 cm rispettivamente.
- Centrifuga a 2.000 x g per 5 min, 4 ° C.
Nota: Pellettate cellule possono essere immediatamente utilizzate per il passaggio 3 o possono essere flash-congelati in azoto liquido e conservati a-80 ° C a tempo indeterminato. Si tratta di un potenziale punto di sosta.
3. Isolamento dei Nuclei
Nota: i Nuclei sono isolati per rimuovere proteine citoplasmatiche e aumentare la copertura di proteine nucleari. Questo passaggio può essere sostituito con altre forme di frazionamento cellulare per studiare RBPs in diversi compartimenti cellulari.
- Preparare ghiaccio freddo Buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.9, 4 ° C, 1.5 mM MgCl 2, 10mm KCl). Utilizzare almeno 2,5 mL per 10 milioni di cellule (come contato al punto 2.9) per l'estrazione.
Nota: Le scorte di tampone A (ad es. una bottiglia di 500 mL) possono essere preparati in anticipo e conservati a 4 ° C per 6 mesi.- Prima dell'uso, aggiungere 0,5 mM dithiothreitol (DTT) e 0,2 mM PMSF fino alla quantità desiderata (2,5 mL per 10 milioni di cellule) del buffer ghiacciata r.
- Lavare le cellule con 2 mL di tampone A per 10 milioni di cellule. Spin a 2.500 x g per 5 min a 4 ° C.
- Discard surnatante, aggiungere Buffer completato con 0,2% di un detergente non ionico, non-denaturante, ad esempio octyl-fenossi-polietossi-etanolo A (Vedi la Tabella materiali), 500 µ l per 10 milioni di cellule. Ruotare per 5 min a 4 ° C.
- Centrifugare a 2.500 x g per 5 min.
- Rimuovere il surnatante; il pellet comprende intatti nuclei privi di citoplasma.
Nota: Nuclei possono essere utilizzati immediatamente per passaggio 4 o flash-congelati in azoto liquido e conservati a-80 ° C a tempo indeterminato. Si tratta di un potenziale punto di sosta.
4. Lisi dei Nuclei
Nota: i nuclei reticolati vengono lisati in un buffer di compatibile con spettrometria di massa per rilasciare proteine e complessi proteina-RNA.
- Aggiungi buffer di lisi (9 M urea, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 24 ° C), 200 µ l per 10 milioni di cellule. Trattare con ultrasuoni per inclinare la cromatina usando un 1/8 " sonda alle impostazione di ampiezza del 50% per 5-10 s.
- Spin a 12.000 x g per 5 min e raccogliere 175 µ l del surnatante per evitare il pellet.
Nota: 100 µ l verrà utilizzato per i prossimi passi di RBR-ID e il restante 75 µ l di lisato possono essere conservati a-80 ° C per un uso successivo e/o analisi western blot. - Concentrazione nella proteina di misura tramite analisi di Bradford o simile tecnica 28. Diluire la concentrazione nella proteina in diversi campioni a 1 mg/mL o la più bassa concentrazione del campione utilizzando adeguate quantità di tampone di lisi.
Nota: Da nuclei delle mESCs 10 milioni si aspettano 100-200 µ g di proteina.
5. Digestione della tripsina
Nota: proteine vengono digerite per generare peptidi sdatto per ascendente spettrometria di massa (MS).
- Soluzione aggiungere DTT a nucleare lisato (5mm finale); Incubare per 1h a RT.
- Aggiungere iodoacetamide da azione fresche (14mm finale); Incubare 30 min a temperatura ambiente al buio.
- Diluire lisato con 5 volte il volume di 50mm NH 4 HCO 3
- Aggiungere la tripsina (proteina µ g: tripsina µ g = 200:1); Incubare a 37 ° C durante la notte.
6. Desalificazione di peptidi
- preparare un suggerimento di fase su misura per esempio.
- 6.1.1. Inserire un disco di materiale di estrazione C18 fase solida nella parte inferiore della punta di una pipetta 200 µ l.
- Aggiungere 50 µ l di oligo R3 invertito resina fase sopra il disco di C18. Posto tappa punta all'interno di centrifugazione adattatore e la punta di posto con adattatore all'interno di un tubo da 1,5 mL microfuge.
- Aggiungere 100 µ l 100% acetonitrile to consigli per lavare. Centrifugare a 1000 x g per 1 min rimuovere il solvente.
- Equilibrato con 50 µ l 0,1% l'acido trifluoroacetico (TFA). Centrifugare a 1000 x g per 1 min.
- Aggiungere acido formico 100% proteine digerite campione per diminuire il pH di 2-3.
Nota: Questo dovrebbe richiedere ~ 5 µ l per 1 mL del campione diluito del peptide, ma pH dovrebbe essere misurato e più formico acido aggiunto se necessario. - Campione di carico sul suggerimento di fase su misura, centrifugare a 1000 x g per 1 min fino a tutto il campione passa attraverso la punta.
- Lavaggio associato peptidi con 50 µ l 0,1% TFA. Centrifugare a 1000 x g per 1 min.
- Eluire peptidi aggiungendo 50 µ l di tampone di eluizione (75% acetonitrile, 0.025% TFA) fase punta e centrifugare a 1000 x g per 1 min forzare il tampone di eluizione dalla punta.
- a secco l'esempio utilizzando una centrifuga vuoto impostato a 150 x g e 1-3 kPa per 1 h.
Nota: Peptidi secchi possono essere memorizzati a-80 ° C a tempo indeterminato. Si tratta di un potenziale punto di sosta.
7. Rimozione di reticolato RNA
Nota: trattare peptidi con nucleasi per rimuovere reticolato RNA.
- Risospendere il pellet in 50 µ l 2 x nucleasi tampone (100mm NH 4 HCO 3, 4mm MgCl 2).
- Peptide misura concentrazione utilizzando assorbanza a 280 nm assumendo 1 mg/mL di peptidi per un'A 280 di 1.
Nota: La concentrazione attesa è 1 mg/mL. - Regolare tutti i campioni a 1 mg/mL o per la concentrazione più bassa utilizzando 2x buffer di nucleasi.
- Preparare un mix master di 50 µ l di H 2 O + nucleasi di elevata purezza di 1 µ l (≥ 250 U) (fare riferimento alla Tabella materiali) per esempio.
- Prendere 50 µ l di campione del peptide e aggiungere 50 µ l di H 2 O + nucleasi master mix.
- Incubare a 37 ° C per 1 h. procedere per eseguire spettrometria.
Nota: I peptidi sono ora pronti per spettrometria di massa. Possono essere analizzati immediatamente o conservati a-80 ° C a tempo indeterminato. Si tratta di un potenziale punto di sosta.
8. Nano cromatografia liquida, spettrometria di massa ed elaborazione dati Raw
Nota: perché 4SU-reticolazione cambia la massa del peptide, loro ioni non contano per l'intensità del peptide non reticolati durante LC-MS/MS, che pertanto sembra essere diminuita di reticolazione. Il grado e la coerenza di questa diminuzione riflette il grado di reticolazione della proteina-RNA per ogni peptide 24.
- HPLC preparare buffer come segue: acido formico 0,1% in acqua di grado HPLC (tampone A); acido formico 0.1% in acetonitrile di grado HPLC (tampone B).
- Se un nano-HPLC è disponibile, collegare una nano-colonna con le seguenti specifiche: diametro interno 75 µm; pranzo con particelle C18-AQ; lunghezza 20-25 cm.
Nota: Se l'HPLC disponibili viene eseguito alle portate più elevate è possibile utilizzare una dimensione di colonna corretto per il tasso di flusso indicata. Cromatografia di flusso superiore diminuisce la sensibilità. - Programma il metodo HPLC come segue: portata 250-300 nL/min; gradiente da 2 a 28% buffer B in 120 min, da 28 a 80% B per il prossimo 5 min e isocratica 80% B per 10 min.
Nota: Se il HPLC non dispone di un caricamento del campione precedente equilibrazione colonna automatizzato, avviare il programma con 10 min a 0% B prima di caricare il campione. - Programma il metodo di acquisizione di MS per effettuare l'acquisizione di dati-dipendente (DDA) come gli esperimenti di proteomica fucile standard. Il ciclo di dovere di strumento deve essere alternativamente scansioni complete di MS con tandem MS scansioni (o MS/MS) dei segnali più intensi. Utilizzare le impostazioni ottimali per le esecuzioni di proteomica MS.
Nota: Per ottenere risultati sicuri, impiegare gli strumenti che possono eseguire almeno il MS completa scansione in modalità ad alta risoluzione (ad esempio orbitrap, time-of-flight). Per la quantificazione accurata, assicurarsi che gli intervalli tra le analisi complete di MS non sono più di 3 cicli di lavoro più lungo s. potrebbero impedire la definizione esatta di cromatogrammi di ioni estratti. - 1-2 µ g di campione sulla colonna HPLC di caricare ed eseguire il metodo HPLC-MS/MS come programmato. Per ogni replica biologico eseguire almeno due sequenze indipendenti e trattarli come tecnici replicati.
- Dopo MS, importare i file raw in un pacchetto di software di proteomica di MS/MS spettri identificazione e quantificazione di peptide tramite cromatografia ionica estratti. Si consiglia di pacchetti software che possono eseguire allineamento cromatografico di multiplo MS viene eseguito (Vedi la Tabella materiali) 29 , 30.
- Se l'opzione è disponibile nella suite software, attivare " Match tra piste " prima di iniziare il trattamento dei dati.
- Una volta terminata l'analisi, esportare l'elenco di peptide insieme ai valori di quantificazione.
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Representative Results
Figura 1 illustra il flusso di lavoro di RBR-ID. A causa della reticolazione relativamente bassa efficienza di questa tecnica, è molto importante considerare il livello di esaurimento e la coerenza degli effetti osservati (P -valore) attraverso replicati biologici. La figura 2 Mostra un diagramma a Vulcano risultato RBR-ID. Peptidi che sovrapposti dominio motivo (RRM) riconoscimento di RNA mostrano lo svuotamento altamente coerente livello. Domini RRM possono essere utilizzati come controllo positivo per l'analisi di RBR-ID.
RBR-ID può essere utilizzato per mappare RBRs in cellule vive. Un punteggio di RBR-ID può essere calcolato per ogni peptide stimare il potenziale di RNA-binding: Punteggio di RBR-ID = - log2(normalizzato + 4SU intensità/normalizzato-4SU intensità) x (log10(P -valore))2. La figura 3 Mostra una mappa di concentrazione di spartiti di RBR-ID proiettata sulla superficie della subunità spliceosomal U1 - 70K. Il colore rosso brillante nelle vicinanze del contatto RNA, come determinato dalla struttura di cristallo, indica la corretta identificazione dell'interazione proteina-RNA.
All'identificazione del romanzo RBPs e loro RBRs, si consiglia vivamente che la loro attività di legame al RNA essere confermati con un metodo indipendente. Nel nostro precedente studio24, abbiamo identificato TET2 come un romanzo RBP e mappato l'attività di legame al RNA ad una regione C-terminale, come illustrato nella Figura 4A riportando il Punteggio di RBR-ID lungo la sequenza primaria della proteina. Figura 4B Mostra che il requisito per questo romanzo RBR potrebbe essere verificata eseguendo PAR-CLIP26 utilizzando la sequenza WT e confrontando il segnale a quella di un mutante privo del predetto RBR. Ulteriore controllo e spiegazione più dettagliata di questo esperimento di convalida sono disponibili in He et al. 201624.
Figura 1: Panoramica di RBR-ID. Mouse CES sono trattati con 4SU o non (1 - 2) ed irradiati con 312 nm UV (3). I nuclei sono isolati (4) ed estratti digeriti con proteasi e nucleasi, producendo sia reticolato e reticolato peptidi (5). Addotti covalente RNA alle crosslink siti alterano la massa del peptide, portando ad una corrispondente diminuzione nell'intensità dello spettro di massa del peptide reticolato (6, freccia). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: tutto il proteoma RBR-ID in mESCs. Vulcano trame visualizzando registro-fold cambiamenti nell'intensità del peptide sull'asse x e dello studente t- P -valori sull'asse y per ± 4SU trattamenti di prova (312 nm). Peptidi sovrapposti con annotazioni domini RRM sono in blu. Un peptide di RNA-binding da HNRNPC è evidenziato in rosso. Precedentemente pubblicato su He et al 201624. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: RBR-ID Mappe: i siti delle interazioni della proteina-RNA. Zoom-in regioni della struttura cristallina di snRNP U1 (PDB ID: 4PJO31) risultati della proteina superfici color-coded secondo il loro punteggio di RBR-ID e interagendo RNAs per U1 - 70K. Precedentemente pubblicato su He et al 201624. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: convalida di RBR di TET2. (A) sequenza primaria e domini noti per TET2; lisciato il Punteggio di residui RBR-ID tracciati lungo la sequenza primaria (al centro); e lo schema di dominio catalitico epitopo-etichetta frammento (CD) e costrutti di RBR-eliminato (CDΔRBR) utilizzati per la convalida (in basso). (B) PAR-CLIP di TET2 CD e ΔCD transitoriamente espressoΔRBR in cellule HEK293. Autoradiografia per 32P-identificato RNA (in alto) e controllo western blot (in basso). Precedentemente pubblicato su He et al 201624. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Descriviamo un protocollo sperimentale dettagliato per eseguire RBR-ID in mESCs e, con opportune modifiche, in qualsiasi cella che può incorporare 4SU in RNA. Altri tipi di cellule possono richiedere ottimizzazione dell'approccio per garantire un sufficiente rapporto segnale-rumore. Inoltre, mentre il protocollo descritto nel presente documento si concentra sull'esame di RBPs nucleare, la tecnologia di RBR-ID dovrebbe essere facilmente adattata a diversi compartimenti cellulari, ad esempio il citosol o organelli specifici, mediante uso di frazionamento diverso strategie. Parametri che possono richiedere ottimizzazione includono 4SU concentrazione e incorporazione tempo così come l'energia di reticolazione UV. Questi parametri sono importanti per garantire l'efficiente formazione di legami incrociati della RNA-proteina e resa un soddisfacente rapporto segnale-rumore. Abbiamo dimostrato che la luce UVB 312 nm è molto più efficiente a reticolazione 4SU-contenente RNA alle proteine rispetto a 365 nm UVA tipicamente utilizzato in PAR-CLIP32. Diretto confronto di RBR-ID eseguito con 312 nm e 365 nm ha dimostrato che 312 nm UVB ha portato all'identificazione di una parte molto più grande di noto RBPs24.
Due altri metodi sono disponibili per l'identificazione di RBP tutto il proteoma. Uno, chiamato RBDmap, è simile a RBR-ID in che utilizza reticolazione UV e MS. RBDmap è stato usato per identificare RBPs e mappa loro attività RNA-binding di cellule HeLa23. Questo metodo si basa sulla identificazione positiva dei peptidi adiacente ai siti di legame al RNA e si basa su due oligo-dT sequenziale pull-down, suggerendo che potrebbe avere un più basso tasso di falsi positivi di RBR-ID. Tuttavia, il pull-down consente solo l'identificazione di RBPs che legano a polyA + RNA e richiedono grandi quantità di materiale in entrata, fino a 10 - 100 volte più di RBR-ID. RBR-ID può essere eseguita con appena 5 µ g di proteine per replicare biologico (~ 2 µ g / replicare tecnico), che possa essere raccolti da poco più di 250.000 cellule.
Il secondo metodo, definito SONAR, si basa sull'estrazione mineraria di dati dei database di interazione proteina-proteina grande per rilevare le proteine che frequentemente co-purificare con RBPs noto e la cui interazione con queste RBPs pertanto potrebbe essere mediata da RNA18. Questo approccio intelligente è molto potente e permette l'identificazione del romanzo RBPs senza eseguire qualsiasi esperimento di laboratorio bagnato, purché adatti database sono disponibili; Tuttavia, esso non può rivelare i siti di interazione e quindi è complementare ma non alternativa RBR-ID.
In sintesi, la nostra tecnica di RBR-ID può identificare RBPs romanzo e mappa loro RBRs con una quantità di campione di ingresso limitato e senza richiedere alcuna purificazione biochimiche dei complessi proteina-RNA reticolato. La tecnica non fa alcuna ipotesi sul tipo di RNA vincolato il RBPs identificati e quindi possibile mappare l'attività obbligatoria di RNA di proteine che si legano a non-poliadenilazione, molte delle quali sono non codificanti, suggerendo che RBR-ID potrebbe rivelarsi una tecnica utile per studiare la ruoli regolatori di RNA non codificanti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
R.B. è stato sostenuto dal programma studiosi Searle, la W.W. Smith Foundation (C1404) e il March of Dimes Foundation (1-FY-15-344). B.A.G riconosce sostegno da NIH sovvenzioni R01GM110174 e R01AI118891 NIH, così come DOD concedere BC123187P1. R.W.-T. è stato sostenuto da grant di formazione NIH T32GM008216.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed - Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
References
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