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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Published: September 28, 2017 doi: 10.3791/56004
Automatic Translation
1,4, 1,2, 1,3, 1,3, 1,2
1Epigenetics Institute, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 3Department of Biochemistry and Biophysics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Graduate Group in Biochemistry and Biophysics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Summary

Descreveremos um protocolo para identificar proteínas RNA-obrigatórias e mapear suas regiões de ligação de RNA em células vivas, usando photocrosslinking UV-mediada e espectrometria de massa.

Abstract

RNA não-codificante desempenham papéis importantes em diversos processos nucleares, incluindo a regulação da expressão gênica, estrutura da cromatina e reparação do DNA. Na maioria dos casos, a ação de RNA não-codificante é mediada por proteínas que por sua vez, cujas funções são regulamentadas por essas interações com RNA não-codificante. Consistente com este, um número crescente de proteínas envolvidas em funções nucleares têm sido relatado para vincular o RNA e em alguns casos as regiões de RNA-ligação destas proteínas foram mapeadas, muitas vezes através de métodos laboriosos, baseado no candidato.

Aqui, nós relatamos um protocolo detalhado para realizar uma identificação imparcial elevado-throughput, proteoma-largo de RNA-proteínas e suas regiões de RNA-obrigatórias. A metodologia baseia-se na incorporação de uma uridina fotorreativas analógica no RNA celular, seguido de reticulação de RNA-proteína mediada por UV e análises de espectrometria de massa para revelar o RNA-quitosana péptidos dentro do proteoma. Embora nós descrevemos o procedimento para as células estaminais embrionárias de rato, o protocolo deve ser facilmente adaptado a uma variedade de culturas de células.

Introduction

O objetivo do método RBR-ID é identificar novas proteínas RNA-obrigatórias (RBPs) e mapear as regiões de RNA-obrigatórias (RBRs) com resolução de peptídeo-nível para facilitar o design de mutantes de RNA-obrigatórias e a investigação da biológicas e bioquímicas funções de interações proteína-RNA.

O RNA é único entre biomoléculas pode atuar como um mensageiro carregando informação genética e também dobrar em estruturas tridimensionais complexas com funções bioquímicas mais parecidas com as de proteínas1,2. Um corpo crescente de evidências sugere que o RNA não-codificante (ncRNAs) desempenhar um papel importante em diversos genes vias regulamentares e epigenéticas3,4,5 e, normalmente, essas funções reguladoras são mediadas em concerto com proteínas que interagem especificamente com um determinado RNA. De particular importância, um conjunto de proteínas de interação foi recentemente identificado para o ncRNA longo intensamente estudada (lncRNA) Xist, fornecendo insights valiosos sobre como este lncRNA Medeia a inativação do cromossomo x em células femininas6,7 ,8. Notavelmente, várias destas proteínas Xist-interagindo não contêm qualquer de domínios de RNA-ligação canônica9, e, portanto, sua atividade RNA-ligação não poderia ser previsto em silico com base em sua sequência primária sozinha. Considerando que milhares de lncRNAs são expressos em qualquer determinada célula10, é razoável supor que muitos deles podem agir através de interações com o ainda a ser descoberto proteínas RNA-obrigatórias (RBPs). Uma estratégia experimental para identificar essas novela RBPs, portanto, iria facilitar grandemente a tarefa de dissecar a função biológica de ncRNAs.

Tentativas anteriores para identificar RBPs empiricamente têm invocado polyA + RNA seleção acoplada a espectrometria de massa (MS)11,12,13,14,15. Embora estas experiências adicionado muitas proteínas à lista do RBPs putativos, por design, que só podiam detectar proteínas vinculadas a polyadenylated transcrições. No entanto, a maioria dos RNAs pequeno e muitos lncRNAs não são polyadenylated. 16 , 17 e suas proteínas de interação teria provavelmente sido perdidas nesses experimentos. Um estudo recente da proteína-proteína interactome bancos de dados para identificar as proteínas que co purificado com vários conhecidos RBPs e mostraram que esses parceiros RBP recorrentes eram mais prováveis de possuir RNA-obrigatórias atividades18aplicada aprendizado de máquina. No entanto, essa abordagem baseia-se na mineração de bancos de dados existentes de grande interação e só podemos identificar as proteínas que podem ser co purificadas em condições não-desnaturação com conhecidos RBPs, excluindo assim a partir da análise, insolúvel, membrana-incorporado e escassa proteínas.

A identificação de uma proteína como uma bona fide RBP muitas vezes não produz automaticamente informações sobre a função biológica e/ou bioquímica da interação da proteína-RNA. Para resolver este ponto, é geralmente desejável para identificar os proteína domínio amino-ácido resíduos e envolvidos na interação, para que os mutantes específicos podem ser projetados para testar a função de ligação de RNA no contexto de cada novela RBP19, 20. esforços anteriores do nosso grupo e outros usaram fragmentos de proteína recombinante e exclusão mutantes para identificar RNA vinculação regiões (RBRs)19,20,21,22; no entanto, tais abordagens são trabalhosas e incompatível com as análises de alta produtividade. Mais recentemente, um estudo descreveu uma estratégia experimental para mapear as atividades de RNA-obrigatórias em uma moda de alta produtividade usando espectrometria de massa23; no entanto, esta abordagem baseou-se em uma seleção duplo polyA + RNA e assim, carregava as mesmas limitações que as abordagens de identificação RBP descritas acima.

Desenvolvemos uma técnica, denominada RNA vinculação região identificação (RBR-ID), que explora a proteína-RNA photocrosslinking e espectrometria de massa quantitativa para identificar proteínas e regiões da proteína interagindo com RNA em células vivas sem fazer suposição sobre o estatuto de poliadenilação RNA, incluindo assim RBPs vinculado a polyA-RNAs24. Além disso, esse método depende exclusivamente de reticulação e tem sem requisitos na solubilidade de proteínas ou acessibilidade e, portanto, é adequado para mapear as atividades de RNA-obrigatórias dentro membranas (por exemplo, o envelope nuclear) ou compartimentos pouco solúvel ( por exemplo, a matriz nuclear). Descrevemos as etapas experimentais para executar RBR-ID para os núcleos de células estaminais embrionárias de rato (mESCs), mas com pequenas modificações este protocolo deve ser apropriado para uma variedade de tipos de células, desde que eles eficientemente podem incorporar 4SU da cultura médio.

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Protocol

1. cultura e expansão de mESCs

Nota: as células estaminais embrionárias de rato são fáceis de cultura e pode ser expandidas rapidamente para os grandes números exigidos pelo bioquímicas experiências graças a seu tempo de ciclagem rápida. MESCs saudáveis dobrar a cada 12 h.

  1. MESCs expandir para o número desejado em placas gelatinizadas no mESC médio (veja abaixo) em uma incubadora de cultura de tecidos mantido a 37 ° C, 5% de CO 2, e > 95% de umidade.
    Nota: Suficiente placas devem estar preparadas para 3-5 repetições biológicas para o + 4SU amostra e controle a - 4SU. Uma placa de 10 cm (ou seja, 5 milhões de células) é mais do que suficiente para replicar cada biológico.
  2. o meio de mESCs é composto por Dulbecco ' s modificado águia ' meio de s (DMEM) suplementado com 15% soro bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 0.5 x penicilina/estreptomicina, 1 x não aminoácidos essenciais, 100 µM beta-Mercaptoetanol, 1.000 U /mL leucemia inibitório fator (LIF), 3 µM CHIR99021, 1 µM PD0325901.
  3. Antes de passagem mESCs, prepare o número desejado de placas de 10 cm.
    1. Adicionar 4 mL de 0.1% de gelatina em água, certificando-se de que toda a superfície da placa é coberta; incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT); remover a solução de gelatina.
  4. Passagem de células quando atingirem 10 milhões de células por prato, tipicamente ~ 48 h após a inoculação.
    Nota: Como mESCs crescer em colônias densas, placas nunca poderão alcançar confluência de 100%, como observado por linhas de células que crescem em monocamadas (por exemplo, HEK293 ou células 3T3). Uma placa de mESC deve ser passada quando ~ 50% confluente e definitivamente antes o meio fica amarela.
    1. Para separar as células, lavar pratos com culturas densas mESC uma vez em 1 x solução salina tampão fosfato (PBS) suplementada com 2 mM de EDTA, em seguida, adicionar tripsina 0,05% dissolvida em DMEM e retornar placa a incubadora por 5 min (37 ° C, 5% de CO 2, e > 95% umidade).
    2. Retirar a placa da incubadora e ressuspender as células com igual volume de DMEM pipetando subindo e descendo vigorosamente várias vezes.
    3. Contar células usando hemocytometer e certifique-se de que as células formam uma suspensão de célula única (ou seja, sem clusters), centrifugar célula mistura 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender células em 1-2 mL DMEM.
    4. Inocular as células em uma densidade de 10.000 células/cm 2 no meio de mESC (ou seja, ~ 800.000 células por placa de 10 cm) usando as placas revestidas gelatina preparadas na etapa 1.3.1.

2. Ligação cruzada de proteínas – interações RNA nas células ao vivo

Nota: reticulação de RNA-proteína é mediada pelo ribonucleoside foto-ativável analógico 4-thiouridine (4SU). 4SU tem um máximo de absorbância mais tempo do que endógenos nucleotídeos e só pode ser incorporada do RNA; Portanto, o intermediário-comprimento de onda UVB pode ser usado para seletivamente crosslink RNA proteínas 25 , 26. Tratamento de UVB de células tratadas 4SU leva a ligações covalentes cruzadas entre 4SU contendo RNA e aminoácidos, com uma preferência relatado por Tyr, Trp, Met, Lys e Cys 27.

  1. MESCs expandir para o número necessário de placas de 10 cm, como descrito no passo 1.
    Nota: Suficiente placas devem estar preparadas para 3-5 repetições biológicas para o + 4SU amostra e controle a - 4SU. Uma placa de 10 cm (ou seja, 5 milhões de células) é suficiente para cada biológico replicar.
  2. Antes que as chapas atinjam a confluência, adicionar 4SU diretamente em meio a uma concentração final de 500 µM. deixe - 4SU pratos de controle não tratados.
  3. Placas de agitar suavemente para distribuir o 4SU homogênea em toda a mídia. Devolvê-los para a mesma cultura de tecidos incubadora para 2h (37 ° C, 5% de CO 2, e > 95% de umidade).
  4. Placas de transferência para um balde de gelo e descarte o meio.
  5. Lavar a placa suavemente com 5 mL de PBS gelado.
    Nota: Lave suavemente ou células podem desanexar.
  6. Adicionar 2 mL de placas geladas de PBS e lugar sem tampas em um agente reticulante equipado com lâmpadas emissoras de UVB (312 nm). A irradiação de placas em uma configuração de energia de 1 J/cm 2.
    Nota: É fundamental que tampas plásticas são removidas ou pode proteger as células de luz UV e evitar reticulação.
  7. Recolher pilhas usando levantadores de célula e transferir para PBS gelado em tubos cónicos. Centrifugar a 2.000 x g por 5 min, 4 ° C.
  8. Remover o sobrenadante e ressuspender células em 5 mL PBS gelado com 2 mM EDTA e 0,2 mM phenylmethylsulfonyl flúor (PMSF).
  9. Contagem de células usando um hemocytometer. Esperar 5-10 e 10 milhões de células das placas de 10 cm e 15 cm, respectivamente.
  10. Centrifugar 2.000 x g por 5 min, 4 ° C.
    Nota: Células peletizadas podem ser imediatamente usadas para a etapa 3 ou pode ser congelado em nitrogênio líquido e armazenados a-80 ° C indefinidamente. Este é um potencial ponto de parar.

3. Isolamento dos núcleos

Nota: núcleos são isolados para remover proteínas citoplasmáticas e aumentar a cobertura de proteínas nucleares. Esta etapa pode ser substituída por outras formas de fracionamento celular para estudar RBPs em diferentes compartimentos celulares.

  1. Preparar gelo frio Buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,9, 4 ° C, 1,5 mM de MgCl 2, 10 mM KCl). Use pelo menos 2,5 mL por 10 milhões de células (como contou na etapa 2.9) para a extração.
    Nota: As existências de tampão A (por exemplo, uma garrafa de 500 mL) podem ser preparadas com antecedência e armazenadas a 4 ° C por 6 meses.
    1. Antes da utilização, adicionar 0,5 mM ditiotreitol (DTT) e 0,2 mM PMSF ao montante desejado (2,5 mL por 10 milhões de células) do buffer gelada r.
  2. Lavar as células usando 2 mL de tampão A por 10 milhões de células. Girar a 2.500 x g por 5 min a 4 ° C.
  3. Discard sobrenadante, adicionar tampão A suplementado com 0,2% de um detergente não iônico, não-desnaturação, tais como octil-fenoxi-polyethoxy-etanol (veja a Tabela de materiais), 500 µ l por 10 milhões de células. Gire por 5 min a 4 ° C.
  4. Centrifugar a 2.500 x g, durante 5 min.
  5. Remover o sobrenadante; a pelota compreende núcleos intactos desprovido de citoplasma.
    Nota: Núcleos podem ser usados imediatamente para a etapa 4 ou congelado em nitrogênio líquido e armazenados a-80 ° C indefinidamente. Este é um potencial ponto de parar.

4. Lise dos núcleos

Nota: núcleos de quitosana lysed em um buffer de espectrometria de massa compatível com a liberação de proteínas e complexos de RNA-proteína.

  1. Adicionar tampão de lise (9 M de ureia, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 24 ° C), 200 µ l por 10 milhões de células. Proceda à sonicação para distorcer usando um 1/8 de cromatina " sonda no ajuste de amplitude de 50% para s. 5-10
  2. Spin a 12.000 x g por 5 min e coletar 175 µ l do sobrenadante para evitar a pelota.
    Nota: 100 µ l será usado para as próximas etapas de RBR-ID e os restantes 75 µ-l de lisado pode ser armazenado a-80 ° C para uso posterior e/ou análise ocidental do borrão.
    3. Concentração de proteína medida através do ensaio de Bradford ou semelhante técnica 28 de
  3. . Diluir a concentração de proteína nas diferentes amostras de 1 mg/mL ou a menor concentração de amostra usando quantidades apropriadas de Lise.
    Nota: Os núcleos de 10 milhões de mESCs esperar 100-200 µ g de proteína.

5. Digestão do trypsin

Nota: as proteínas são digeridas para gerar peptídeos suitable para análise de espectrometria de massa de baixo para cima (MS).

  1. DTT adicionar solução para nuclear lisado (5mm final); incubar durante 1 h em RT.
  2. Adicionar o iodoacetamide do estoque fresco (14 mM final); incubar durante 30 min à RT no escuro.
  3. Dilua o lisado com 5 vezes o volume de 50 milímetros NH 4 HCO 3
  4. Adicionar tripsina (proteína µ g: tripsina µ g = 200:1); incubar a 37 ° C durante a noite.

6. Dessalinização de peptídeos

  1. preparar uma ponta do palco sob medida por exemplo.
    1. 6.1.1. Coloque um disco de material de extração C18 de fase sólida na parte inferior de uma ponta de pipeta de 200 µ l.
    2. Adicionar 50 µ l de oligo R3 invertida resina fase em cima do disco C18. Coloque a ponta do palco dentro adaptador de centrifugação e a ponta de lugar com adaptador dentro de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    3. Adicione 100 µ l 100% acetonitrila dicas para lavar. Centrifugar a 1000 x g por 1 min remover o solvente.
    4. Equilíbrio com 50 µ l 0,1% ácido trifluoroacético (TFA). Centrifugar a 1000 x g por 1 min.
  2. Adicionar 100% de ácido fórmico a amostra de proteína digerida para diminuir o pH a 2-3.
    Nota: Isto deve exigir ~ 5 µ l / 1 mL da amostra diluída do peptide, mas pH deve ser medido e mais fórmico ácido adicionado se necessário.
  3. Amostra de carga na ponta do palco sob medida, centrifugar a 1000 x g por 1 min, até que todos da amostra passa a dica.
  4. Lavagem vinculado peptídeos com 50 µ l 0,1% TFA. Centrifugar a 1000 x g por 1 min.
  5. Eluir peptídeos pela adição de tampão de eluição 50 µ l (75% acetonitrila, 0.025% TFA) a ponta do palco e centrifugar a 1000 x g por 1 min forçar o tampão de eluição fora da ponta.
  6. Secar a amostra utilizando uma centrífuga vácuo fixado em 150 x g e 1-3-kPa para 1 h.
    Nota: Peptídeos secos podem ser armazenados a-80 ° C indefinidamente. Este é um potencial ponto de parar.

7. Remoção do RNA de quitosana

Nota: tratar de peptídeos com nuclease remover quitosana RNA.

  1. Resuspenda o pellet em 50 µ l 2 x buffer de nuclease (100mm NH 4 HCO 3, 4 mM MgCl 2).
    2. Concentração
  2. peptídeo medida utilizando absorbância em 280 nm, supondo que 1 mg/mL de peptídeos para um um 280 de 1.
    Nota: A concentração esperada é de 1 mg/mL.
  3. Ajustar todas as amostras de 1 mg/mL ou para a menor concentração usando 2x buffer de nuclease.
  4. Preparar uma mistura de mestre de 50 µ l de H 2 O + nuclease de alta pureza de 1 µ l (≥ 250 U) (consulte a Tabela de materiais) por exemplo.
  5. Levar 50 µ l de amostra do peptide e adicionar 50 µ l de H 2 O + nuclease mestre mistura.
  6. Incubar a 37 ° C por 1 h. seguir para realizar a espectrometria de massa.
    Nota: Os peptídeos estão agora prontos para espectrometria de massa. Podem ser analisados imediatamente ou armazenados a-80 ° C indefinidamente. Este é um potencial ponto de parar.

8. Nano de cromatografia líquida, espectrometria de massa e processamento de dados Raw

Nota: porque 4SU-reticulação altera a massa do peptide, seus íons não contam para a intensidade do peptide não-quitosana durante o LC-MS/MS, que, portanto, parece ser diminuiu a reticulação. O grau e a consistência desta diminuição reflecte o grau de reticulação de RNA-proteína para cada peptídeo 24.

  1. HPLC preparar amortecedores da seguinte forma: 0,1% de ácido fórmico em água de qualidade para HPLC (tampão A); 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila grau CLAE (Buffer B).
  2. Se um nano-HPLC estiver disponível, conecte uma nano-coluna com as seguintes especificações: diâmetro interno 75 µm; embalado com partículas C18-AQ; comprimento 20-25 cm.
    Nota: Se o HPLC disponível é executado em taxas de fluxo maiores utilize um tamanho de coluna adequada para a taxa de fluxo indicado. Cromatografia de fluxo maior diminui a sensibilidade.
    3. Programa de
  3. o método HPLC como segue: fluxo taxa de 250-300 nL/min; gradiente de 2 a 28% tampão B em 120 min, de 28 a 80 B para o próximos 5 min e isocrática 80% B durante 10 min.
    Nota: Se não tiver um carregamento de amostra prévia de equilibração coluna automatizado, a HPLC iniciar o programa com 10 min a 0% B antes de carregar a amostra.
  4. o método de aquisição de MS para realizar aquisição de dados dependentes (DDA) como experimentos de proteomics espingarda padrão do programa. O ciclo de dever de instrumento deve alternar análises completas de MS com tandem MS scans (ou MS/MS) dos sinais mais intensos. Use as configurações ideais para proteômica MS funciona.
    Nota: Para resultados confiantes, uso de instrumentos que podem executar pelo menos a MS completa varredura em modo de alta resolução (por exemplo, orbitrap, tempo-de-voo). Para quantificação exacta, certifique-se que intervalos entre análises completas de MS não são mais do que 3 ciclos mais s. podem impedir a definição precisa dos cromatogramas de íons extraídos.
  5. 1-2 µ g de amostra para a coluna HPLC de carregar e executar o método de HPLC-MS/MS, conforme programado. Para cada biológico replicar realizar pelo menos duas pistas independentes e tratá-los como técnicas repetições.
  6. Depois de MS, importar os arquivos raw para um pacote de software de proteômica para identificação de espectros de MS/MS e quantificação de peptídeo através de cromatografia iônica extraídos. Recomendamos os pacotes de software que podem executar alinhamento cromatográfico de múltiplas MS é executado (veja a Tabela de materiais) 29 , 30.
  7. Se a opção está disponível na suíte de software, permitem " correspondência entre execuções " antes de iniciar o processamento de dados.
  8. Quando a análise estiver concluída, exportar a lista de peptídeo juntamente com os valores de quantificação.

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Representative Results

A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho RBR-ID. Devido a reticulação relativamente baixa eficiência dessa técnica, é muito importante levar em consideração tanto a nível de esgotamento e a consistência do efeito observado (P -valor) através de réplicas biológicas. A Figura 2 mostra uma trama de vulcão de resultado RBR-ID. Peptídeos que sobrepostas domínio de motivo (RRM) de reconhecimento de RNA mostram nível de esgotamento muito consistente. Domínios RRM podem ser usados como um controle positivo para análise de RBR-ID.

RBR-ID pode ser usado para mapear RBRs em células vivas. Uma pontuação de RBR-ID pode ser calculada para cada peptídeo estimar o potencial de RNA-obrigatórias: Pontuação RBR-ID = - log2(normalizado + 4SU intensidade/normalizado-4SU intensidade) x (log10(P -valor))2. A Figura 3 mostra um heatmap dos escores de RBR-ID projectada sobre a superfície de subunidade spliceosomal U1 - 70 k. A cor vermelha brilhante na proximidade do contato do RNA, como determinado a partir da estrutura de cristal, indica a correcta identificação da interação da proteína-RNA.

Após a identificação do romance RBPs e suas RBRs, é altamente recomendável que sua atividade RNA-obrigatórias ser confirmada por um método independente. Em nosso estudo anterior24, identificamos TET2 como um romance RBP e mapeado a atividade RNA-obrigatórias para uma região C-terminal, como indicado na Figura 4A , traçando o placar RBR-ID ao longo da sequência primária da proteína. Figura 4B mostra que o requisito para este romance RBR pôde ser verificado através da realização de PAR-CLIP26 usando a sequência WT e comparando o sinal para que de um mutante que falta a RBR previsto. Controle adicional e uma explicação mais detalhada desta experiência de validação estão disponíveis em et al 201624.

Figure 1
Figura 1: visão geral de RBR-ID. CES de mouse são tratados com 4SU ou não (1 - 2) e irradiadas com 312 nm UV (3). Os núcleos estão isolados (4) e extratos digeridos com protease e nuclease, produzindo peptídeos tanto quitosana e filmes (5). Ligações covalente RNA adutos no crosslink sites alteram a massa do peptide, levando a uma diminuição correspondente na intensidade do espectro de massa do peptide filmes (6, seta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: todo o Proteome RBR-ID em mESCs. Vulcão parcelas apresentando alterações de log-dobra em intensidades de peptídeo no eixo x e t do estudante-teste P -valores do eixo y de ± 4SU tratamentos (312 nm). Peptídeos sobreposição anotados domínios RRM estão em azul. Um peptídeo de RNA-obrigatórias de HNRNPC é destacado em vermelho. Publicados anteriormente em et al . 201624. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: RBR-ID mapeia os locais das interações da proteína-RNA. Ampliado em regiões da estrutura de cristal do snRNP U1 (PDB ID: 4PJO31) mostrando a proteína superfícies codificados por cores de acordo com sua pontuação RBR-ID e interagindo RNAs para U1 - 70 K. Publicados anteriormente em et al . 201624. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: validação da RBR de TET2. (A) sequência primária e domínios conhecidos para TET2; suavizados Pontuação de RBR-ID de resíduos-nível plotados ao longo da sequência primária (médio); e regime de fragmento epítopo-com a tag domínio catalítico (CD) e construções de RBR-excluídos (CDΔRBR) usadas para validação (parte inferior). (B) PAR-CLIP de transitoriamente expressa TET2 CD e ΔCDΔRBR em células HEK293. Autoradiografia para 32P-etiquetados RNA (topo) e borrão ocidental de controle (parte inferior). Publicados anteriormente em et al . 201624. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Descreveremos um protocolo experimental pormenorizado para executar RBR-ID em mESCs e, com modificações apropriadas, em qualquer célula que pode incorporar 4SU em RNA. Outros tipos de células podem exigir a otimização da abordagem para garantir um suficiente sinal à relação de ruído. Além disso, enquanto o protocolo descrito neste documento concentra-se no exame do RBPs nucleares, a tecnologia de RBR-ID deve ser facilmente adaptada para diferentes compartimentos celulares, como o citoplasma ou organelas específicas, pelo uso de diferente fracionamento estratégias. Parâmetros que podem exigir a otimização incluem 4SU tempo de concentração e incorporação, bem como a energia de reticulação de UV. Esses parâmetros são importantes para garantir a eficiente formação de ligações cruzadas de RNA-proteína e produzir um sinal satisfatório à relação de ruído. Mostramos que a 312 nm UVB luz é muito mais eficiente na reticulação RNAs 4SU-contendo proteínas em comparação com a 365 nm UVA normalmente usado em PAR-CLIP32. Direto de RBR-ID-comparação executada com 312 nm e 365 nm demonstrou que 312 nm UVB resultou na identificação de uma parcela muito maior da conhecida RBPs24.

Outros dois métodos estão disponíveis para realizar a identificação de toda a proteome RBP. Um, chamado RBDmap, é semelhante a RBR-ID, em que ele utiliza reticulação de UV e MS. RBDmap foi usado para identificar RBPs e mapear as suas actividades de RNA-obrigatórias em células de HeLa23. Este método baseia-se na identificação de peptídeos adjacentes aos locais de ligação do RNA e se baseia em dois sequenciais de oligo-dT pull-downs, sugerindo que pode ter uma baixa taxa de falsos positivos do que RBR-ID. No entanto, o pull-downs permitem somente a identificação do RBPs que ligam a polyA + RNA e exigem grandes quantidades de material de entrada, até 10 - 100 vezes mais do que a RBR-ID. RBR-ID pode ser executada com tão pouco quanto 5 µ g de proteína por replicar biológica (~ 2 µ g por replicar técnica), que pode ser recolhida de tão poucos como 250.000 células.

O segundo método, denominado SONAR, baseia-se na mineração de dados de bancos de dados de interação da proteína-proteína grande para detectar proteínas que frequentemente co purificar com RBPs conhecidos e cuja interação com estes RBPs, portanto, pode ser mediada por RNA18. Esta abordagem inteligente é muito poderosa e permite a identificação do RBPs romance sem executar qualquer experimento de laboratório molhado, que bancos de dados adequados estejam disponíveis; no entanto, ele não pode revelar os locais de interação e é, portanto, não alternativos mas complementares para RBR-ID.

Em resumo, nossa técnica de RBR-ID pode identificar romance RBPs e mapear seus RBRs com quantidades de amostra entrada limitada e sem exigir qualquer purificação bioquímica dos complexos proteína-RNA quitosana. A técnica não faz nenhuma suposição sobre o tipo de RNA vinculado as RBPs identificados e, portanto, é possível mapear a actividade de ligação de RNA de proteínas que se ligam ao não-polyadenylated, muitos dos quais são não-codificante, sugerindo que a RBR-ID pode revelar uma técnica útil para estudar o funções reguladoras de RNA não-codificante.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

R.B. foi apoiada pelo programa de estudiosos de Searle, Fundação Smith W.W. (C1404) e a marcha de Dimes Foundation (1-FY-15-344). B.A.G reconhece que o apoio do NIH concede R01GM110174 e NIH R01AI118891, bem como DOD conceder BC123187P1. R.W. '-T. foi apoiada pelo subsídio de formação de NIH T32GM008216.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KnockOut DMEM Fisher Scientific 10829018
Fetal bovine serum, qualified, US origin Fisher Scientific 26140079
L-Glutamine solution 200 mM Sigma G7513
Penicillin-Streptomycin solution Sigma P0781
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) Sigma M7145
2-Mercaptoethanol Sigma M3148
ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) EMD Millipore ESG1106
CHIR99021 Tocris 4423
PD0325901 Sigma PZ0162
Gelatin solution,2% in water Sigma G1393
4-thiouridine Sigma T4509 50 mM stock in water
Spectrolinker XL-1500 Fisher Scientific 11-992-90
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma 78830
IGEPAL CO-630 Sigma 542334 Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent
Iodoacetamide Sigma I6125
Trypsin, sequencing grade Promega V5111
Empore solid phase extraction disk 3M 66883
OLIGO R3 Reversed - Phase Resin Fisher Scientific 1133903
Benzonase Sigma E8263 High purity nuclease
Sonic Dismembrator Model 100 Fisher Scientific discontinued updated with FB505110
HPLC grade acetonitrile Fisher Chemical A955-4
HPLC grade water Fisher Scientific W6 4
TFA Fisher Scientific A11650
Ammonium Bicarbonate Sigma A6141
Acetic Acid Sigma 49199
Formic Acid Sigma F0507
ReproSil-Pur 18-AQ Dr. Maisch GmbH HPLC r13.aq.0003 Packing material for HPLC column
Capillary for nano columns (75 µm) Molex 1068150017
MaxQuant software Max Planck Institute for Biochemistry Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs

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References

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Bioquímica edição 127 interações proteína-RNA domínio de ligação do RNA região de RNA-obrigatórias espectrometria de massa RNAs não-codificante reticulação de UV
Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA
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Warneford-Thomson, R., He, C.,… More

Warneford-Thomson, R., He, C., Sidoli, S., Garcia, B. A., Bonasio, R. Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions. J. Vis. Exp. (127), e56004, doi:10.3791/56004 (2017).

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