Summary
Мы описываем протокол для определения RNA-связывая протеинов и сопоставления их RNA-связывая регионов в живых клеток с помощью УФ опосредованной photocrosslinking и масс-спектрометрии.
Abstract
Некодирующей РНК играют важную роль в нескольких ядерных процессов, включая регулирование экспрессии генов, Структура хроматина и репарации ДНК. В большинстве случаев действий некодирующей РНК при посредничестве белки, функции которого, в свою очередь регулируются эти взаимодействия с некодирующей РНК. В соответствии с этим все большее количество белков, участвующих в ядерной функции были зарегистрированы для связывания РНК и в нескольких случаях были сопоставлены RNA-связывая регионах этих белков, часто через кропотливого, кандидат на основе методов.
Здесь мы приводим подробный протокол для выполнения высокой пропускной способностью, протеома общесистемной объективной идентификации RNA-связывая протеинов и их RNA-связывая регионов. Методология опирается на включение photoreactive уридина аналоговый в клеточной РНК, следуют сшивки УФ опосредованной белка РНК и масс-спектрометрии анализа выявить РНК сшитый пептидов в пределах протеома. Хотя мы описываем порядок мышиных эмбриональных стволовых клеток, протокол должен быть легко адаптирована к различным культивируемых клеток.
Introduction
ППР-ID метод предназначен для выявления роман RNA-связывая протеинов (ОДП) и сопоставить их RNA-связывая регионов (RBRs) с резолюцией пептид уровне для облегчения разработки RNA-связывая мутантов и расследование биологические и биохимические функции взаимодействия протеин РНК.
РНК является уникальной среди биомолекул, как он может выступать в качестве посыльного, перевозящих генетической информации и также сложить в сложных трехмерных структур с биохимические функции больше сродни тем белки1,2. Растущее количество доказательств свидетельствует о том, что некодирующей РНК (ncRNAs) играют важную роль в различных генов регулирования и эпигеномные пути3,4,5 , и, как правило, эти функции регулирования являются посредниками в концерте с белками, которые взаимодействуют непосредственно с данной РНК. Особое значение был недавно определен набор взаимодействующих белков для интенсивно изучали долго ncRNA (lncRNA) Xist, предоставляя ценную информацию о как этот lncRNA является посредником инактивации х в женских клетки6,7 ,8. Примечательно некоторые из этих взаимодействующих Xist белков не содержат любой канонические RNA-связывая доменов9, и поэтому их деятельность РНК привязки не может быть предсказано в silico на основе их первичной последовательности только. Учитывая, что тысячи lncRNAs выражаются в любой заданной ячейки10, это разумно предположить, что многие из них могут действовать через взаимодействие с еще предстоит открыть RNA-связывая протеинов (ОДП). Поэтому экспериментальные стратегии для выявления этих Роман ОДП значительно облегчит задачу рассекает биологической функции ncRNAs.
Предыдущие попытки выявления ОДП эмпирически полагались на поля + РНК отбора в сочетании с масс-спектрометрия (МС)11,12,13,14,15. Хотя эти эксперименты многие белки добавляется в список предполагаемых ОДП, Дизайн они могут только обнаружить белки, привязан к polyadenylated стенограммы. Однако большинство малых РНК и многие lncRNAs не являются polyadenylated. 16 , 17 и их взаимодействия белков было бы вероятно пропустили в этих экспериментах. Недавнее исследование применяется машинного обучения для белок белковых interactome баз данных для идентификации белков, которые совместно очищается с несколькими известными ОДП и показал, что эти периодические ОДП партнеры были более склонны обладают RNA-связывая деятельности18. Однако этот подход основывается на добыче существующих крупных взаимодействия баз данных и может идентифицировать только белки, которые могут быть совместно очищенный в условиях денатурации с известными ОДП, исключая, таким образом, из анализа нерастворимые, встраиваемый мембраны и дефицитных белки.
Определение белка как bona fide ОДП часто автоматически не дают информацию на биологические и биохимические функции взаимодействия протеин РНК. Для решения этой точки, обычно желательно определить белка домен аминокислотных остатков и участвующие во взаимодействии, так что конкретные мутанты могут быть разработаны для тестирования функции связывания РНК в контексте каждого романа ОДП19, 20. предыдущие усилия нашей группы и другие использовали фрагменты рекомбинантных белков и удаления мутантов для определения РНК привязки регионов (RBRs)19,20,,2122; Однако такие подходы являются трудоемкие и несовместимы с высок объём анализы. Совсем недавно исследование описал экспериментальный стратегию для сопоставления RNA-связывая деятельности в духе высокой пропускной способности, с помощью масс-спектрометрии23; Однако этот подход опирался на выбор двойной поля + РНК и таким образом осуществляется те же ограничения, что описанных выше подходов идентификации ОДП.
Мы разработали метод, называется РНК привязки региона идентификации (ППР-ID), который эксплуатирует photocrosslinking белка РНК и количественного масс-спектрометрии для идентификации белков и белка регионов, взаимодействующих с РНК в живых клеток без делать предположение о статусе сплайсингу РНК, таким образом включая ОДП неизбежно поля РНК24. Кроме того этот метод опирается исключительно на сшивки и имеет никаких требований на растворимость белков или доступность и таким образом подходит для сопоставления RNA-связывая мероприятий в рамках мембран (например ядерная оболочка) или отсеки малорастворимых ( например ядерной матрицы). Мы описывают экспериментальные шаги для выполнения ППР-ID для ядер мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs), но с незначительными изменениями этот протокол должен быть подходящим для различных типов клеток, при том условии, что они могут эффективно включать 4СУ от культуры Средний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура и расширение mESCs
Примечание: мышиных эмбриональных стволовых клеток легко культуры и быстро может быть расширена до большого числа необходимых биохимические эксперименты благодаря их быстрое время Велоспорт. Здоровые mESCs дважды каждые 12 ч.
- MESCs Expand на желаемый номер на gelatinized пластин в mESC среде (см. ниже) в инкубатор культуры ткани хранится при 37 ° C, 5% CO 2, и > влажность 95%.
Примечание: Достаточно плиты должно быть подготовлено для биологических реплицирует 3-5 для 4СУ пример + и - 4СУ элемента управления. Один 10-см пластины (т.е. 5-10 миллионов клеток) более чем достаточно для каждого биологического реплицировать. - Средство для mESCs состоит из Дульбекко ' s изменение орел ' s среднего (DMEM) дополнены 15% плода бычьим сывороточным (ФБС), 2 мм L-глютамином, 0.5 x пенициллина/стрептомицина, 1 x несущественные аминокислот, 100 мкм бета меркаптоэтанол, 1000 U / мл145 лейкемия ингибирующего фактор (LIF), 3 мкм CHIR99021, 1 мкм PD0325901.
- Перед пассированый mESCs, подготовить нужное количество пластин 10 cm.
- Добавить 4 мл 0,1% желатина в воде, убедившись, что вся поверхность плиты покрыта; Проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре (RT); удалить раствор желатина.
- Проход клеток, когда они достигают ~ 10 миллионов клеток на пластину, обычно ~ 48 ч после инокуляции.
Примечание: Как mESCs растут в плотные колонии, тарелки никогда не должно быть позволено достичь 100% confluency, как заметил для клеточных линий, которые растут в монослои (например HEK293 или 3T3 клеток). MESC плиты следует пассированной когда желтеет ~ 50% вырожденная и определенно до среднего.- Для отсоединения клетки, мыть тарелки с плотной mESC культур раз в 1 x фосфатный буфер (PBS) с 2 мм ЭДТА, затем добавить 0,05% трипсина, растворенных в среде DMEM и возвращать пластины для инкубатора для 5 мин (37 ° C, 5% CO 2, и > 95% влажности).
- Удалить пластину из инкубатора и Ресуспензируйте клетки с равным объемом DMEM, закупорить вверх и вниз энергично несколько раз.
- Подсчитать ячейки с помощью Горяева и убедитесь, что клетки образуют одну ячейку подвеска (т.е. не кластеры), затем центрифуга ячейку смесь 500 x g 5 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1-2 мл DMEM.
- Инокуляции клетки на плотность 10 000 клеток/см 2 в mESC среде (т.е. ~ 800 000 ячеек на 10 см пластины) с помощью желатина покрытием пластин, подготовленную на этапе 1.3.1.
2. Crosslink белка – взаимодействия РНК в клетках живут
Примечание: РНК белок сшивки при посредничестве фото активируемых ribonucleoside аналоговый 4-thiouridine (4СУ). 4СУ имеет больше максимум поглощения чем эндогенные Нуклеотиды и могут быть включены только в РНК; Поэтому промежуточной длины волны UVB может использоваться для выборочного crosslink РНК, белки 25 , 26. UVB лечения лечение 4СУ клеток приводит к ковалентных сшивки между 4СУ содержащие РНК и аминокислоты, сообщил предпочтение Tyr, ТРП, Met, Лис и Cys 27.
- MESCs Expand на необходимое количество 10 см пластины, как описано в разделе Шаг 1.
Примечание: Достаточно плиты должно быть подготовлено для биологических реплицирует 3-5 для 4СУ пример + и - 4СУ элемента управления. Один 10-см пластины (т.е. 5-10 миллионов клеток) достаточно для каждого биологического реплицировать. - Пластин до confluency, добавить 4СУ непосредственно в среду в конечной концентрации 500 мкм. оставить - 4СУ управления блюда необработанной.
- Пластины shake осторожно, чтобы распространять 4СУ равномерно на протяжении среднего. Вернуть же инкубатор культуры ткани 2 h (37 ° C, 5% CO 2, и > влажность 95%).
- Передача пластин ведро льда и отказаться от среднего.
- Промойте пластины нежно с 5 мл ледяной PBS.
Примечание: Осторожно промыть или клетки может отсоединить. - Добавить 2 мл ледяной PBS и место плит без крышки в сшивателя, оснащена лампы UVB-излучающих (312 Нм). Облучить пластины на параметр энергия 1 Дж/см 2.
Примечание: Очень важно, что пластиковые крышки, удаляются или они могут защитить клетки от УФ-излучения и не допустить сшивки. - Сбора клеток с использованием клеток подъемники и передачи в ледяной PBS в конические трубы. Центрифуга на 2000 x g за 5 мин., 4 ° C.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл ледяной PBS с 2 мм ЭДТА и 0,2 мм phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF).
- Количество клеток с помощью Горяева. Ожидайте 5-10 и 10-20 миллионов клеток от 10 см и 15 см пластины соответственно. Центрифуги
- на 2000 x g за 5 мин., 4 ° с.
Примечание: Гранулированных клетки могут быть немедленно использованы для шага 3, или они могут быть флэш замороженные в жидком азоте и хранятся при температуре-80 ° C на неопределенный срок. Это потенциал, остановочный пункт.
3. Изоляция ядер
Примечание: ядер изолированных удалить цитоплазматических белков и увеличить охват ядерных белков. Этот шаг может быть заменен на другие виды сотовой фракционирование учиться ОДП в различных клеточных отсеках.
- Подготовить ледяной буфера (10 мм трис-HCl pH 7.9, 4 ° C, 1.5 мм MgCl 2, 10 KCl). Используйте по крайней мере 2,5 мл на 10 миллионов клеток (считается в шаге 2.9) для извлечения.
Примечание: Запасы буфера A (например, бутылка 500 мл) могут быть подготовлены заранее и хранить при 4 ° C 6 месяцев.- ,
- До использования, добавить 0,5 мм Дитиотреитол (DTT) и 0,2 мм PMSF на нужное количество ледяной буфера A. (2,5 мл на 10 миллионов клеток)
- Мыть клеток с использованием 2 мл буфера A за 10 миллионов клеток. Спина на 2500 x g 5 мин при 4 ° C.
- Удалить супернатант, добавьте буфер A дополнить с 0,2% неионогенных, не денатурации моющего средства, такие как октиловый phenoxy-polyethoxy этанола 500 мкл (см. Таблицу материалы), за 10 миллионов клеток. Поворот на 5 мин при 4 ° C.
- Центрифуга на 2500 x g за 5 мин.
- Удалить супернатант; гранулы включает нетронутыми ядер лишенный цитоплазмой.
Примечание: Ядра могут быть использованы непосредственно для шага 4 или флэш замороженные в жидком азоте и хранятся при температуре-80 ° C на неопределенный срок. Это потенциал, остановочный пункт.
4. Лизис ядер
Примечание: сшитый ядер лизированы в буфере массового спектрометрирования совместимых выпустить белков и РНК белок комплексов.
- Добавить литического буфера (9 M мочевины, 100 мм трис-HCl pH 8.0, 24 ° C), 200 мкл рабочего раствора на 10 миллионов клеток. Sonicate чтобы наклонить хроматина, используя 1/8 " зонд на 50% амплитуды настройки для 5-10 с
- Спина на 12000 x g 5 мин и собирать 175 мкл супернатант избежать гранулы.
Примечание: 100 мкл будет использоваться для последующих шагов ППР-ID и оставшиеся 75 мкл lysate может храниться при температуре-80 ° C для последующего использования и/или Западный анализ помаркой. - Мера концентрацию белка через assay Брадфорд или аналогичных техника 28. Разбавить концентрацию белка в различных образцах до 1 мг/мл или низкая концентрация образца, используя соответствующее количество буфера lysis.
Примечание: От ядер 10 миллионов mESCs ожидать 100-200 мкг белка.
5. Пищеварение трипсина
Примечание: белки перевариваются сформировать пептиды suitable для анализа снизу вверх масс-спектрометрия (МС).
- Добавить DTT решение ядерной lysate (5 мм окончательный); инкубировать 1 час на RT.
- Добавить iodoacetamide из свежего запасов (14 мм окончательный); Инкубируйте 30 мин в темноте на RT.
- Развести lysate объемом 5 раз 50 мм NH 4 HCO 3
- Добавить трипсина (мкг белка: мкг трипсина = 200:1); инкубации при 37 ° C ночь.
6. Обессоливание пептиды
- подготовить один заказ этап отзыв на сэмпл.
- 6.1.1. Поместите диск твердой фазы извлечения C18 материала в нижней части кончика пипетки 200 мкл.
- Добавьте 50 мкл oligo R3 вспять фазы смолы на вершине C18 диска. Место стадии кончик внутри центрифугирования адаптер и место наконечник с адаптер внутри 1,5 мл отцентрифугировать.
- Добавить 100 µL 100% Ацетонитрил советы для стирки. Центрифуга на 1000 x г за 1 мин для удаления растворителя.
- Equilibrate с 50 мкл 0,1% trifluoroacetic кислоты (ТФК). Центрифуга на 1000 x g за 1 мин
- Добавить 100% муравьиной кислоты в образец Переваримый протеин для снижения pH до 2-3.
Примечание: Это должно требовать ~ 5 мкл на 1 мл пробы разреженных пептид, но рН должны быть взвешенными и более муравьиной кислоты добавили в случае необходимости. - Образец нагрузки на заказные стадии кончик, центрифуги на 1000 x g за 1 мин до все образца проходит через верхушку.
- Мыть связаны пептиды с 50 мкл 0,1% TFA. Центрифуга на 1000 x g за 1 мин
- Элюировать пептиды, добавляя 50 мкл Элюирующий буфер (75% ацетонитриле, 0,025% TFA) стадии кончик и центрифуги на 1000 x g за 1 мин заставить Элюирующий буфер из кончика.
- Сухой образца с помощью вакуумного центрифуги на 150 x g и 1-3 кПа за 1 ч.
Примечание: Сушеные пептиды могут храниться при температуре-80 ° C на неопределенный срок. Это потенциал, остановочный пункт.
7. Удаление высокоструктурированные РНК
Примечание: лечить пептиды с нуклеиназы удалить высокоструктурированные РНК.
- Ресуспензируйте гранулы в 50 мкл 2 x нуклеиназы буфера (100 мм NH 4 HCO 3, 4 мм MgCl 2). Концентрация
- пептид меру, с помощью поглощения в 280 Нм предполагая 1 мг/мл пептидов для A 280 1.
Примечание: Ожидается концентрация составляет 1 мг/мл. - Настроить все образцы до 1 мг/мл или низкие концентрации с использованием 2 x буфер нуклеиназы.
- Подготовка мастер смесь 50 мкл H 2 O + 1 мкл нуклеиназы высокой чистоты (≥ 250 U) (см. Таблицу материалы) на сэмпл.
- 50 мкл пептид образца и добавьте 50 мкл H 2 O + нуклеиназы Мастер микс.
- Инкубировать при 37 ° C за 1 ч. Продолжайте выполнять Массовое спектрометрирование.
Примечание: Пептиды теперь готовы для масс-спектрометрии. Они можно проанализировать сразу или хранить при температуре-80 ° C на неопределенный срок. Это потенциал, остановочный пункт.
8. Nano жидкостная хроматография, масс-спектрометрии и обработки Raw данных
Примечание: потому что 4СУ сшивки изменения массы пептида, их ионы не учитываются интенсивность не сшитый пептид во время LC-MS/MS, которая поэтому появляется снизился на сшивки. Степень и согласованности это сокращение отражает степень сшивки белка РНК для каждого пептид 24.
- Подготовить ВЭЖХ буферов следующим образом: 0,1% муравьиной кислоты в воде ВЭЖХ класс (буфер A); 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле ВЭЖХ класс (буфера B).
- Если нано ВЭЖХ, подключите нано столбца со следующими спецификациями: внутренний диаметр 75 мкм; Упакованные с частицами C18-AQ; длина 20-25 см.
Примечание: Если доступны ВЭЖХ работает на более высокой скорости потока используют размер надлежащего столбца для указанного потока. Выше хроматографии потока уменьшается чувствительность. - Программа метод ВЭЖХ следующим: потока скорость 250-300 нл/мин; градиент от 2 до 28% буфера B 120 мин, от 28 до 80% B для следующих 5 мин и Изократические 80% B на 10 мин
Примечание: Если ВЭЖХ не имеют автоматических столбцов загрузки предварительной выборки уравновешивания, запустите программу с 10 мин на 0% B до загрузки образца. - Программа метод приобретения MS для выполнения данных зависит от приобретения (ДВР) как стандартный ружье протеомики экспериментов. Скважность инструмента должны чередоваться полного сканирования MS с тандем MS сканирования (или МС/МС) из самых интенсивных сигналов. Используйте оптимальные настройки для протеомики MS бежит.
Примечание: Уверен, результаты, использование инструментов, которые могут выполнять по крайней мере полный MS сканирования в режиме высокого разрешения (например, Орбитрэп, время полета). Для точной количественной оценки, убедитесь, что интервалы между полное сканирование MS, больше не чем 3 s. больше циклов может предотвратить точное определение извлеченных ионов хроматограммы. - Загрузить 1-2 мкг образца на столбце ВЭЖХ и запустите метод ВЭЖХ-МС/МС, как запланировано. Для каждого биологического репликации выполнения по крайней мере два независимых работает и относиться к ним как технические реплицирует.
- После MS, импортировать raw файлов в протеомике программный пакет для МС/МС спектры идентификации и количественной оценки пептид через извлеченные ионной хроматографии. Мы рекомендуем пакетов программного обеспечения, которые могут выполнять хроматографического выравнивания нескольких MS бежит (см. Таблицу материалов) 29 , 30.
- Если в пакет программного обеспечения доступен параметр, включите " матч между бежит " перед началом обработки данных.
- После завершения анализа, экспортировать список пептидов вместе с количественной оценки значения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 изображает ППР-идентификатор рабочего процесса. Из-за относительно низкой сшивки эффективность этой методики очень важно рассмотреть уровень истощения и согласованности наблюдаемого эффекта (P -значение) через биологические реплицирует. На рисунке 2 показан вулкан график ППР-идентификатор результата. Пептиды, которые перекрываются РНК признание мотив (РРМ) домена Показать уровень весьма последовательной истощения. РРМ домены может использоваться как позитивный элемент управления для анализа ППР-ID.
ППР-ID может использоваться для сопоставления RBRs в живых клетках. ППР-ID оценка может рассчитываться для каждой пептид оценить потенциал RNA-связывая: Оценка ППР-ID = - вход2(нормализованных + 4СУ интенсивности/нормализуется-4СУ интенсивности) x2(журнал10(P -значение)). Рисунок 3 показывает heatmap ППР-ID баллы, по прогнозам, на поверхности spliceosomal Субблок U1 - 70 k. Ярко-красный цвет в близости контакта РНК, как определено из кристаллической структуры, указывает на правильную идентификацию взаимодействия протеин РНК.
После идентификации романа ОДП и их RBRs настоятельно рекомендуется, что их активность RNA-связывая подтверждаться самостоятельного метода. В наших предыдущих исследования24мы определили TET2 как Роман ОДП и сопоставляется C-терминала региона, действие РНК привязки, как показано на рисунке 4A путем построения ППР-ID Оценка вдоль основной последовательности белка. Рисунок 4B , показывает, что требование для этого романа ППР может быть проверена путем выполнения PAR-клип26 с помощью последовательности WT и сравнивая сигнал, мутант, хватает предсказал ППР. Дополнительные возможности управления и более подробное объяснение этого эксперимента проверки доступны в He et al. 201624.
Рисунок 1: обзор ППР-ID. Мышь-ЭСК лечат 4СУ или нет (1 - 2) и облученном с 312 Нм УФ (3). Ядра являются изолированные (4) и экстрактов переваривается с протеазы и Нуклеаза, уступая высокоструктурированные и uncrosslinked пептидов (5). Ковалентный РНК аддукты в crosslink сайты изменить пептид массы, ведущих к соответствующее снижение интенсивности uncrosslinked пептид массового спектра (6, стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: протеома общесистемной ППР-ID в mESCs. Вулкан участки показ журнала фолд изменения в интенсивности пептид на оси x и студента t-тест P -значения по оси y для лечения 4СУ ± (312 Нм). Пептиды, перекрывающиеся аннотированный РРМ домены находятся в синий. RNA-связывая пептид из HNRNPC будет выделена красным цветом. Ранее опубликована в он et al. 201624. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: ППР-ID карт сайтов взаимодействий протеин РНК. Масштаб в регионах кристаллической структуре U1 snRNP (PDB ID: 4PJO31) показаны белка поверхностей цветом согласно их оценка ППР-ID и взаимодействующих РНК для U1 - 70 K. Ранее опубликована в он et al. 201624. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Проверка RBR TET2. (A) первичной последовательности и известных домены для TET2; сглаженная оценка остаточного уровня ППР-ID построены вдоль первичной последовательности (в центре); и схема epitope тегами каталитического домена фрагмент (CD) и ППР удалены (CDΔRBR) конструкции, используемые для проверки (внизу). (B) PAR-клип временно выраженной TET2 CD и ΔCDΔRBR в HEK293 клетках. Авторадиографии для 32P-меченых РНК (вверху) и управления Вестерн-блот (внизу). Ранее опубликована в он et al. 201624. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описываем подробный экспериментальный протокол для выполнения ППР-ID в mESCs и, с соответствующими изменениями, в любой ячейке, которое может включать 4СУ в РНК. Другие типы клеток может потребоваться оптимизация подхода для обеспечения достаточной соотношение сигнал-шум. Кроме того в то время как протокол описанные здесь сосредоточена на изучении ядерной ОДП, ППР-ID технология должна быть легко адаптированы для различных клеточных отсеков, например цитозоль или конкретных органеллы, путем использования различных фракционирования стратегии. Параметры, которые могут потребовать оптимизации включают время 4СУ концентрации и включения, а также энергии UV сшивки. Эти параметры важны для обеспечения эффективного формирования РНК белок сшивки и дают удовлетворительное соотношение сигнал-шум. Мы показали, что 312 Нм UVB света является гораздо более эффективным в сшивки молекул РНК 4СУ содержащих белков по сравнению с 365 Нм UVA, обычно используется в пар-клип32. Прямое сравнение ППР-ID выступал с 312 Нм и 365 Нм продемонстрировал, что 312 Нм, UVB привело к идентификации гораздо большую часть известных ОДП24.
Две другие методы доступны для выполнения протеома идентификации ОДП. Один, называется RBDmap, похож на ППР-ID в том, что он использует УФ сшивки и г-жа RBDmap была использована для выявления ОДП и сопоставить их деятельности RNA-связывая в клетки HeLa23. Этот метод опирается на положительных идентификация пептидов, прилегающих к RNA-связывая места и опирается на два последовательных oligo-dT тянуть Даунс, предполагая, что он может имеют более низкий уровень ложных положительных чем ППР-ID. Однако тянуть Даунс позволяют только идентификации ОДП, которые связывают поля + РНК и требуют большого количества материала, до 10 - 100 раз больше, чем ППР-ID. ППР-ID могут быть выполнены с всего лишь 5 мкг белка на биологических репликации (~ 2 мкг на технические реплицировать), которые могут быть взяты как 250.000 клеток.
Второй метод, называется SONAR, опирается на интеллектуального анализа данных больших протеин взаимодействия баз данных для определения белков, часто совместно очищают с известными ОДП и чьи взаимодействие с этими ОДП может поэтому быть опосредовано РНК18. Этот умный подход является очень мощной и позволяет для идентификации ОДП, роман без выполнения каких-либо мокрой лаборатории эксперимента, при условии наличия подходящих баз данных; Однако он не может раскрыть взаимодействия сайтов и поэтому дополняет, но не альтернативных RBR-идентификатору
В целом наша техника ППР-ID можно определить Роман ОДП и сопоставить их RBRs с ограниченной образца ввода сумм и без каких-либо биохимической очистки комплексов высокоструктурированные РНК белок. Техника делает никакое предположение о типе РНК, обязательность выявленных ОДП и поэтому можно сопоставить РНК привязки активность белков, которые связывают с не polyadenylated, многие из которых являются некодирующей, предполагая, что ППР-ID может оказаться полезным методом для изучения регулирования роли некодирующей РНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Р.б. была поддержана программа ученых Searle, W.W. Смит фонд (C1404) и марта Dimes фонда (1-FY-15-344). Ягдташ признает поддержку от НИЗ предоставляет R01GM110174 и R01AI118891 низ, а также мо предоставить BC123187P1. Р.У.-Т. была поддержана NIH обучения Грант T32GM008216.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed - Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
References
- Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
- Rinn, J. L., Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).
- Goff, L. A., Rinn, J. L. Linking RNA biology to lncRNAs. Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).
- Holoch, D., Moazed, D. RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression. Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cabili, M. N., et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6, 10127 (2015).
- Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nat Commun. 7, 11212 (2016).
- Wilusz, J. E., et al. A triple helix stabilizes the 3' ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails. Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).
- Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).
- Brannan, K. W., et al. SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes. Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).
- Bonasio, R., et al. Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes. Elife. 3, e02637 (2014).
- Kaneko, S., et al. Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin. Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).
- Kaneko, S., et al. Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA. Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).
- Saldana-Meyer, R., et al. CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53. Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).
- Castello, A., et al. Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells. Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
- He, C., et al. High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells. Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).
- Favre, A., et al. 4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
- Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions. J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition. Elife. 4, (2015).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. J Vis Exp. (41), (2010).
