Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

Published: September 28, 2017 doi: 10.3791/56004

Summary

Se describe un protocolo para identificar proteínas RNA-que atan y mapa de sus regiones de unión de ARN en células vivas usando photocrosslinking mediada por la UV y espectrometría de masas.

Abstract

RNAs noncoding desempeñan papeles importantes en varios procesos nucleares, incluyendo la regulación de la expresión génica, estructura de la cromatina y la reparación del ADN. En la mayoría de los casos, la acción de noncoding RNAs está mediada por proteínas cuyas funciones están reguladas a su vez por estas interacciones con RNAs noncoding. De acuerdo con esto, un número creciente de proteínas involucradas en funciones nucleares se ha divulgado para enlazar RNA y en algunos casos las regiones de unión de ARN de estas proteínas se ha asignado, a menudo a través de métodos laboriosos, basado en el candidato.

Aquí, Divulgamos un protocolo detallado para realizar una alto rendimiento, todo el proteoma identificación imparcial de sus regiones de unión de ARN y proteínas RNA-que atan. La metodología se basa en la incorporación de un análogo en el ARN celular, seguido por reticulación UV-mediado proteína-RNA y los análisis de espectrometría de masas para revelar RNA-reticulado péptidos en el proteoma de uridina fotoreactivos. Aunque Describimos el procedimiento de células madre embrionarias de ratón, el protocolo debe adaptarse fácilmente a una variedad de células cultivadas.

Introduction

El propósito del método RBR-ID es identificar nuevas proteínas de unión a RNA (restrictivas) y mapa de sus regiones de unión a RNA (RBRs) con resolución de péptido-niveles para facilitar el diseño de los mutantes de unión de ARN y la investigación de los biológicos y bioquímicos funciones de las interacciones proteína-RNA.

ARN es único entre biomoléculas como puede actuar como un mensajero lleva la información genética y también doblar en estructuras tridimensionales complejas con funciones bioquímicas más similares a los de las proteínas1,2. Un cuerpo creciente de evidencia sugiere que RNAs noncoding (ncRNAs) desempeñan papeles importantes en varios genes vías reguladoras y epigenéticos3,4,5 y, por lo general, estas funciones reguladoras son mediadas en concierto con proteínas que interaccionan específicamente con un determinado RNA. De particular relevancia un conjunto de proteínas de interacción fue identificado recientemente para el ncRNA largo intensamente estudiado (lncRNA) Xist, proporcionando información valiosa sobre cómo este lncRNA interviene en la inactivación del cromosoma x en las células femeninas6,7 ,8. En particular, varias de estas proteínas interactúan Xist no contienen ningún canónica de dominios RNA-que ata9, y por lo tanto su actividad de unión de ARN no podía ser predicha en silico basado en su secuencia primaria solamente. Teniendo en cuenta que miles de lncRNAs se expresan en cualquier célula dada10, es razonable asumir que muchos de ellos pueden actuar vía interacciones con todo ser descubierto proteínas RNA-que atan (restrictivas). Una estrategia experimental para identificar estas nuevas prácticas comerciales restrictivas, por tanto, facilitaría enormemente la tarea de la función biológica de ncRNAs de disección.

Los intentos anteriores para identificar empíricamente restrictivas han dependido de polyA + RNA selección acoplada a espectrometría de masas (MS)11,12,13,14,15. Aunque estos experimentos muchas proteínas ha añadido a la lista de supuestas prácticas comerciales restrictivas, por diseño podría sólo detectan las proteínas a las transcripciones de la cofia. Sin embargo, más pequeño RNAs y muchos lncRNAs no son contra. 16 , 17 y sus proteínas interactuantes probablemente habría sido perdidas en estos experimentos. Un estudio reciente aplicado aprendizaje automático a las bases de datos del interactoma de proteínas para identificar proteínas que co purificaron con múltiples prácticas comerciales restrictivas conocidas y demostró que estos socios recurrentes de la RBP tenían más probabilidades de poseer actividades de unión de ARN18. Sin embargo, este enfoque se basa en la minería de bases de datos existentes de gran interacción y sólo puede identificar proteínas que pueden ser co purificadas en condiciones no desnaturalizantes con prácticas comerciales restrictivas conocidas, excluyendo así a partir del análisis insoluble, embebido en la membrana y escaseado proteínas.

La identificación de una proteína como un bona fide las prácticas comerciales restrictivas a menudo no producen automáticamente información sobre la función biológica o bioquímica de la interacción proteína-RNA. Para abordar este punto, es típicamente conveniente para identificar las proteína dominio y aminoácido residuos implicados en la interacción que mutantes específicos pueden ser diseñados para probar la función de enlace de RNA en el contexto de cada novela RBP19, 20. los esfuerzos anteriores de nuestro grupo y otros han utilizado fragmentos de la proteína recombinante y mutantes de la canceladura identificar RNA binding regiones (RBRs)19,20,21,22; sin embargo, estos enfoques son intensivas e incompatible con el análisis de alto rendimiento. Más recientemente, un estudio describe una estrategia experimental para actividades de unión de ARN en forma de alto rendimiento usando spectrometry total23; sin embargo, este enfoque se basó en una selección doble polyA + RNA y llevó así a las mismas limitaciones que los enfoques de identificación de las prácticas comerciales restrictivas descritas anteriormente.

Hemos desarrollado una técnica, denominada RNA enlace región identificación RBR-, que explota a proteína-RNA photocrosslinking y cuantitativo espectrometría de masas para identificar las proteínas y las regiones de la proteína interacción con RNA en células vivas sin hacer hipótesis sobre el estado de poliadenilación del RNA, así como prácticas comerciales restrictivas obligado a polyA-RNAs24. Además, este método se basa exclusivamente en la reticulación tiene ninguÌ n requisito en la solubilidad de la proteína o accesibilidad y es así conveniente para las actividades de unión de ARN dentro de las membranas (por ejemplo, la envoltura nuclear) o compartimentos poco solubles ( por ejemplo, la matriz nuclear). Describimos los pasos experimentales para realizar identificación de RBR para los núcleos de células madre embrionarias de ratón (troncales) pero con pequeñas modificaciones este protocolo debe ser conveniente para una variedad de tipos celulares, que pueden incorporar eficientemente 4SU de la cultura medio.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cultura y ampliación de troncales

Nota: las células madre embrionarias del ratón son fáciles de cultura y puede ampliarse rápidamente a los números grandes requeridos experimentos bioquímicos gracias a su rápido tiempo de ciclismo. Troncales saludables doble cada 12 h.

  1. Expandir troncales para el número deseado de placas gelatinizadas en mESC medio (véase abajo) en una incubadora de cultivo de tejidos se mantiene a 37 ° C, 5% CO 2, y > humedad de 95%.
    Nota: Suficiente placas deberían estar preparadas para 3-5 repeticiones biológicas para la + 4SU muestra y control - 4SU. Una placa de 10 cm (es decir, 5 millones de células) es más que suficiente para cada repetición biológica.
  2. El medio para troncales se compone de Dulbecco ' s modificado Eagle ' medio s (DMEM) suplementado con 15% suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 0,5 x 1 x no esenciales aminoácidos, penicilina/estreptomicina, 100 μm beta-mercaptoetanol, 1.000 U / ml factor inhibidor de leucemia (LIF), μm 3 CHIR99021, 1 μm PD0325901.
  3. Antes pases troncales, prepare el número de placas de 10 cm.
    1. Añadir 4 mL de 0.1% de gelatina en agua, asegurándose de que se cubre toda la superficie de la placa; incubar 10 min a temperatura ambiente (RT); retirar gelatina solución.
  4. Células de paso al llegar a 10 millones de células por placa, típicamente ~ 48 h después de la inoculación.
    Nota: Como troncales crecen en colonias densas, las placas nunca debe llegar a confluencia 100% como observado en líneas celulares que crecen en monocapas (e.g. HEK293 o las células 3T3). Una placa mESC debe ser pasada al ~ 50% confluente y definitivamente antes del medio se vuelve amarillo.
    1. Para separar las células, lavar las placas con cultivos densos mESC una vez en el 1 x de tampón fosfato salino (PBS) suplementada con 2 mM EDTA, añada 0.05% tripsina disuelto en DMEM y devolver plancha a incubadora durante 5 minutos (37 ° C, 5% CO 2, y > 95% humedad).
    2. Extraiga la placa de la incubadora y resuspender las células con un volumen igual de DMEM mediante pipeteo arriba y abajo con fuerza varias veces.
    3. Contar las células mediante hemocitómetro y asegurarse de que las células forman una suspensión unicelular (es decir, no hay racimos), luego centrifugar células mezcla 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 1-2 mL DMEM.
    4. Inocular células a una densidad de 10.000 células/cm 2 en medio de la mESC (es decir, ~ 800.000 células por placa de 10 cm) mediante las placas recubiertas de gelatina preparadas en el paso 1.3.1.

2. La reticulación de proteínas – interacciones ARN en las células en vivo

Nota: ARN-proteína reticulación está mediada por la foto-activatable ribonucleósido análogo 4-thiouridine (4SU). 4SU tiene un largo máximo de absorbancia que endógeno nucleótidos y sólo puede ser incorporado en el RNA; por lo tanto UVB de longitud de onda intermedia permite selectivamente reticulación RNA a las proteínas 25 , 26. Tratamiento UVB de células tratadas con 4SU conduce a reticulaciones covalentes entre 4SU que contiene ARN y aminoácidos, con una preferencia divulgada por Tyr, Trp, Lys, Met y Cys 27.

  1. Troncales de expandir al número requerido de placas de 10 cm como se describe en el paso 1.
    Nota: Suficiente placas deberían estar preparadas para 3-5 repeticiones biológicas para la + 4SU muestra y control - 4SU. Una placa de 10 cm (es decir, 5 millones de células) es suficiente para cada repetición biológica.
  2. Antes de que las placas alcanzan confluencia, añadir 4SU directamente en medio a una concentración final de 500 μm. deja - 4SU platos de control sin tratamiento.
  3. Placas de agitar suavemente para distribuir el 4SU homogéneo en todo el medio. Volver a la misma incubadora de cultivo de tejidos para 2 h (37 ° C, 5% CO 2, y > 95% de humedad).
  4. Transferencia de placas a un cubo de hielo y deseche el medio.
  5. Lavar la placa con 5 mL de PBS helado.
    Nota: Enjuague suavemente o podrían separar células.
  6. Añadir 2 mL de helado placas PBS y lugar sin las tapas en un crosslinker equipado con lámparas de emisión de UVB (312 nm). Irradian las placas en una configuración de energía de 1 J/cm 2.
    Nota: Es crítico que se quitan las tapas plásticas o podrían proteger las células de la luz UV y evitar la reticulación.
  7. Recoger las células mediante elevadores celular y traslado a PBS helado en tubos cónicos. Centrifugar a 2.000 x g durante 5 min, 4 ° C.
  8. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 5 mL PBS helada con 2 mM EDTA y 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF).
  9. Cuenta las células usando un hemocitómetro. Esperar 5-10 y 10 millones de células de las placas de 10 cm y 15 cm respectivamente.
  10. Centrifugar a 2.000 x g durante 5 min, 4 ° C.
    Nota: Concentrados de células pueden utilizarse inmediatamente para el paso 3 o pueden ser flash-congeladas en nitrógeno líquido y almacenados a-80 ° C indefinidamente. Este es un potencial punto de parada.

3. Aislamiento de núcleos

Nota: los núcleos son aislados para eliminar proteínas citoplasmáticas y aumentar la cobertura de las proteínas nucleares. Este paso puede ser reemplazado con otras formas de fraccionamiento celular para el estudio de prácticas comerciales restrictivas en compartimentos celulares diferentes.

  1. Preparar helado Buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.9, de 4 ° C, 1,5 mM de MgCl 2, 10 m m KCl). Use por lo menos 2,5 mL por 10 millones de células (como cuentan en el paso 2.9) para la extracción de.
    Nota: Existencias de búfer A (por ejemplo, una botella de 500 mL) se pueden preparar con antelación y almacenar a 4 ° C por 6 meses.
    1. Antes de usar Añadir 0,5 mM Ditiotreitol (DTT) y 0,2 mM PMSF para la cantidad deseada (2,5 mL por 10 millones de células) de búfer helada A.
  2. Lavar las células con 2 mL de Buffer A por 10 millones de células. Vuelta a 2.500 x g durante 5 min a 4 ° C.
  3. Descartar sobrenadante, agregar Buffer suplementado con 0.2% de un detergente no iónico, no desnaturalizantes, como el octil-fenoxi-polyethoxy-etanol A 500 μl (ver la Tabla de materiales), por 10 millones de células. Gira por 5 min a 4 ° C.
  4. Centrifugar a 2.500 x g durante 5 min.
  5. Eliminar el sobrenadante, el sedimento compone de núcleos intactos sin citoplasma.
    Nota: Los núcleos pueden utilizar inmediatamente para el paso 4 o flash-congeladas en nitrógeno líquido y almacenados a-80 ° C indefinidamente. Este es un potencial punto de parada.

4. Lisis de núcleos

Nota: reticulado núcleos son lisis en un búfer de espectrometría de masa-compatible para liberar las proteínas y complejos ARN-proteína.

  1. Añadir el tampón de lisis (9 M de urea, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, de 24 ° C), 200 μL por 10 millones de células. Someter a ultrasonidos para distorsionar la cromatina con un 1/8 " sonda en ajuste de amplitud del 50% para el 5-10 s.
  2. Vuelta a 12.000 x g durante 5 minutos y cobrar 175 μl de sobrenadante para evitar que los pellets de.
    Nota: 100 μl se utilizará para los próximos pasos de RBR-ID y el restante 75 μl de lisado puede ser almacenado a-80 ° C para uso posterior o mancha blanca /negra occidental análisis.
  3. Concentración de la proteína medida mediante el ensayo de Bradford o similar técnica 28. Diluir la concentración de proteína en las diferentes muestras a 1 mg/mL o la concentración más baja de la muestra utilizando cantidades adecuadas de tampón de lisis.
    Nota: De los núcleos de troncales 10 millones cuentan con 100-200 μg de proteína.

5. Digestión de tripsina

Nota: las proteínas son digeridas para generar péptidos suitable para el análisis de abajo a arriba, espectrometría de masas (MS).

  1. TDT añadir solución nuclear lisado (5 mm final); incubar durante 1 h a TA.
  2. Añadir Yodoacetamida de acción fresca (14 mM final); incubar por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
  3. Diluir lisado con volumen 5 veces de 50 mM NH 4 HCO 3
  4. Añadir tripsina (μg proteína: μg tripsina = 200:1); incubar a 37 ° C durante la noche.

6. La desalación de péptidos

  1. preparar una punta de etapa por encargo por ejemplo.
    1. 6.1.1. Coloque un disco de material de extracción C18 de fase sólida en la parte inferior de una pipeta de 200 μl.
    2. Añadir 50 μl de oligo R3 invertida resina de fase en la parte superior del disco de C18. Coloque la punta del escenario en centrifugación adaptador y la punta del lugar con el adaptador dentro de un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    3. Agregar 100 μl 100% acetonitrilo en consejos para lavar. Centrifugar a 1000 x g durante 1 min eliminar el disolvente.
    4. Equilibrar con 50 μl 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA). Centrifugar a 1000 x g durante 1 minuto
  2. Agregar 100% de ácido fórmico a la muestra digerida la proteína para disminuir el pH a 2-3.
    Nota: Esto debe requerir ~ 5 μL 1 mL de muestra diluida péptido, pero pH deberá ser medido y más fórmico ácido añadido si es necesario.
  3. Muestra de la carga en punta de etapa por encargo, centrifugar a 1000 x g durante 1 minuto hasta que todos de la muestra pasa a través de la punta.
  4. Lavado obligado péptidos con 50 μl 0.1% TFA. Centrifugar a 1000 x g durante 1 minuto
  5. Eluir péptidos mediante la adición de 50 μl de tampón de elución (75% acetonitrilo, 0.025% TFA) a punta del escenario y centrifugar a 1000 x g durante 1 min forzar el buffer de elución de la punta.
  6. Seco de la muestra utilizando una centrífuga de vacío a 150 x g y 1-3 kPa para 1 h.
    Nota: Péptidos secas pueden almacenarse a-80 ° C indefinidamente. Este es un potencial punto de parada.

7. Extracción de ARN de reticulado

Nota: tratar de péptidos con nucleasa para eliminar RNA reticulado.

  1. Resuspender el precipitado en 50 μl de 2 x de buffer de nucleasa (100 mM NH 4 HCO 3, 4 mM de MgCl 2).
  2. Péptido medida concentración usando la absorbancia a 280 nm suponiendo que 1 mg/mL de péptidos para una A 280 de 1.
    Nota: La concentración esperada es 1 mg/mL.
  3. Ajustar todas las muestras a 1 mg/mL y la concentración más baja con 2 x de buffer de nucleasa.
  4. Preparar una mezcla maestra de 50 μl de H 2 O + nucleasa de alta pureza de 1 μl (≥ 250 U) (consulte la Tabla de materiales) por ejemplo.
  5. 50 μl de muestra del péptido y añadir 50 μl de H 2 O + nucleasa master mix.
  6. Incubar a 37 ° C por 1 h. proceda realizar espectrometría de masas.
    Nota: Los péptidos están ahora listos para espectrometría de masas. Pueden ser analizadas inmediatamente o almacenadas a-80 ° C indefinidamente. Este es un potencial punto de parada.

8. Nano de la cromatografía líquida espectrometría de masas y procesamiento de datos crudos

Nota: porque 4SU-reticulación cambia la masa del péptido, sus iones no cuentan para la intensidad del péptido no reticulado en LC-MS/MS, por lo tanto, que parece ser disminuido por el entrecruzamiento. El grado y la consistencia de esta disminución refleja el grado de reticulación de proteínas-RNA para cada péptido 24.

  1. HPLC preparar buffers como sigue: 0,1% de ácido fórmico en agua grado HPLC (tampón A), el ácido fórmico 0,1% en acetonitrilo grado HPLC (tampón B).
  2. Si un nano-HPLC está disponible, conecte una nano-columna con las siguientes especificaciones: diámetro interno 75 μm; lleno de partículas de C18-AQ; longitud 20-25 cm.
    Nota: Si ejecuta el HPLC disponible a tasas de flujo más altas use un tamaño de columna adecuado para el caudal indicado. Cromatografía de flujo más alta disminuye sensibilidad.
  3. Programar el método HPLC como sigue: tarifa 250-300 nL/min de flujo, gradiente de 2 a 28% de tampón B en 120 min, del 28 al 80% B para los próximos 5 minutos e isocrática 80% B durante 10 minutos
    Nota: Si el HPLC no tiene una columna automatizado equilibrado muestra previa de carga, inicie el programa con 10 min a 0% B antes de cargar la muestra.
  4. Programar el método de adquisición de MS para realizar adquisición de datos dependientes (DDA) como experimentos de proteomics de la escopeta estándar. El ciclo de trabajo del instrumento debe alternar exploraciones de MS completas con tandem MS exploraciones (o MS/MS) de las señales más intensas. Utilice la configuración óptima para proteómica MS funciona.
    Nota: Para obtener resultados seguros, instrumentos de uso que pueden realizar por lo menos el MS completo de barrido en modo de alta resolución (e.g. orbitrap, tiempo de vuelo). Para la cuantificación precisa, asegúrese de que intervalos entre búsquedas completas de MS ya no son de 3 ciclos de trabajo más s. podrían impedir la definición exacta de los cromatogramas de iones extraídos.
  5. 1-2 μg de muestra en la columna HPLC y ejecutar el método de HPLC-MS/MS como programado. Para cada repetición biológica realizar al menos dos carreras independientes y tratarlos como técnicos repeticiones.
  6. Después de MS, importar los archivos sin procesar en un paquete de software de proteómica para la identificación de espectros MS/MS y péptido cuantificación mediante cromatografía de iones extraídos. Recomendamos los paquetes de software que pueden realizar la alineación cromatográfica de múltiples MS funciona (véase la Tabla de materiales) 29 , 30.
  7. Si la opción está disponible en el paquete de software, habilitar " partido entre carreras " antes de comenzar el procesamiento de datos.
  8. Una vez finalizado el análisis, exportar la lista de péptidos junto con los valores de cuantificación.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La figura 1 muestra el flujo de trabajo de RBR-ID. Debido a la reticulación relativamente baja eficiencia de esta técnica, es muy importante a tener en cuenta el nivel de agotamiento y la consistencia del efecto observado (P -valor) a través de réplicas biológicas. La figura 2 muestra una parcela de volcán de resultado RBR-ID. Péptidos que traslapó dominio de adorno (RRM) de reconocimiento de RNA Mostrar nivel de agotamiento muy constantes. Dominios RRM pueden utilizarse como control positivo para el análisis de la RBR-ID.

RBR-ID puede utilizarse para asignar RBRs en células vivas. Una puntuación de RBR-ID puede ser calculada para que cada péptido estimar el potencial de unión de ARN: puntuación de RBR-ID = - log2(normalizada + 4SU intensidad/normalizado-4SU intensidad) x (log10(P -valor))2. La figura 3 muestra un mapa de calor de RBR-ID cuentas proyectada sobre la superficie de la subunidad de spliceosomal U1 - 70 k. El color rojo brillante en las proximidades del contacto del RNA, determinado a partir de la estructura cristalina, indica la correcta identificación de la interacción proteína-RNA.

Identificación de novela restrictivas y sus RBRs, se recomienda que su actividad de unión de ARN confirmarse por un método independiente. En nuestro anterior estudio24, se identificaron TET2 como una novela las prácticas comerciales restrictivas y asigna la actividad RNA-que ata a una región terminal C, como se muestra en la Figura 4A trazando la puntuación de RBR-ID a lo largo de la secuencia primaria de la proteína. Figura 4B se muestra que el requisito para esta novela RBR podría verificarse realizando PAR-CLIP26 utilizando la secuencia de la WT y la comparación de la señal a la de un mutante que carece de la EE predijo. Control adicional y más detallada explicación de este experimento de validación están disponibles en et al. 201624.

Figure 1
Figura 1: Resumen de RBR-ID. CES de ratón son tratados con 4SU o no (1 - 2) y se irradiaron con 312 nm UV (3). Los núcleos son aislados (4) y extractos de digestión con proteasas y nucleasas, produciendo péptidos reticulado y todo (5). Aductos covalente RNA en la reticulación sitios alteran la masa del péptido, llevando a una correspondiente disminución de intensidad del espectro de masas de péptidos de todo (flecha 6). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: todo el proteoma RBR-ID en troncales. Volcán parcelas mostrando doble registro cambios en intensidades de péptido en el eje de x y de Student t-test P -valores en el eje y para tratamientos de 4SU ± (312 nm). Superposición de dominios RRM anotados de péptidos son en azul. Un péptido de unión de ARN de HNRNPC está resaltado en rojo. Publicado previamente en et al. 201624. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: identificación de RBR mapas de los sitios de las interacciones proteína-RNA. Zoom en regiones de la estructura cristalina de RNPnp U1 (PDB ID: 4PJO31) mostrando la proteína superficies codificados por colores de acuerdo a su puntuación de RBR-ID e interactuar RNAs para U1 - 70 K. Publicado previamente en et al. 201624. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: validación de la EE de TET2. Secuencia principal (A) y los dominios conocidos para TET2; alisado puntuación de RBR-identificación del nivel de residuo traza a lo largo de la secuencia primaria (medio); y el esquema de dominio catalítico del epítopo tagged fragmento (CD) y construcciones RBR-suprimido (CDΔRBR) utilizadas para la validación (abajo). (B) PAR-CLIP de transitorio expresa TET2 CD y ΔCDΔRBR en las células HEK293. Autorradiografía de 32P etiquetados RNA (arriba) y control mancha blanca /negra occidental (parte inferior). Publicado previamente en et al. 201624. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Se describe un protocolo experimental detallado para realizar la identificación de RBR en troncales y, con modificaciones apropiadas, en cualquier célula que puede incorporar 4SU RNA. Otros tipos de células pueden requerir optimización del enfoque para asegurar una suficiente relación señal a ruido. Además, mientras que el protocolo descrito aquí se centra en el examen de prácticas comerciales restrictivas nucleares, la tecnología de RBR-ID debe ser fácilmente adaptable a diferentes compartimentos celulares, como el citosol u orgánulos específicos, por medio de diferentes fraccionamiento estrategias. Los parámetros que requieran optimización incluyen 4SU concentración e incorporación así como la energía de la reticulación UV. Estos parámetros son importantes para garantizar la eficiente formación de reticulaciones de RNA-proteína y rendimiento de una satisfactoria relación señal a ruido. Hemos demostrado que 312 nm UVB luz es mucho más eficiente en la reticulación 4SU contiene ARN a las proteínas en comparación con los 365 nm UVA típicamente usada en PAR-CLIP32. Directa comparación de RBR-ID realizó con 312 nm y 365 nm demostró que 312 nm UVB dio lugar a la identificación de una porción mucho más grande de prácticas comerciales restrictivas conocidas24.

Otros dos métodos están disponibles para realizar la identificación de las prácticas comerciales restrictivas de todo el proteoma. Uno, llamado RBDmap, es similar a RBR-ID que utiliza reticulación UV y MS. RBDmap se utilizó para identificar prácticas comerciales restrictivas y mapa de sus actividades de unión de ARN en células de HeLa23. Este método se basa en la identificación de péptidos adyacentes a los sitios de unión de ARN y se basa en dos oligo-dT secuencial desplegables, lo que sugiere que podría tener un menor índice de falsos positivos que RBR-ID. Sin embargo, los desplegables permiten sólo la identificación de prácticas comerciales restrictivas que se unen a polyA + RNA y requieren grandes cantidades de material de entrada, hasta 10 - 100 veces más que RBR-ID. RBR-ID se puede realizar con tan poco como 5 μg de proteína por repetición biológica (~ 2 μg por repetición técnica), que se puede recoger en tan sólo 250.000 células.

El segundo método, llamado SONAR, se basa en la minería de datos de bases de datos de interacción proteína-proteína grande para detectar proteínas que purificar con frecuencia conjuntamente con prácticas comerciales restrictivas conocidas y cuya interacción con las prácticas comerciales restrictivas, por lo tanto podría estar mediado por RNA18. Este enfoque inteligente es muy potente y permite la identificación de prácticas comerciales restrictivas novela sin realizar ningún experimento de laboratorio húmedo, siempre que las bases de datos adecuadas están disponibles; sin embargo, no puede revelar los sitios de interacción y por lo tanto es complementaria pero no alternativa a RBR-ID.

En Resumen, nuestra técnica de RBR-ID puede identificar nuevas prácticas comerciales restrictivas y asignar sus RBRs con cantidades de muestra de entrada limitada y sin requerir ningún tipo de purificación bioquímica de los complejos de proteína-RNA reticulado. La técnica no hace ninguna asunción sobre el tipo de ARN por las prácticas comerciales restrictivas identificados y por lo tanto, puede asignar la actividad RNA de proteínas que se unen a no cofia, muchas de las cuales están cubiertas, lo que sugiere que RBR-ID puede ser una técnica útil para estudiar la funciones reguladoras de noncoding RNAs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

R.B. fue apoyado por el programa de eruditos de Searle, la Fundación de Smith W.W. (C1404) y la March of Dimes Foundation (1-FY-15-344). B.A.G reconoce apoyo de NIH concede R01GM110174 y R01AI118891 de NIH, así como DOD conceder BC123187P1. R.W.-T. fue apoyado por la beca de formación de NIH T32GM008216.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KnockOut DMEM Fisher Scientific 10829018
Fetal bovine serum, qualified, US origin Fisher Scientific 26140079
L-Glutamine solution 200 mM Sigma G7513
Penicillin-Streptomycin solution Sigma P0781
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) Sigma M7145
2-Mercaptoethanol Sigma M3148
ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) EMD Millipore ESG1106
CHIR99021 Tocris 4423
PD0325901 Sigma PZ0162
Gelatin solution,2% in water Sigma G1393
4-thiouridine Sigma T4509 50 mM stock in water
Spectrolinker XL-1500 Fisher Scientific 11-992-90
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma 78830
IGEPAL CO-630 Sigma 542334 Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent
Iodoacetamide Sigma I6125
Trypsin, sequencing grade Promega V5111
Empore solid phase extraction disk 3M 66883
OLIGO R3 Reversed - Phase Resin Fisher Scientific 1133903
Benzonase Sigma E8263 High purity nuclease
Sonic Dismembrator Model 100 Fisher Scientific discontinued updated with FB505110
HPLC grade acetonitrile Fisher Chemical A955-4
HPLC grade water Fisher Scientific W6 4
TFA Fisher Scientific A11650
Ammonium Bicarbonate Sigma A6141
Acetic Acid Sigma 49199
Formic Acid Sigma F0507
ReproSil-Pur 18-AQ Dr. Maisch GmbH HPLC r13.aq.0003 Packing material for HPLC column
Capillary for nano columns (75 µm) Molex 1068150017
MaxQuant software Max Planck Institute for Biochemistry Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
  2. Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
  3. Rinn, J. L., Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).
  4. Goff, L. A., Rinn, J. L. Linking RNA biology to lncRNAs. Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).
  5. Holoch, D., Moazed, D. RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression. Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).
  6. Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  7. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
  8. Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
  9. Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
  10. Cabili, M. N., et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).
  11. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  12. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  13. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
  14. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6, 10127 (2015).
  15. Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nat Commun. 7, 11212 (2016).
  16. Wilusz, J. E., et al. A triple helix stabilizes the 3' ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails. Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).
  17. Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).
  18. Brannan, K. W., et al. SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes. Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).
  19. Bonasio, R., et al. Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes. Elife. 3, e02637 (2014).
  20. Kaneko, S., et al. Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin. Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).
  21. Kaneko, S., et al. Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA. Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).
  22. Saldana-Meyer, R., et al. CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53. Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).
  23. Castello, A., et al. Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells. Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
  24. He, C., et al. High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells. Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).
  25. Favre, A., et al. 4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).
  26. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
  27. Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions. J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).
  28. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  29. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  30. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  31. Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition. Elife. 4, (2015).
  32. Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. J Vis Exp. (41), (2010).

Tags

Bioquímica número 127 las interacciones proteína-RNA dominio de unión a RNA región de unión de ARN espectrometría de masas RNAs noncoding reticulación UV
Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warneford-Thomson, R., He, C.,More

Warneford-Thomson, R., He, C., Sidoli, S., Garcia, B. A., Bonasio, R. Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions. J. Vis. Exp. (127), e56004, doi:10.3791/56004 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter