Summary
Vi beskriver ett protokoll för att identifiera RNA-bindande proteiner och kartlägga deras RNA-bindande regioner i levande celler med hjälp av UV-medierad photocrosslinking och masspektrometri.
Abstract
Icke-kodande RNAs spelar viktiga roller i flera nukleära processer, inklusive reglerar genuttryck, kromatinstruktur och DNA-reparation. I de flesta fall medieras av icke-kodande RNAs av proteiner vars funktioner regleras i sin tur av dessa interaktioner med icke-kodande RNAs. Konsekvent med detta, ett växande antal proteiner involverade i nukleära funktioner har rapporterats att binda RNA och i några fall Regionkommittén RNA-bindande av dessa proteiner har kartlagts, ofta genom mödosamma, candidate-baserade metoder.
Vi rapporterar här, ett detaljerat protokoll för att utföra en hög genomströmning, proteomet-wide objektiv identifiering av RNA-bindande proteiner och RNA-bindande regionerna. Metodiken bygger på införlivandet av en fotoreaktiv uridin analog i den cellulära RNA, följt av UV-medierad protein-RNA crosslinking och masspektrometri analyser för att avslöja RNA-tvärbunden peptider inom proteomet. Även om vi beskriva förfarandet för mus embryonala stamceller, bör protokollet anpassas enkelt till en mängd odlade celler.
Introduction
Syftet med metoden RBR-ID är att identifiera nya RNA-bindande proteiner (RBPs) och kartlägga deras RNA-bindande regioner (RBRs) med peptid-nivå upplösning att underlätta utformningen av RNA-bindande mutanter och utredningen av biologiskt och biokemiska funktioner av protein-RNA interaktioner.
RNA är unik bland biomolekyler kan både fungera som en budbärare som transporterar genetisk information och också vika in komplexa tredimensionella strukturer med biokemiska funktioner mer besläktad med de av proteiner1,2. En växande mängd bevis tyder på att icke-kodande RNAs (ncRNAs) spelar viktiga roller i olika gen reglerings- och epigenetiska vägar3,4,5 , och vanligtvis dessa reglerande funktioner medieras i konsert med proteiner som samverkar med en given RNA. Av särskild betydelse identifierades en uppsättning samverkande proteiner nyligen för den intensivt studerade lång ncRNA (lncRNA) Xist, som ger värdefull insikt i hur denna lncRNA förmedlar x-kromosom inaktivering i kvinnliga celler6,7 ,8. Särskilt, flera av dessa Xist-interagera proteiner innehåller inte någon kanoniska RNA-bindande domäner9, och därför deras RNA-bindande aktivitet kunde inte förutspått i silico baserat på deras primära sekvens ensam. Med tanke på att tusentals lncRNAs uttrycks i någon viss cell10, är det rimligt att anta att många av dem kan agera via interaktioner med ännu inte upptäckt RNA-bindande proteiner (RBPs). En experimentell strategi för att identifiera dessa roman RBPs skulle därför underlätta uppgiften att dissekera den biologiska funktionen av ncRNAs.
Tidigare försök att identifiera RBPs empiriskt har förlitat sig på polyA + RNA urval kopplad till masspektrometri (MS)11,12,13,14,15. Även om dessa experiment lagt många proteiner till listan över förmodade RBPs, genom design kunde de endast identifiera proteiner bunden till polyadenylated avskrifter. De flesta små RNAs och många lncRNAs är dock inte polyadenylated. 16 , 17 och deras samverkande proteiner skulle sannolikt ha missats i dessa experiment. En nyligen genomförd studie tillämpas maskininlärning protein-protein interactome databaserna att identifiera proteiner som tillsammans renas med flera kända RBPs och visade att dessa återkommande RBP partner var mer benägna att inneha RNA-bindande aktiviteter18. Dock detta tillvägagångssätt bygger på gruvdrift befintliga stora interaktion databaser och kan endast identifiera proteiner som kan vara co renat i icke-denatureringen förhållanden med kända RBPs, vilket utesluter från analysen olösliga, membran-embedded och knappa proteiner.
Identifiering av ett protein som en bona fide RBP ofta ger inte automatiskt information om den biologiska och/eller biokemiska funktionen av protein-RNA interaktionen. För att lösa denna punkt, är det vanligtvis önskvärt att identifiera protein domän och aminosyra rester inblandad i interaktionen så att specifika mutanter kan utformas för att testa funktionen av RNA-bindande i samband med varje roman RBP19, 20. tidigare ansträngningar av våra grupp och andra har använt rekombinant protein fragment och radering mutanter för att identifiera RNA bindande regioner (RBRs)19,20,21,22. sådant tillvägagångssätt är dock arbetsintensiva och oförenligt med hög genomströmning analyser. Mer nyligen, en studie beskrivit en experimentell strategi för att mappa RNA-bindande aktiviteter i en hög genomströmning mode med hjälp av masspektrometri23. dock detta tillvägagångssätt förlitat sig på ett urval på dubbel polyA + RNA, och således bar samma begränsningar som de metoder för identifiering av RBP som beskrivs ovan.
Vi utvecklat en teknik, som kallas RNA bindande region identifiering (RBR-ID), som utnyttjar protein-RNA photocrosslinking och kvantitativa masspektrometri att identifiera proteiner och protein regioner interagerar med RNA i levande celler utan att göra antagandet om RNA polyadenylation status, således även RBPs bunden till polyA-RNAs24. Dessutom denna metod förlitar sig enbart på crosslinking och har inga krav på protein löslighet eller tillgänglighet och är därför lämplig att mappa RNA-bindande aktiviteter inom membran (e.g. kärn kuvertet) eller svårlösliga fack ( t.ex. kärnkraft matrisen). Vi beskriva experimentella stegen för att utföra RBR-ID för atomkärnor av mus embryonala stamceller (mESCs) men med mindre modifieringar detta protokoll bör vara lämplig för en mängd olika celltyper, förutsatt att de kan effektivt införliva 4SU från kultur medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kultur och utbyggnad av mESCs
Obs: mus embryonala stamceller är lätta att kultur och kan snabbt utökas till det stora antal som krävs av biokemiska experiment tack vare sin snabba cykeltiden. Friska mESCs dubbel varje 12 h.
- Expandera mESCs till önskat nummer på gelatinized plattor i mESC medium (se nedan) i en vävnadskultur inkubator hålls vid 37 ° C, 5% CO 2, och > 95% luftfuktighet.
Obs: Tillräckligt plattor bör vara redo för 3-5 biologiska replikat för den + 4SU prov och kontroll - 4SU. En 10-cm platta (dvs. 5-10 miljoner celler) är mer än tillräcklig för varje biologiska replikat. - Medium för mESCs består av Dulbecco ' s modified Eagle ' s medium (DMEM) kompletteras med 15% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 0,5 x penicillin/streptomycin, 1 x icke-essentiella aminosyror, 100 µM beta-merkaptoetanol, 1000 U /mL leukemi hämmande faktor (LIF), 3 µM CHIR99021, 1 µM PD0325901.
- Innan passaging mESCs, förbereda önskat antal 10 cm plattor.
- Lägga till 4 mL 0,1% gelatin i vatten att se att hela ytan av plattan är täckt, inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur (RT), ta bort gelatin lösningen.
- Passage celler när de når ~ 10 miljoner celler per platta, vanligtvis ~ 48 h efter ympning.
Obs: När mESCs växer i täta kolonier, plattor bör aldrig tillåtas att nå 100% konfluens som observerats för cellinjer som växer i enskiktslager (t.ex. HEK293 eller 3T3-celler). En mESC platta bör vara passaged när ~ 50% konfluenta och definitivt innan medlet blir gul.- Att lösgöra celler, tvätta plattorna med tät mESC kulturer en gång i 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kompletteras med 2 mM EDTA, tillsätt sedan 0,05% trypsin upplöst i DMEM och returnera plattan till inkubator för 5 min (37 ° C, 5% CO 2, och > 95% luftfuktighet).
- Ta bort plattan från inkubator och resuspendera cellerna med lika volym DMEM genom pipettering upp och ner kraftigt flera gånger.
- Räkna celler som använder hemocytometer och se till att celler utgör en encellig suspension (dvs inga kluster), sedan Centrifugera cell blandning 500 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1-2 mL DMEM.
- Inokulera cellerna på en densitet på 10 000 celler/cm 2 i mESC medium (dvs ~ 800 000 celler per 10 cm platta) använder gelatin-belagda plattorna bereddes i steg 1.3.1.
2. Crosslink av Protein – RNA interaktioner i levande celler
Obs: RNA-protein crosslinking medieras av den foto-activatable ribonucleoside analoga 4-thiouridine (4SU). 4SU har en längre absorbansen maximal än endogena nukleotider och endast kan införlivas i RNA; intermediate-våglängd UVB kan därför användas för att selektivt crosslink RNA-proteiner 25 , 26. UVB-behandling av 4SU-behandlade celler leder till kovalent antipyridinantikropp mellan 4SU-innehållande RNA och aminosyror, med en rapporterad förkärlek för Tyr, Trp, Met, Lys och Cys 27.
- Expandera mESCs till erforderligt antal 10-cm plattor som beskrivs i steg 1.
Obs: Tillräckligt plattor bör vara redo för 3-5 biologiska replikat för den + 4SU prov och kontroll - 4SU. En 10-cm platta (dvs. 5-10 miljoner celler) är tillräcklig för varje biologiska replikat. - Innan plattorna når konfluens, Lägg till 4SU direkt i medium till en slutkoncentration på 500 µM. lämna - 4SU kontroll rätter obehandlade.
- Shake plattorna försiktigt för att fördela 4SU homogent i hela mediet. Återlämna dem till samma vävnadsodling inkubatorn för 2 h (37 ° C, 5% CO 2, och > 95% luftfuktighet).
- Överföra plattor till en ishink och kassera medium.
- Skölj plattan försiktigt med 5 mL iskallt PBS.
Obs: Skölj försiktigt eller celler kan lossa. - Och tillsätt 2 mL av iskall PBS och plats plattor utan lock i en crosslinker utrustad med UVB avger lökar (312 nm). Bestråla pläterar på en energi inställning 1 J/cm 2.
Obs: Det är viktigt att plast lock avlägsnas eller de kan skydda cellerna från UV-ljus och förhindra tvärbindning. - Samla celler använder cell lyftar och överföra till iskall PBS i koniska rör. Centrifugera vid 2000 x g i 5 min, 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 5 mL iskallt PBS med 2 mM EDTA och 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF).
- Räkna celler som använder en hemocytometer. Räkna 5-10 och 10-20 miljoner celler från 10-cm och 15 cm plattor respektive.
- Centrifugera vid 2000 x g i 5 min, 4 ° C.
Obs: Pelleterat celler kan omedelbart användas för steg 3 eller de kan vara flash-frysta i flytande kväve och lagras vid-80 ° C på obestämd tid. Detta är en potentiell stoppläget.
3. Isolering av atomkärnor
Obs: kärnorna är isolerad för att ta bort cytoplasmatiska proteiner och öka täckningen av nukleära proteiner. Detta steg kan ersättas med andra former av cellulära fraktionering att studera RBPs i olika cellulära fack.
- Förbered iskall buffert (10 mM Tris-HCl pH 7,9, 4 ° C, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl). Använd minst 2,5 mL per 10 miljoner celler (som räknas i steg 2,9) för extraktion.
Obs: Bestånd av buffert A (t.ex. en 500 mL flaska) kan i förväg och lagras vid 4 ° C i 6 månader.- Före användning, tillsätt 0,5 mM Ditiotreitol (DTT) och 0,2 mM PMSF till önskad mängd (2.5 mL per 10 miljoner celler) iskall buffert A.
- Tvätta cellerna med 2 mL buffert A per 10 miljoner celler. Snurra på 2500 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten, lägga till buffert A kompletteras med 0,2% av ett icke-jonaktivt, icke-denatureringen rengöringsmedel, såsom octyl-fenoxi-polyethoxy-etanol (se Tabell för material), 500 µL per 10 miljoner celler. Rotera för 5 min vid 4 ° C.
- Centrifugera vid 2500 x g i 5 min.
- Ta bort supernatanten; pelleten består av intakt atomkärnor saknar cytoplasman.
Obs: Atomkärnor kan användas omedelbart för steg 4 eller flash-frysta i flytande kväve och lagras vid-80 ° C på obestämd tid. Detta är en potentiell stoppläget.
4. Lys av Nuclei
Obs: tvärbundet kärnor är lyserat i en massa spektrometri-kompatibel buffert att släppa proteiner och protein-RNA komplex.
- Lägg till lyseringsbuffert (9 M urea, 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 24 ° C), 200 µL per 10 miljoner celler. Sonikera om du vill skeva kromatin använder en 1/8 " sond på 50% amplitud inställning för 5-10 s.
- Snurra på 12 000 x g i 5 min och samla 175 µL av supernatanten att undvika pelleten.
Obs: 100 µL kommer att användas för nästa RBR-ID steg och de återstående 75 µL av lysate kan lagras vid-80 ° C för senare användning eller western blot analys. - Åtgärd proteinkoncentration via Bradford assay eller liknande teknik 28. Späd proteinkoncentration i olika prover till 1 mg/mL eller den lägsta prov koncentration med hjälp av lämpliga mängder lyseringsbuffert.
Obs: Från kärnor av 10 miljoner mESCs räknar med 100-200 µg protein.
5. Trypsin matsmältningen
Obs: proteiner rötas för att generera peptider slämpliga för nedifrån och upp-masspektrometri (MS) analys.
- Lägg till DTT lösning nukleära lysate (5 mm slutlig), inkubera i 1 h på RT.
- Lägga till iodoacetamide från färska lager (14 mM slutlig), inkubera i 30 min på RT i mörkret.
- Dilute lysate med 5 gånger volym 50 mM NH 4 HCO 3
- Lägg till trypsin (µg protein: µg trypsin = 200:1), inkubera vid 37 ° C över natten.
6. Avsaltning av peptider
- förbereda ett skräddarsydda scenen tips per prov.
- 6.1.1. Placera en skiva av fast fas utvinning C18 material i botten av en 200 µL pipettspetsen.
- Lägga till 50 µL av oligo R3 omvänd fas harts ovanpå C18 disken. Placera scenen spets inuti centrifugering adapter och plats spetsen med adaptern inuti ett 1,5 mL mikrofugrör.
- Tillsätt 100 µL 100% acetonitril till tips för att tvätta. Centrifugera vid 1000 x g i 1 min att ta bort lösningsmedlet.
- Jämvikt med 50 µL 0,1% av trifluorättiksyra (TFA). Centrifugera vid 1000 x g i 1 min.
- Lägga till 100% myrsyra att smälta protein prov att sänka pH-värdet till 2-3.
Obs: Detta bör kräva ~ 5 µL per 1 mL utspädd peptid prov, men pH skall vara uppmätt och mer myrsyra syra som lagt till vid behov. - Belastning prov på skräddarsydda scenen spets, Centrifugera vid 1000 x g för 1 min tills alla prov går genom spetsen.
- Tvätta bunden peptider med 50 µL 0,1% transfettsyror. Centrifugera vid 1000 x g i 1 min.
- Eluera peptider genom att lägga till 50 µL eluering buffert (75% acetonitril, 0.025% TFA) till scenen spets och centrifugera vid 1000 x g i 1 min att tvinga eluering bufferten ur spetsen.
- Torra provet med en vakuum centrifug på 150 x g och 1-3 kPa för 1 h.
Obs: Torkade peptider kan lagras vid-80 ° C på obestämd tid. Detta är en potentiell stoppläget.
7. Borttagning av tvärbunden RNA
Obs: behandla peptider med nuclease ta bort tvärbundna RNA.
- Återsuspendera pelleten i 50 µL 2 x nuclease buffert (100 mM NH 4 HCO 3, 4 mM MgCl 2).
- Åtgärd peptid koncentration med absorbansen vid 280 nm förutsatt att 1 mg/mL av peptider för en A 280 1.
Obs: Den förvänta koncentrationen är 1 mg/mL. - Justera alla prover till 1 mg/mL eller till den lägsta koncentration som använder 2 x nuclease buffert.
- Förbereder en master mix 50 µL H 2 O + 1 µL hög renhet nuclease (≥ 250 U) (se Tabell för material) per prov.
- Ta 50 µL av peptid prov och tillsätt 50 µL av H 2 O + nuclease master mix.
- Inkubera vid 37 ° C under 1 h. Fortsätt att utföra masspektrometri.
Obs: Peptiderna är nu redo för masspektrometri. De kan analyseras omedelbart eller förvaras vid-80 ° C på obestämd tid. Detta är en potentiell stoppläget.
8. Nano vätskekromatografi och masspektrometri Raw Data Processing
Obs: eftersom 4SU-crosslinking ändras massan av peptiden, deras joner inte räknas mot intensiteten i den icke-tvärbunden peptiden under LC-MS/MS, som förefaller därför vara minskade crosslinking. Grad och konsekvens av denna minskning speglar graden av protein-RNA crosslinking för varje peptid 24.
- Förbereda HPLC buffertar som följer: 0,1% myrsyra i vatten av HPLC-kvalitet (buffert A), 0,1% myrsyra i HPLC-kvalitet acetonitril (buffert B).
- Om en nano-HPLC är tillgängliga, ansluta en nano-kolumn med följande specifikationer: inre diameter 75 µm, packad med C18-AQ partiklar; längd 20-25 cm.
Obs: Om HPLC tillgängliga körs vid högre flöden Använd en ordentlig kolumn-storlek för angivna flödet klassar. Högre flöde kromatografi minskar känsligheten. - Programmera HPLC-metoden enligt följande: flöde klassar 250-300 nL/min; gradient från 2 till 28% buffert B i 120 min, från 28 till 80% B för nästa 5 min och Isokratisk 80% B för 10 min.
Obs: Om HPLC inte har en automatiserad kolumn Jämviktstiden tidigare prov lastning, starta programmet med 10 min vid 0% B före lastning provet. - Programmera förvärvsmetoden MS att utföra data-beroende förvärv (DDA) som standard hagelgevär proteomik experiment. Intermittensen instrument bör alternativa MS fullscan med tandem MS skanningar (eller MS/MS) av de mest intensiva signalerna. Använda de optimala inställningarna för proteomik MS springa.
Obs: För säker resultat, använda instrument som kan utföra minst full MS skanna i högupplöst läge (t.ex. orbitrap, time-of-flight). För exakt kvantifiering, se till att intervallerna mellan MS fullscan är längre än 3 s. längre tull cykler kan hindra korrekt definition av extraherade ion kromatogrammen. - Ladda 1-2 µg av prov på i HPLC-kolonnen och kör metoden HPLC-MS/MS som programmeras. För varje biologiska replikat utföra minst två oberoende körningar och behandla dem som tekniskt replikat.
- Efter MS, importera raw-filer till en proteomik programpaket för MS/MS spectra identifiering och peptid kvantifiering via extraherade jonkromatografi. Vi rekommenderar programpaket som kan utföra kromatografiska justering av flera MS körs (se Tabell för material) 29 , 30.
- Aktiverar alternativet finns i programpaketet, " Match mellan körningar " före start databehandling.
- När analysen är klar, exportera listan peptid tillsammans med kvantifiering värdena.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerar arbetsflödet RBR-ID. På grund av den relativt låga crosslinking effektiviteten av denna teknik är det mycket viktigt att beakta både utarmning nivå och konsekvens av den observerade effekten (P -värde) över biologiska replikat. Figur 2 visar en vulkan tomt RBR-ID resultatet. Peptider som överlappade RNA erkännande motiv (RRM) domän visar konsekvent utarmning nivå. RRM domäner kan användas som en positiv kontroll för RBR-ID analys.
RBR-ID kan användas för att mappa RBRs i levande celler. En RBR-ID Poäng kan beräknas för varje peptid för att uppskatta RNA-bindande potential: RBR-ID Poäng = - logga2(normaliserade + 4SU intensitet/normaliserade-4SU intensitet) x (log10(P -värde))2. Figur 3 visar en heatmap av RBR-ID noter projiceras på ytan av den spliceosomal subuniten U1 - 70 k. Den ljusa röda färgen i närhet av kontakt-RNA, anger som bestäms från kristallstrukturen, korrekt identifiering av protein-RNA interaktionen.
Vid identifiering av romanen RBPs och deras RBRs rekommenderas det starkt att deras RNA-bindande aktivitet bekräftas av en oberoende metod. I vår tidigare studie24, vi identifierat TET2 som en roman RBP och mappade RNA-bindande aktiviteten till en C-terminal region, som visas i figur 4A av plottning RBR-ID Poäng längs den primära sekvensen av protein. Figur 4B visar att kravet på denna roman RBR kunde verifieras genom att utföra PAR-CLIP26 använda WT sekvensen och jämföra signalen som en mutant som saknar den förutspådda RBR. Ytterligare kontroll och mer detaljerad förklaring av detta validering experiment finns i han et al. 201624.
Figur 1: RBR-ID översikt. Mus ESCs behandlas med 4SU eller inte (1 - 2) och bestrålas med 312 nm UV (3). Kärnorna är isolerad (4) och extrakt som rötas med proteas och nuclease, vilket ger både tvärbundna och uncrosslinked peptider (5). Kovalent RNA addukter på crosslink platser alter peptid massan, leder till en motsvarande minskning av intensiteten i uncrosslinked peptidens masspektrum (6, pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: proteom-wide RBR-ID i mESCs. Vulkan tomter visar loggen-faldig förändringar i peptid intensiteter på x -axeln och Student's t-test P -värden på y -axeln för ± 4SU behandlingar (312 nm). Peptider överlappande kommenterad RRM domäner är i blått. En RNA-bindande peptid från HNRNPC är markerade i rött. Tidigare publicerad i han et al. 201624. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: RBR-ID mappas platser för protein-RNA interaktioner. Inzoomad regioner i kristallstrukturen i U1 snRNP (PDB-ID: 4PJO31) visar protein ytor färgkodade enligt deras RBR-ID Poäng och interagera RNAs för U1 - 70 K. Tidigare publicerad i han et al. 201624. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: validering av RBR av TET2. (A) primär sekvens och kända domäner för TET2; utjämnade resthalter RBR-ID Poäng ritas längs den primära sekvensen (mitten); och systematik epitop-taggade katalytiska domänen fragment (CD) och RBR-bort (CDΔRBR) konstruktioner används för verifiering (nederst). (B) PAR-klipp av övergående uttryckt TET2 CD och ΔCDΔRBR i HEK293 celler. Autoradiografi för 32P-märkt RNA (överst) och kontroll western blot (nederst). Tidigare publicerad i han et al. 201624. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en detaljerad experimentellt protokoll för att utföra RBR-ID i mESCs och, med lämpliga ändringar, i någon cell som kan integrera 4SU i RNA. Andra celltyper kan kräva optimering av metoder för att säkerställa en tillräcklig signal-brus-förhållande. Dessutom, medan protokollet beskrivs häri fokuserar på undersökningar av nukleära RBPs, bör RBR-ID tekniken anpassas lätt till olika cellulära fack, såsom cytosol eller särskilda organeller, genom användning av olika fraktionering strategier. Parametrar som kan kräva optimering inkluderar 4SU koncentration och inkorporering tid samt energin av UV crosslinking. Dessa parametrar är viktiga att säkerställa effektiv bildandet av RNA-protein antipyridinantikropp och ge en tillfredsställande signal-brus-förhållande. Vi har visat att 312 nm UVB ljus är mycket effektivare på crosslinking 4SU-innehållande RNAs proteiner jämfört med 365 nm UVA används vanligtvis i PAR-CLIP32. Direkt jämförelse av RBR-ID utförs med 312 nm och 365 nm visade att 312 nm UVB resulterade i identifiering av en mycket större del av kända RBPs24.
Det finns två andra metoder att utföra proteom-wide RBP identifiering. En, kallas RBDmap, liknar RBR-ID i att det använder UV crosslinking och MS. RBDmap användes för att identifiera RBPs och karta verksamheten RNA-bindande i HeLa celler23. Denna metod bygger på positiv identifiering av peptider angränsande till RNA-bindande platser och förlitar sig på två sekventiella oligo-dT pull-downs, vilket tyder på att det kan ha en falsk positiv lägre än RBR-ID. Pull-downs tillåter dock endast identifiering av RBPs som binder till polyA + RNA och kräver stora mängder insatsmaterial, upp till 10 - 100 gånger mer än RBR-ID. RBR-ID kan utföras med så lite som 5 µg protein per biologiska replikera (~ 2 µg per tekniska replikat), vilka kan samlas in från så lite som 250 000 celler.
Den andra metoden kallas ekolod, är beroende av datautvinning av stora protein-protein interaktioner databaser att detektera proteiner som rena ofta tillsammans med kända RBPs och vars interaktion med dessa RBPs kan därför vara medierade av RNA18. Denna smarta strategi är mycket kraftfull och möjliggör identifiering av romanen RBPs utan att utföra någon våt labb experiment, förutsatt att lämpliga databaser är tillgängliga; men det kan inte avslöja de interaktion platserna och därför är kompletterande men inte alternativ till RBR-ID.
Sammanfattningsvis kan vår RBR-ID teknik identifiera roman RBPs och kartlägga deras RBRs med begränsad ingång provet belopp och utan att kräva någon biokemisk rening av de protein-RNA tvärbundna komplex. Tekniken gör inget antagande på vilken typ av RNA bunden av de identifierade RBPs och därför kan mappa aktiviteten RNA-bindande proteiner som binder till icke-polyadenylated, av vilka många är kodande, vilket tyder på att RBR-ID kan visa sig vara en användbar teknik för att studera den reglerande roller av icke-kodande RNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
R.B. stöddes av till Searle Scholars-programmet, Stiftelsen WW Smith (C1404) och mars Dimes Foundation (1-FY-15-344). Påse erkänner stöd från NIH grants R01GM110174 och NIH R01AI118891, liksom DOD bevilja BC123187P1. R.W.-T. stöddes av NIH utbildning grant T32GM008216.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed - Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
References
- Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
- Rinn, J. L., Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).
- Goff, L. A., Rinn, J. L. Linking RNA biology to lncRNAs. Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).
- Holoch, D., Moazed, D. RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression. Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cabili, M. N., et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6, 10127 (2015).
- Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nat Commun. 7, 11212 (2016).
- Wilusz, J. E., et al. A triple helix stabilizes the 3' ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails. Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).
- Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).
- Brannan, K. W., et al. SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes. Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).
- Bonasio, R., et al. Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes. Elife. 3, e02637 (2014).
- Kaneko, S., et al. Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin. Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).
- Kaneko, S., et al. Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA. Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).
- Saldana-Meyer, R., et al. CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53. Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).
- Castello, A., et al. Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells. Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
- He, C., et al. High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells. Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).
- Favre, A., et al. 4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
- Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions. J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition. Elife. 4, (2015).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. J Vis Exp. (41), (2010).
