Summary
We beschrijven een chirurgische procedure in een verdoofd ratmodel voor het bepalen van de spiertonus en de viscoelastische eigenschappen van de tong. De procedure omvat specifieke stimulatie van de hypoglossale zenuwen en toepassing van passieve Lissajous kracht / vervormingskrommen op de spier.
Abstract
De tong is een zeer ingeburgerde en vascularized spierhydrostat op de vloer van de mond van de meeste gewervelde dieren. De voornaamste functies zijn onder meer het ondersteunen van masticatie en ontbinding, evenals smaakwaarneming en fonetiek. Bijgevolg kan de sterkte en het volume van de tong het vermogen van gewervelde dieren beïnvloeden om basisactiviteiten te verwezenlijken, zoals het voeden, communiceren en ademen. Menselijke patiënten met slaapapneu hebben vergrote tong, gekenmerkt door verminderde spiertonus en verhoogd intramusculair vet dat kan worden gedetecteerd en gekwantificeerd door magnetische resonantiebeeldvorming (MRI). De mogelijkheden om krachtgeneratie en viscoelastische eigenschappen van de tong te meten zijn belangrijke instrumenten voor het verkrijgen van functionele informatie om te correleren met beeldgegevens. Hier presenteren we technieken voor het meten van tongkrachtproductie bij verdovende Zucker-ratten via elektrische stimulatie van de hypoglossale zenuwen en voor het bepalen van de viscoelastische eigenschappen oF de tong door passieve Lissajous kracht / vervormingskrommen toe te passen.
Introduction
De tong biedt essentiële ondersteuning voor masticatie, ontbinding, smaakwaarneming en spreken. De aanwezigheid van extrinsieke en intrinsieke musculatuur, met een duidelijke innervatie en anatomie / functie, staat voor de uniekheid van deze gespierde hydrostat. Recente vooruitgang in beeldvormingstechnieken heeft een gedetailleerder beeld van zijn complexe anatomie 1 gegeven . Verminderde tongfunctionaliteit, tongatrofie, dysfagie en spraakbeperkingen zijn ook gebruikelijke manifestaties van myopathische aandoeningen zoals Parkinson 2 , Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) 3 , Myotonische Dystrofie (MD) 4 en andere myopathieën.
Veranderingen in spiersamenstelling geassocieerd met gemeenschappelijke ziektebeelden beïnvloeden de mechanische en viscoelastische eigenschappen van de tong. Bijvoorbeeld, functionele analyse van de tong kracht heeft ontdekt veranderingen in contractiele eigenschappen geassocieerd met verouderingSs = "xref"> 5 , 6 , hypoxie 7 , 8 en obesitas 9 , 10 . Bij spierdystrofie leidt de verhoogde fibrose tot hogere spierstijfheid, wat vertaalt om de naleving van deformatie te verminderen wanneer een Lissajous deformatieprotocol wordt toegepast 11 . Omgekeerd veranderen de veranderingen in spiervetgehalte, zoals die welke bij zwaarlijvige patiënten zijn gedocumenteerd, zowel metabolische 12 als mechanische eigenschappen van de skeletspieren 13 , 14, en worden voorspeld om de spiercontrole op vervorming te verhogen. Verhoogde tongvet komt ook overeen met de ontwikkeling van obstructieve slaapapneu (OSA) bij mensen 17 door het verhogen van de tongvolume tot op het punt van partiële bovenste luchtwegopname (apneu) 15 , 16 . SimLelijk aan mensen, is tongvetinfectie gedocumenteerd in zwaarlijvige Zucker ratten 10 , wat suggereert dat dit model een waardevol instrument is voor het bestuderen van de effecten van vetinfectie op tongfysiologie.
Meetsterkracht vereist delicate chirurgische technieken om de hypoglossale zenuwen 17 , 18 te isoleren en bilateraal te stimuleren. Dergelijke technieken zijn eerder beschreven in ratten 5 , 17 , 19 , 20 , konijnen 21 en mensen 22 , 23 , maar met beperkte visuele hulpmiddelen aan de onderzoeker. Vanwege de zeer technische aard zou de beschikbaarheid van een gedetailleerd protocol de toegankelijkheid en reproduceerbaarheid van deze techniek aanzienlijk verbeteren. Het doel van ons experimentele paradigma is te ziekUstrate een geldige en betrouwbare techniek voor het meten van sterkte en viscoelastische eigenschappen van de tong in een ratmodel. Om dit te bereiken wordt de rat verdoofd, de hypoglossale zenuwen worden blootgesteld en de luchtpijp is gecontroleerd om vrije toegang te bieden tot de tong van het dier. Een hechtingslus verbindt dan de punt van de tong met een krachttransducer die in staat is om zowel kracht als lengte te controleren, terwijl twee bipolaire haakelektroden de hypoglossale zenuwen stimuleren om de samentrekking van de tong te veroorzaken. Nadat de krachtmeting is voltooid, worden de lengtebeperkende mogelijkheden van de krachtoverdrager gebruikt om de lengte van de tong snel te veranderen, volgens een sinusgolfprotocol met vaste amplitude (Lissajous-curven), duur en frequentie, waardoor men ergens kan leiden Zijn viscoelastische eigenschappen 11 , 24 . Het protocol leidt de onderzoeker door de dissectiestap, de positionering van het dier op de experimentele platfoRm, plaatsing van elektroden, en tenslotte op de acquisitie en analyse van de kracht- en viscoelasticiteitsgegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures, inclusief diergeneeskunde, zijn goedgekeurd door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee (IACUC) van de Universiteit van Pennsylvania (protocolnummer 805822). De beschreven procedure is terminal en vereist geen gebruik van aseptische omstandigheden of farmaceutische producten.
1. Chirurgische procedures
Figuur 1: Chirurgische procedures.
(A) Chirurgische plan afbakening. De rode streeplijn geeft het gebied van de incisie aan. Twee zwarte lijnen geven de positie van de kaak aan, terwijl de onderste zwarte lijn de positie van de thorax aangeeft. De blauwe lijn geeft het hyoidbeen aan. (B) Blootstelling van de achterste buik van de spiermassa (pijlen) na stompe dissectie van vetweefsel, de sublinguale en submaxill Ary klieren. (C) Resectie van de achterste buik van de digastrische spier (gestippelde groene lijn) om de hypoglossale zenuw (witte pijl) bloot te leggen. (D) De hypoglossale zenuw (witte pijl) wordt verwijderd van de omliggende fascia. (E) De luchtpijp wordt blootgesteld door de gladde spier er zachtjes uit te trekken (de groene pijlen wijzen op de richting van de kracht die wordt toegepast) en ligt (F) om voor de intubatie voor te bereiden. De ster geeft aan dat de tong in het hyoidbeen is aangebracht. De groene streeplijn markeert het punt van incisie voor de intubatie. De witte pijl geeft de losse knop aan om de canule op zijn plaats te plaatsen wanneer deze is geplaatst. (G) Incisie van de luchtpijp voor cannulatie. (H) De tracheale canule wordt ingebracht en vastgezet met een vierkante knoop. (I) Toepassing van de hechting aan de tong.Target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
- Anesthesie en voorbereiding voor de operatie
- Plaats de rat in de inductiekamer met 4% isofluraananesthesie.
- Leg het dier achterover een warmtebron en verdedig anesthesie met 1 - 3% isofluraan van een nosecone, waardoor een ademhalingssnelheid van minstens 70 ademhalingen per minuut wordt gewaarborgd.
- Scheer het nekgebied met een air-clipper en haarverwijderingsroom. Wanneer u het haarverwijderingsroom gebruikt, verspreid de room met een katoenstippelapparaat totdat de vacht is verwijderd. Langdurige blootstelling aan haarverwijderingsroom kan irritatie van de huid veroorzaken.
- Reinig het chirurgische veld met 70% alcohol ( Figuur 1A ).
- Controleer het ademhalingpatroon en de reflexen van het dier (gebrek aan klinkreflex) voordat u verder gaat met de eerste incisie. De voortdurende controle en beoordeling van de diepte van de verdoving is essentieel (reKoord respiratoire snelheid en gebrek aan reflexen elke 10 minuten); Het dier moet tijdens de gehele procedure onder een diep, chirurgisch anesthesievlak zijn.
- Identificatie van hypoglossale nieren
- Open het chirurgische veld met een paar werkscharen door de huid te resecteren en te verwijderen zoals aangegeven door de rode stippellijn in Figuur 1A .
- Blunt dissecteren door elk vetweefsel, de sublinguale en submaxillaire klieren en de spierlaag die de trachea omringt.
OPMERKING: Wees voorzichtig tijdens de dissectie. Gebruik stomp dissectie waar mogelijk en wees voorzichtig om de bloedvaten van de nek niet te beschadigen. - Identificeer de achterste buik van de buikspier (PD) lateraal in de luchtpijp ( Figuur 1B - witte pijlen). De hypoglossale zenuw loopt onder deze spier ( Figuur 1C - witte pijl). Met de elektrocautery, resep de PD proxImaal naar het hyoidbeen ( figuur 1C - streeplijn).
OPMERKING: Laat de zenuw of het weefsel er niet omheen droog worden. Voeg een druppel minerale olie op de zenuw toe om het te beschermen. Om spiercontractie te vermijden door veldvorming van de stimulus van de elektroden, vermijd het spierweefsel zorgvuldig op de mogelijke contactpunten rond de zenuw. - Ontleed de hypoglossale zenuw uit het omliggende fascia met behulp van een paar fijne tangen. Controleer met behulp van een haak dat tenminste 3 mm van de zenuw beschikbaar is voor de aansluiting van de bipolaire elektrode ( Figuur 1D ).
- Met behulp van micro-hemostatische tang, verpletter de hypoglossale zenuw zo distaal van het hyoidbeen ( Figuur 1D -witte pijl) om de terugkeer van de stimulus te voorkomen. Kruip de zenuw door druk op te leggen met de micro hemostatische tang voor 5 s. Wanneer de hemostat de zenuw begrijpt, een korte tHeks aan de onderkant van de tong moet zichtbaar zijn.
- Herhaal de procedure voor de andere kant.
- Tracheale intubatie
- De luchtpijp blootstellen door de omringende gladde spieren zachtjes te scheiden door middel van stompe dissectie ( Figuur 1E - zoals aangegeven door de groene pijlen).
OPMERKING: Wees voorzichtig en gebruik de voorkeur aan dissectie. Vergelijk de diameter van de canule met die van de luchtpijp. De canule moet goed in de luchtpijp passen en moet stabiel worden ingebracht nadat deze is gezogen zoals beschreven in stappen 1.3.2 tot en met 1.3.5. - Zet de luchtpijp voorzichtig met behulp van een paar suture-bindende tang en passeer een 4-0 suture onder het, dicht bij de thorax. Bind een eerste losse knoop tussen de 6e en 7e ring van de larinks ( Figuur 1F - witte pijl). Deze knop wordt afgesloten zodra de canule is geplaatst om deze vast te houden.
- Schuif de steel van aTransferpipette (smeren de pipet met minerale olie om de invoeging te vergemakkelijken) onder de luchtpijp om hem te verhogen en de inbrengen van de canule te vergemakkelijken (IV 14 gx 3,25 "canule).
- Knip een kleine insnijding tussen de 4e en 5e ringen van de larinks ( Figuur 1G - witte pijl). Na de eerste incisie zal de opening geneigd zijn om te verspreiden, dus wees voorzichtig bij het maken van de eerste snede om de volledige resectie van de luchtpijp te vermijden.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de canula klaar is voor het snijden van de luchtpijp en de aflevering van de anesthesie is ingeschakeld. - Begin de anesthesie toediening via de canule en steek het zachtjes in de incisie, voorzichtig in de luchtpijp, de lengte van ongeveer 5 ringen. Bevestig de canule op zijn plaats met de hechting, om een luchtdichte afdichting te vormen ( Figuur 1H ).
OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen vloeistof binnenkomt in de buikpijp om te voorkomen dat er voldoende zitocation. Zodra de luchtpijp is ingehaald, zal het dier lucht inademen. Het is daarom belangrijk om de canule snel in te voeren zodat de aflevering van de verdoving wordt onderhouden. Wanneer / wanneer u het dier verplaatst, controleer u de juiste positie van de canule in de luchtpijp. - Verwijder het dier voorzichtig uit de nosecone.
OPMERKING: Het gebruik van injecteerbare verdovingsmiddelen in plaats van isofluraan kan de procedure vereenvoudigen door de noodzaak van tracheale intubatie te elimineren en de experimentele werkruimte te elimineren van overmaat buizen.
- De luchtpijp blootstellen door de omringende gladde spieren zachtjes te scheiden door middel van stompe dissectie ( Figuur 1E - zoals aangegeven door de groene pijlen).
- Tong hechten
- Week een 20 cm lang stukje 5/0 suture (wij raden Silk, zwart gevlochten) in PBS aan.
- Houd de mond van de rat open, hou de mond van de tong voorzichtig vast met de suture-bindende tang.
- Pas de hechting mediaal door de punt van de tong ( Figuur 1I - witte pijl) om de tong vochtig te houden met zoutoplossing om potentiële weefsels te vermijdenschade.
- Bind een lus ongeveer 4 cm breed (de diameter kan veranderen op basis van de afstand tussen het dier en de krachttransductor).
OPMERKING: Zorg ervoor dat de hechting en de tong nat zijn om de invoeging te vergemakkelijken en onnodige letsels van het weefsel te vermijden.
2. Experimentele instelling
Figuur 2: Het dieren plaatsen en beveiligen.
(A) De muis is gepositioneerd op het experimentele platform. De kaak is beveiligd en de mond wordt geopend door toepassing van verticale spanning (groene pijl). De hechtingslus is verbonden met de krachttransductor (witte pijl). (B) De elektroden zijn aangesloten. (C) Elke elektrode, gemonteerd op een micromanipulator, is stabiel verbonden met de zenuw. De inleg toont de beëindiging van tHij haalt elektrode. (D) De optimale lengte van de tong wordt gemeten met een Vernier-kaliber, van het inbrengen op het niveau van het hyoidbeen naar de punt van de tong. In deze foto werden de elektroden voor de duidelijkheid verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Opmerking: Plaats het dier op de verwarmde bak van het apparaat, met behulp van de volgende beveiligingsmaatregelen om beweging tijdens het experiment te vermijden.
- Bevestig de neus van de rat naar de lade met een met plastic beklede metalen draaiende band die direct verbonden is met het verwarmde platform ( Figuur 2A , 2B ).
- Bewaar de mond van de rat open door verticale spanning aan te brengen (gebruik een 3-voudige draai, gebonden aan 9 kg test monofilament lijn en houd hem vast met een camera stick) ( Afbeelding 2A - groene pijl).
OPMERKING: een alternatieve aanpak voor het stabiliseren van de rat is met behulp van een knaagdier mond gag of een aangepaste aanpassing ervan. Het is essentieel dat de mond open en stabiel wordt gehouden om bewegingen van de nek te voorkomen die de kwaliteit van de metingen kan beïnvloeden. - Sluit de sutuurlus aan op de kraanomvormer ( Figuur 2A - witte pijl).
- Gebruik chirurgische tape, immobiliseer de ledematen en de buik van de rat om bewegingen tijdens de stimulaties te beperken.
- Breng de twee stimulerende haakbipolaire elektroden aan op de dissecteerde hypoglossale zenuwen, proximaal naar de crush site ( Figuur 2C ).
- Gebruik stimulerende bipolaire elektroden die zijn gemaakt van een paar chirurgische stalen 29 gauge naaldelektroden, die op een afstand van 2 mm van elkaar vastgehouden worden, met behulp van een kunststof steun (hier gebruikten we twee 1-ml serologische pipetten die samen zijn gelegd).
- Buig de tips van de naaldelektroden naar een haakvormKlein genoeg om een stabiel contact te vormen met de zenuw (~ 1 mm diameter) ( Figuur 2C -inleg).
- Sluit de twee draden van elke elektrode aan op een stapelbare dubbele bindingspost met banaan jack x BNC-aansluiting en sluit dan aan op de stimulatormodule van een in situ Spier Test System (Tabel 3) met een BNC splitter.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het dier stabiel is en dat de nek en de tong in lijn zijn met de hefboomhendel. Controleer de ademhalingssnelheid en zorg ervoor dat de beperkingen de ademhaling niet verstoren.
3. Optimale lengte (L 0 ) en maximale isometrische krachtbepaling
- Pas de lengte van de tong geleidelijk aan en gebruik de isometrische spierstimulaties tot een maximale kracht wordt verkregen.
- Definieer L 0 als de lengte waarop de isometrische trekkracht ( Tabel 1 ) maximaal is en record voor de volgende normalisatie vanDe krachtmetingen, zoals het voor elk dier verandert. Met behulp van een Vernier-kaliber, meet de lengte van de tong van het inbrengen op het niveau van het hyoidbeen ( figuur 2D ) naar de punt van de tong.
OPMERKING: de juiste positionering van de elektroden is essentieel om optimaal contact met de zenuwen te waarborgen. Optimale positionering moet dezelfde en additieve krachten uitoefenen als respectievelijk een van de twee zenuwen of beide stimuleren.
- Definieer L 0 als de lengte waarop de isometrische trekkracht ( Tabel 1 ) maximaal is en record voor de volgende normalisatie vanDe krachtmetingen, zoals het voor elk dier verandert. Met behulp van een Vernier-kaliber, meet de lengte van de tong van het inbrengen op het niveau van het hyoidbeen ( figuur 2D ) naar de punt van de tong.
- Voordat u het experiment start, sluit u beide elektroden aan op de stimulator en installeer een teststanische stimulatie ( tabel 1 ). Controleer tijdens dit samentrekking het dier om ervoor te zorgen dat de positie stabiel is, en controleer op ongewenste zichtbare samentrekkingen van de nekspieren.
- Meet isometrische kracht door een twitch toe te passen die na 20 s gevolgd wordt door een tetanische stimulatie. Herhaal de stimulaties 3 keer waardoor 4 minuten herstel tussen stimulatiecycli (een cyclus bevat één draai en aanE tetanische stimulatie), en teken de maximale trek- en tetanische krachten op.
- Houd de tong nat altijd door een paar druppels PBS toe te passen tussen contracties.
OPMERKING: Als de nekspieren contracten, verander de positie van de elektroden zorgvuldig zodat ze geen omringend spierweefsel raken en, indien nodig, het weefsel in contact brengen met de elektroden.
4. Viscoelastic Properties Determination (Lissajous Curves)
- Laat de tong 3 tot 5 minuten rusten na de isometrische krachtbepaling. Voer de Lissajous-curven uit bij L 0 , daarom moet de positie van het dier en van de krachttransductor nooit veranderd worden.
- Zonder stimulatie van de hypoglossale zenuwen, gebruik cycli van passieve strekken ( tabel 2 ) met toenemende verplaatsing (d) dwz 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50% van L 0 Modus controller met higheR excursie waarden dan de 305C-LR). Bijvoorbeeld, een amplitude van 40% L 0 zal de vervorming van de tong van + 20% L 0 tot -20% L 0 veroorzaken .
- Gebruik vaste 2 Hz sinusfrequentie met 10 repetities in elke cyclus, voor een totale duur van 5 s elke cyclus. Veranderingen van de sinusfrequentie zijn in het verleden gebruikt met weefsels zoals diafragma 24 en kunnen worden aangenomen om het experimentele protocol te wijzigen.
- Laat 30 s tussen elke cyclus toe en zorg ervoor dat de tong gedurende de gehele procedure nat is.
OPMERKING: Houd de tong nat tijdens de procedure en voeg een paar druppels PBS toe. Zorg ervoor dat de vasthoudkracht die de kaak vasthoudt, stabiel op zijn plaats blijft tijdens de strekken, met name wanneer de verplaatsing 40% of hoger bereikt.
- Onmiddellijk na het afronden van het experiment, terwijl het dier nog steeds onder een diep operatief anesthesievlak ligt, bevrijd het dier volgens het goedgekeurde IACUC-dierprofielocol. Dissect de tong voor verdere verwerking ( dwz bevroren doorsnede of opslag voor biochemische analyses).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 3: Representatieve resultaten.
(A) Voorbeelden van succesvolle spier- en tetanische krachtsporen. De bijbehorende stimulatie wordt weergegeven door het rode spoor. (B) Voorbeeld van mislukte tong tetanische contracties door submaximale samentrekking (blauwe sporen) en indirecte stimulatie van de nekspieren. Beide omstandigheden kunnen worden verbeterd door de stimulerende elektroden te verplaatsen of het contact tussen de elektrode-terminaties en het omringende spierweefsel te vermijden. (C) Voorbeeld van sinusgolfverplaatsing van L0 (25% van L0) gebruikt om de viscoelastische eigenschappen van de tong te bepalen. De gemiddelde verlenging (blauwe vierkant) en verkorting (groene vierkante) krachten kunnen worden gebruikt om de Peak-To-Peak Force 24 te berekenen. Het rode vierkant inDicateert het bereik dat voor de analyse wordt beschouwd (exclusief de eerste en de laatste sinusgolven). (D) Vertegenwoordiging van de kracht / verplaatsingsrelatie als Lissajous loops, waardoor de verplaatsing van 5% tot 50% L 0 werd verhoogd. Het gebied binnen elke lus komt overeen met het energieverlies, gedefinieerd als het verschil tussen het werk dat op de spier gedaan wordt om het te verlengen en het werk dat door de spier wordt gedaan, aangezien het na het rek 24 verkort. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Verwachte waarden voor de spier- en tetanische krachten in een 3 maanden oude Zucker-rat (gemiddeld lichaamsgewicht 400 g voor mager en 700 g voor zwaarlijvige Zucker-ratten) worden getoond in Figuur 3A . De tetanische kracht ontwikkeld na stimulatie moet snel piek (zwarte pijlkop)En dan langzaam afnemen tot de stimulatie stopt. Figuur 3B toont voorbeelden van mislukte contracties waarbij de krachtgeneratie voor het einde van de stimulatie niet een plateau niveau bereikt (blauwe lijn - bijv. Als de tonglengte is ingesteld op een waarde lager dan L 0 of als het bovenlichaam van het dier niet is Volledig gestabiliseerd), of waarbij de stimulus de samentrekking van de nekspieren (groene lijn) veroorzaakte. In de meeste gevallen kan een zorgvuldige herpositionering van de elektroden de inkrimping verbeteren. Als de nekspieren zichtbaar contracteren tijdens de zenuwstimulatie, probeer dan elk contactpunt tussen elektroden en spierweefsel te isoleren, ofwel door de spier te cauteriseren of door de elektroden eraf te bewegen. Krachten kunnen worden genormaliseerd door het volume van de tong gemeten door MRI als dit beschikbaar is. Een alternatief voor het gebruik van de volumetrische gegevens is het normaliseren van het gewicht van de tong na dissectie.
0 hebben bereikt, wordt getoond in figuur 3C en 3D . Figuur 3C toont de lengte- en krachtsporen afzonderlijk, die in combinatie met figuur 3D de typische Lissajous-lussporen genereren. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de tong tussen elke cyclus nat blijft door enkele druppels PBS toe te voegen. Verhoogde verplaatsing van L 0 komt overeen met hogere passieve (werk gedaan op de spier tijdens verlenging) en actief (werk gedaan door de spier tijdens negatieve) krachten. De analyse van deze sporen kan ingewikkeld zijn. Een curve montage van maximale gemiddelde kracht en / of middelpunt voor elke cyclus kan worden gebruikt om de viscoelastische eigenschappen van de tong te beschrijven. Een meer gedetailleerde analyse van de Lissajous work-loops is beschreven door DA Syme 24De ruit diafragma.
| Protocol | Pulsspanning (V) | Pulsfrequentie (Hz) | Polsbreedte (ms) | Pulsen per trein | Treinduur (ms) |
| Zenuwtrekking | 10 | 2500 | 0.2 | 1 | 0.2 |
| Tetanus | 10 | 120 | 0.2 | 96 | 800 |
Tabel 1: Voorgestelde stimulatieparameters.
Isometrische trekcontractie wordt verkregen door bilaterale zenuwstimulatie met een enkele elektrische puls van 10V, met een lengte van 0,2 ms. Na 20 s wordt een tetanische isometrische samentrekking verkregen door het stimuleren van bilateraleLy met een trein van pulsen (10 V, 120 Hz frequentie, voor 800 ms). De stimulatie van de trilling / tetanus wordt drie maal herhaald met een interval van 3 - 5 minuten tussen elke cyclus. Voor de analyse worden de hoogste repetities en de hoogste tetanische krachten van de drie herhalingen beschouwd.
| Totale afwijking (d) van L 0 (%) | Sin amplitude (% L 0 ) | Sinfrekwentie (Hz) | Aantal cycli | Tijd tussen cycli (en) |
| d | d / 2 | 2 | 10 | 30 |
Tabel 2: Lissajous Curve Parameters (Sinusvormige Afwijking van L 0 ).
De toepassing van de LissajOus kracht / verplaatsingsprotocol begint 3 - 5 minuten na de stimulatie van de spier / tetanus. Elke cyclus duurt 5 s (10 herhalingen bij 2 Hz frequentie) en wordt 30 s na de vorige uitgevoerd. De% verplaatsing vanaf L 0 (d) neemt bij elke cyclus toe, van een willekeurig minimum van 5% tot 50% van L 0 . Hogere excursies kunnen worden gerealiseerd met andere krachttransmittermodellen ( tabel 3 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Veranderingen in de tongmetabolisme en / of samenstelling, bijvoorbeeld tongvetinfectie als gevolg van obesitas, worden voorspeld om kwantificeerbare veranderingen van de parameters te beoordelen die door ons protocol worden beoordeeld. De kwantificering van de tongkracht is van groot belang, aangezien een onevenwicht tussen uitstulpende en retraterende activiteit of algemene tongverzwakking kan leiden tot de occlusie van de bovenste luchtweg 15 . Oefeningstechnieken die gericht zijn op de sterkte van de tong zijn succesvol toegepast bij ratten 25 , 26 en ook bij mensen 27 , 28 , 29 , waar ze de ernst van slaapapneu daadwerkelijk verminderen. Bovendien is hypoglossale zenuwstimulatie nu een chirurgische behandeling voor obstructieve slaapapneu 22 , 23 , 30 .
31 , slaapmedium 10 , 25 en de pathogenese van obstructieve slaapapnee 15 . Het beschreven stimulatieprotocol en parameters kunnen gemakkelijk worden aangepast om andere fysiologische informatie te verkrijgen, zoals de krachtfrequentieverhouding, vermoeidheids- en vermoeidheidsherstelcapaciteit, evenals kinetiek van spiercontractie als reactie op stimulatie.
Bij gebruik zonder de stimulatie-opgewekte krachtmetingen, is het passieve kracht / vervormingsprotocol dat we beschrijven geschikt voor herhaaldAnalyse over de tijd, aangezien het geen van de chirurgische procedures gebruikt voor zenuwstimulatie en krachtmetingen nodig heeft, behalve de minimaal invasieve hechting van de tong. In deze toestand kan de fysiologische lengte van de tong, berekend door MRI, als referentie worden gebruikt ( tabel 2 , parameter d) in plaats van de gemeten L 0 . Voor dit doel zal het gebruik van injecteerbare verdoving de behoefte aan tracheale intubatie elimineren.
Een beperking van de huidige aanpak ligt in het onvermogen om onderscheid te maken tussen uitsteeksels en terugtrekkende componenten van de samentrekking van de tong. De in dit protocol beschreven stimulerende haakelektroden worden proximaal geplaatst aan de bifurcatie van de zenuw, waardoor de hele tong gestimuleerd wordt om gestimuleerd te worden. Andere groepen hebben het gebruik van silicium zenuw manchet elektroden beschreven in ratten 19 , 32 of konijnen 21 , welke alLage selectieve toegang en stimulatie van een of beide takken van de hypoglossale zenuwen. Bovendien zou het gebruik van injecteerbare anesthetica in plaats van isofluraaninhalatie betere toegang bieden tot het submandibulaire gebied waar de hypoglossale zenuwen vertakken.
Met de praktijk is dit protocol van toepassing op kleinere dieren zoals muizen, waar de overgrote meerderheid van de ziektemodellen momenteel beschikbaar zijn. In het bijzonder zijn een reeks muismodellen waarin de taalfysiologie veranderd zijn 33 , 34 , 35 , 36 bekend . Afschaling vereist het gebruik van kleinere chirurgische gereedschappen, elektroden en tracheale cannulas (indien nodig), en optioneel met een krachttransductor ontworpen voor lagere krachtbereik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door twee National Institutes of Health Grants: HL089447 ("Obesitas and OSA: Understanding the Importance of Tongue Fat & Metabolic Function") en HL094307 ("De Verhouding Betekenen Van Obesitas En Tong Fat")
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SurgiSuite (heated Surgical tray) | Kent Scientific | SurgiSuite-LG | Includes heated platform |
| LED Lighting and Magnification Kit | Kent Scientific | SURGI- 5003 | |
| RC2 Rodent Circuit Controller | VetEquip | 922100 | |
| Isoflurane | Butler Schein Animal Health Supply | 29405 | |
| Alcohol Prep | Webcol | 6818 | |
| Cotton-tipped applicators | MediChoice | WOD1002 | |
| Hair clipper | Conair | ||
| Hair remover lotion | Nair | ||
| Medical tape | Transpore | 3M | |
| D-PBS | Corning | 21-030-CM | |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 503717-12 | |
| Hemostatic Forceps | Merit | 97-458 | Any tissue forceps can be used instead |
| Microdissecting Forceps, Angled, Serrated, 10.2 cm, SS | World Precision Instruments | 504479 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Blunt Micro Hook | Fine Science Tools | 10062-12 | |
| Microhemostat | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Thermal cautery | WPI | 501292 | Disposable cauteries are available at lower cost |
| IV 14g x 3.25" cannula | BD | B-D382268H | For tracheal cannulation |
| Braided silk non-absorbable suture size 4-0 | Harvard Apparatus | SP104 | For stabilization of the tracheal cannula |
| Braided non-absorbable silk 5/0 suture | Surgik LC, USA | ESILRC15387550 | For suturing the tongue |
| Plastic-coated metal twist-tie (or electrical wire) | For securing the rat's nose to the platform | ||
| Camera stick | |||
| 3 way-swivel and Trilene 9 Kg test monofilament line | Berkley | For securing the jaw and maintaining the mouth open | |
| Camera stick with adjustable angle | For supporting the 3 way-swivel and maintaining the mouth open. | ||
| in situ Muscle Test System | Aurora Scientific | 809C | This system is designed for mice and was modified by extending the platform. Alternatively the rat-specific 806D system can be used. |
| Dual-Mode Muscle lever (force transducer) | Aurora Scientific | 305C-LR | 309C offers higher excursion capabilities than 305C-LR. Link for more information and specifications: http://aurorascientific.com/products/muscle-physiology/dual-mode-muscle-levers/ |
| Needle Electrodes (surgical steel, 29 gauge) | AD Instruments | MLA1204 | 300C is recommended for use in mice. |
| Magnetic Stands | World Precision Instruments | M10 | Used for making the bipolar stimulating hook electrodes |
| Kite Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R and KITE-L | Require a steel plate |
| Stackable Double Binding Post with Banana Jack x BNC Jack | McMaster Carr | 6704K13 | |
| Carbon fiber composites digital caliper | VWR | 36934-152 |
References
- Sanders, I., Mu, L. A three-dimensional atlas of human tongue muscles. Anat Rec (Hoboken). 296 (7), 1102-1114 (2013).
- Ciucci, M. R., et al. Tongue force and timing deficits in a rat model of Parkinson disease. Behav Brain Res. 222 (2), 315-320 (2011).
- Easterling, C., Antinoja, J., Cashin, S., Barkhaus, P. E. Changes in tongue pressure, pulmonary function, and salivary flow in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Dysphagia. 28 (2), 217-225 (2013).
- Wang, Z. J., Huang, X. S. Images in clinical medicine. Myotonia of the tongue. N Engl J Med. 365 (15), e32 (2011).
- Ota, F., Connor, N. P., Konopacki, R. Alterations in contractile properties of tongue muscles in old rats. Ann Otol Rhinol Laryngol. 114 (10), 799-803 (2005).
- Schwarz, E. C., Thompson, J. M., Connor, N. P., Behan, M. The Effects of Aging on Hypoglossal Motoneurons in Rats. Dysphagia. 24 (1), 40 (2008).
- Pae, E. -K., Wu, J., Nguyen, D., Monti, R., Harper, R. M. Geniohyoid muscle properties and myosin heavy chain composition are altered after short-term intermittent hypoxic exposure. J Appl Physiol. 98 (3), 889-894 (2005).
- Fuller, D. D., Fregosi, R. F. Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia. J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).
- Ray, A. D., Farkas, G. A., Pendergast, D. R. In-situ mechanical characteristics of the tongue are not altered in the obese Zucker rat. Sleep. 32 (7), 957 (2009).
- Brennick, M. J., et al. Tongue fat infiltration in obese versus lean Zucker rats. Sleep. 37 (6), 1095-1102 (2014).
- Stedman, H. H., Sweeney, H. L., Shrager, J. B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy. Nature. 352 (6335), 536-539 (1991).
- Goodpaster, B. H., Wolf, D. Skeletal muscle lipid accumulation in obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes. Pediatr Diabetes. 5 (4), 219-226 (2004).
- Loro, E., et al. IL-15Rα is a determinant of muscle fuel utilization, and its loss protects against obesity. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (8), R835-R844 (2015).
- Rahemi, H., Nigam, N., Wakeling, J. M. The effect of intramuscular fat on skeletal muscle mechanics: implications for the elderly and obese. J R Soc Interface. 12 (109), 20150365 (2015).
- Kim, A. M., et al. Tongue fat and its relationship to obstructive sleep apnea. Sleep. 37 (10), 1639-1648 (2014).
- Kim, A. M., et al. Metabolic activity of the tongue in obstructive sleep apnea. A novel application of FDG positron emission tomography imaging. Am J Respir Crit Care Med. 189 (11), 1416-1425 (2014).
- Gilliam, E. E., Goldberg, S. J. Contractile properties of the tongue muscles: effects of hypoglossal nerve and extracellular motoneuron stimulation in rat. J Neurophysiol. 74 (2), 547-555 (1995).
- Sokoloff, A. J. Localization and contractile properties of intrinsic longitudinal motor units of the rat tongue. J Neurophysiol. 84 (2), 827-835 (2000).
- Becker, B. J., Russell, J. A., Connor, N. P. Effects of aging on evoked retrusive tongue actions. Arch Oral Biol. 60 (6), 966-971 (2015).
- Connor, N. P., et al. Tongue muscle plasticity following hypoglossal nerve stimulation in aged rats. Muscle Nerve. 47 (2), 230-240 (2013).
- Seo, J., et al. Nerve cuff electrode using embedded magnets and its application to hypoglossal nerve stimulation. J Neural Eng. 13 (6), 066014 (2016).
- Friedman, M., et al. Targeted hypoglossal nerve stimulation for the treatment of obstructive sleep apnea: Six-month results. Laryngoscope. 126 (11), 2618-2623 (2016).
- Heiser, C., Maurer, J. T., Steffen, A. Functional outcome of tongue motions with selective hypoglossal nerve stimulation in patients with obstructive sleep apnea. Sleep Breath. 20 (2), 553-560 (2016).
- Syme, D. A. Passive viscoelastic work of isolated rat, Rattus norvegicus, diaphragm muscle. J Physiol. 424, 301-315 (1990).
- Connor, N. P., et al. Effect of tongue exercise on protrusive force and muscle fiber area in aging rats. J Speech Lang Hear Res. 52 (3), 732-744 (2009).
- Schaser, A. J., Stang, K., Connor, N. P., Behan, M. The effect of age and tongue exercise on BDNF and TrkB in the hypoglossal nucleus of rats. Behav Brain Res. 226 (1), 235-241 (2012).
- Puhan, M. A., et al. Didgeridoo playing as alternative treatment for obstructive sleep apnea syndrome: randomised controlled trial. BMJ. 332 (7536), 266-270 (2006).
- Guimarães, K. C., Drager, L. F., Genta, P. R., Marcondes, B. F., Lorenzi-Filho, G. Effects of oropharyngeal exercises on patients with moderate obstructive sleep apnea syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 179 (10), 962-966 (2009).
- Ueda, H., Almeida, F. R., Chen, H., Lowe, A. A. Effect of 2 jaw exercises on occlusal function in patients with obstructive sleep apnea during oral appliance therapy: a randomized controlled trial. Am J Orthod Dentofacial Orthop. 135 (4), 430 (2009).
- Strollo, P. J., et al. Upper-airway stimulation for obstructive sleep apnea. N Engl J Med. 370 (2), 139-149 (2014).
- Perrier, P., Payan, Y., Zandipour, M., Perkell, J. Influences of tongue biomechanics on speech movements during the production of velar stop consonants: A modeling study. J Acoust Soc Am. 114 (3), 1582-1599 (2003).
- Connor, N. P., et al. Tongue muscle plasticity following hypoglossal nerve stimulation in aged rats. Muscle & nerve. 47 (2), 230-240 (2013).
- Brady, J. P., et al. AlphaB-crystallin in lens development and muscle integrity: a gene knockout approach. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (12), 2924-2934 (2001).
- Spassov, A., et al. Differential expression of myosin heavy chain isoforms in the masticatory muscles of dystrophin-deficient mice. Eur J Orthod. , ciq113 (2010).
- Lever, T. E., et al. Videofluoroscopic Validation of a Translational Murine Model of Presbyphagia. Dysphagia. 30 (3), 328-342 (2015).
- Gantois, I., et al. Ablation of D1 dopamine receptor-expressing cells generates mice with seizures, dystonia, hyperactivity, and impaired oral behavior. Proc Natl Acad Sci. 104 (10), 4182-4187 (2007).
