Summary
Vi beskriver en kirurgisk prosedyre i en bedøvet rottemodell for å bestemme muskeltonen og viskoelastiske egenskaper av tungen. Prosedyren innebærer spesifikk stimulering av hypoglossal nerver og påføring av passive Lissajous kraft / deformasjonskurver til muskelen.
Abstract
Tungen er en svært innervert og vaskulær muskelhydrostat på gulvet i munnen til de fleste vertebrater. Dens primære funksjoner inkluderer støtte masticering og deglutition, samt smak-sensing og fonetikk. Følgelig kan styrken og volumet på tungen påvirke vertebratens evne til å oppnå grunnleggende aktiviteter som fôring, kommunikasjon og pusting. Menneskelige pasienter med søvnapné har forstørrede tunger, karakterisert ved redusert muskelton og økt intramuskulært fett som kan visualiseres og kvantifiseres ved magnetisk resonansbilder (MR). Evne til å måle kraftgenerering og viskoelastiske egenskaper av tungen er viktige verktøy for å skaffe funksjonell informasjon for å korrelere med bildedata. Her presenterer vi teknikker for måling av tungekraftproduksjon i bedøvede Zucker-rotter via elektrisk stimulering av hypoglossale nerver og for å bestemme viskoelastiske egenskaper oF tungen ved å bruke passive Lissajous kraft / deformasjonskurver.
Introduction
Tungen gir vesentlig støtte til masticering, avgrensning, smakfølelse og snakk. Tilstedeværelsen av ekstrinsic og indre muskulatur, med tydelig innervering og anatomi / funksjon, står for det unike ved denne muskulære hydrostat. Nylige fremskritt innen bildeteknikk har gitt et mer detaljert syn på sin komplekse anatomi 1 . Redusert tungefunksjonalitet, tungeatrofi, dysfagi og taleforstyrrelser er også vanlige manifestasjoner av myopatiske tilstander som Parkinson 2 , amyotrofisk lateral sklerose (ALS) 3 , myotonisk dystrofi (MD) 4 og andre myopatier.
Endringer i muskel sammensetning forbundet med vanlige sykdomstilstander påvirker de mekaniske og viskoelastiske egenskapene til tungen. For eksempel har funksjonell analyse av tungekraft avdekket endringer i kontraktile egenskaper forbundet med aldringSs = "xref"> 5 , 6 , hypoksi 7 , 8 og fedme 9 , 10 . I tilfelle av muskeldystrofi fører økt fibrose til høyere muskelstivhet, noe som betyr at det blir mindre overensstemmelse med deformasjon når en Lissajous deformasjonsprotokoll brukes 11 . Omvendt endrer endringer i muskelfettinnhold, som de som er dokumentert hos overvektige pasienter, både de metabolske 12 og mekaniske egenskapene til skjelettmuskel 13 , 14 og forventes å øke muskeloverensstemmelsen til deformasjon. Økt tungefett korrelerer også med utviklingen av obstruktiv søvnapné (OSA) hos mennesker 17 ved å øke tungevolumet til punktet for delvis øvre luftveis okklusjon (apné) 15 , 16 . SimIlarly til mennesker, har tungefettinfiltrasjon blitt dokumentert i obese Zucker-rotter 10 , noe som tyder på at denne modellen er et verdifullt verktøy for å studere effekten av fettinfiltrering på tungfysiologi.
Måling av tungekraft krever delikate kirurgiske teknikker for å isolere og bilateralt stimulere hypoglossale nerver 17 , 18 . Slike teknikker har tidligere blitt beskrevet i rotter 5 , 17 , 19 , 20 , kaniner 21 og mennesker 22 , 23 , men med begrensede visuelle hjelpemidler til etterforskeren. På grunn av sin høyteknologiske natur vil tilgjengeligheten av en detaljert protokoll forbedre tilgjengeligheten og reproduserbarheten av denne teknikken betydelig. Målet med vårt eksperimentelle paradigme er å sykeUstrate en gyldig og pålitelig teknikk for måling av styrke og viskoelastiske egenskaper av tungen i en rotte modell. For å oppnå dette blir rotten bedøvet, hypoglossale nerver blir eksponert og luftrøret er kanylert for å sikre fri adgang til dyrets tunge. En sutursløyfe kobler deretter spissen av tungen til en kraftgiver, som er i stand til å kontrollere både kraft og lengde, mens to bipolare krokelektroder stimulerer hypoglossale nerver til å indusere sammentrekning av tungen. Etter at kraftmåling er fullført, brukes kraftoverføringsenhetens lengdekontrollerende evner for raskt å forandre lengden på tungen, i henhold til en sinusbølgeprotokoll med faste amplitude (Lissajous-kurver), varighet og frekvens, slik at en kan utlede Dets viskoelastiske egenskaper 11 , 24 . Protokollen vil lede etterforskeren gjennom disseksjonstrinnene, posisjoneringen av dyret på den eksperimentelle plattformenRm, plassering av elektroder, og til slutt til oppkjøpet og analysene av kraft- og viskoelastisk data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer, inkludert dyrefag, er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Pennsylvania (protokoll nummer 805822). Den beskrevne prosedyre er terminal og krever ikke bruk av aseptiske forhold eller farmasøytiske kvalitetsprodukter.
1. Kirurgiske prosedyrer
Figur 1: Kirurgiske prosedyrer.
(A) Kirurgisk avgrensning. Den røde strekklinjen indikerer snittet. To svarte linjer indikerer kjeveposisjonen, mens den nederste svarte linjen markerer thoraxens posisjon. Den blå linjen indikerer hyoidbenet. (B) Eksponering av den bakre magen av den fordøyende muskelen (pilene) etter stumt disseksjon av fettvev, sublingualt og submaxill Ary kjertler. (C) Reseksjon av den bakre magen av den fordøyende muskelen (strekket grønn linje) for å avsløre hypoglossal nerve (hvit pil). (D) Hypoglossal nerve (hvit pil) ryddes fra den omkringliggende fasciaen. (E) Luftrøret eksponeres ved forsiktig å trekke ut glatt muskel rundt den (de grønne pilene indikerer retningen av kraften påført) og løftes (F) for å forberede seg på intubasjon. Stjernen indikerer tungenes innføring i hyoidbenet. Den grønne stiplede linjen markerer snittpunktet for intubasjonen. Den hvite pilen indikerer den løse knuten som er forberedt på å sikre kanylen på plass når den er satt inn. (G) Inndeling av luftrøret for kanylering. (H) Trakealkanylen er satt inn og festet på plass med en firkantet knute. (I) Påføring av sutur på tungen.Target = "_ blank"> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Anestesi og forberedelse til kirurgi
- Plasser rotte i induksjonskammeret med 4% isofluranbedøvelse.
- La dyret ligge over en varmekilde og opprettholde anestesi med 1 - 3% isofluran fra en nosekon, som sikrer en respiratorisk hastighet på minst 70 puste per minutt.
- Barber nakkeområdet med en air-clipper og hårfjerningskrem. Når du bruker hårfjerningskremet, spred kremet med en bomullstopp applikator til pelsen er fjernet. Langvarig eksponering for hårfjerningskrem kan forårsake irritasjon i huden.
- Rengjør det kirurgiske feltet med 70% alkohol ( figur 1A ).
- Kontroller dyrets pustemønster og reflekser (mangel på tårefleksrefleks) før du fortsetter med den første snittet. Den kontinuerlige overvåking og vurdering av dybden av anestesi er viktig (reLedningsrespirasjon og mangel på reflekser hver 10 min); Dyret må være under et dypt, kirurgisk plan for anestesi under hele prosedyren.
- Hypoglossal Nerves Identification
- Åpne det kirurgiske feltet med et par operasjonssaks ved å resektere og fjerne huden som angitt av den røde punktlinjen i figur 1A .
- Blunt dissekeres gjennom noe fettvev, sublinguale og submaxillære kjertler og muskellaget som omgir luftrøret.
MERK: Vær konservativ under disseksjonen. Bruk stump disseksjon når det er mulig og vær forsiktig så du ikke skader blodkarrene i nakken. - Identifiser den bakre magen til den fordøyende muskelen (PD) lateralt i luftrøret ( Figur 1B - hvite piler). Den hypoglossale nerven løper under denne muskelen ( Figur 1C - hvit pil). Med elektrocautery, resect PD proxImal til hyoidbenet ( figur 1C - strekket linje).
MERK: Ikke la nerven eller vevet rundt den bli tørr. Legg en dråpe mineralolje på nerveren for å beskytte den. For å unngå muskelsammentrekning på grunn av feltutbredelse av stimulusen fra elektrodene, må du forsiktig kauterisere muskelvevet i mulige kontaktsteder rundt nerveren. - Ved hjelp av et par fine tanger, disser hypoglossal nerve fra den omkringliggende fascia. Ved hjelp av en krok må du sørge for at minst 3 mm av nerve er tilgjengelig for tilkobling av den bipolare elektroden ( Figur 1D ).
- Ved hjelp av mikrohemostatiske tanger, knus hypoglossalnerven så distalt fra hyoidbenet ( Figur 1D - hvit pil) som mulig for å unngå retrograd forplantning av stimulus. Krymp nerven ved å trykke på den med de mikrohemostatiske tangene i 5 s. Når hemostat griper nerven, en kort tHeksen på bunnen av tungen skal være synlig.
- Gjenta prosedyren for den andre siden.
- Tracheal intubasjon
- Utsett luftrøret ved forsiktig å adskille de omkringliggende glatte muskler ved stump disseksjon ( Figur 1E - som indikert av de grønne pilene).
MERK: Vær konservativ og bruk fortrinnsvis stump disseksjon. Sammenlign diameteren av kanylen med den i luftrøret. Kanylen skal passe riktig i luftrøret og bør forbli stabilt satt inn etter at den er suget som beskrevet i trinn 1.3.2 til 1.3.5. - Løft forsiktig opp luftrøret ved hjelp av et par suturbindende tanger og passer en 4-0 sutur under den, nær thoraxen. Tie en innledende løs knute mellom 6. og 7. ring fra strupehodet ( Figur 1F - hvit pil). Denne knuten lukkes når kanylen er satt inn for å holde den på plass.
- Skyv stammen til aOverfør pipetten (smør pipetten med mineralolje for å lette innsetting) under luftrøret for å løfte den og lette innsatsen av kanylen (IV 14 gx 3,25 "kanyle).
- Kutt et lite snitt mellom fjerde og femte ringen fra strupehodet ( Figur 1G - hvit pil). Etter den første snittet vil åpningen ha en tendens til å spre seg, derfor vær konservativ når du gjør den første kuttet for å unngå fullstendig reseksjon av luftrøret.
MERK: Kontroller at kanylen er klar før anestesi-leveransen er på før du utfører snittet i luftrøret. - Start anestesiadministrasjonen gjennom kanylen og sett den forsiktig inn i snittet, og forsiktig forsiktig inn i luftrøret, lengden på ca. 5 ringer. Fest kanylen på plass med suturen, for å skape en lufttett tetning ( Figur 1H ).
MERK: Forsikre deg om at det ikke kommer væske inn i nakkesluken for å unngå suffocation. Når luftrøret er skåret, vil dyret puste romluft. Det er derfor viktig å raskt sette inn kanylen slik at leveransen av anestesien opprettholdes. Når / hvis du beveger dyret, må du kontrollere korrekt stilling av kanylen i luftrøret. - Fjern forsiktig dyret fra nesekonen.
MERK: Bruk av injiserbare bedøvelsesmidler i stedet for isofluran kan forenkle prosedyren ved å eliminere behovet for tracheal intubasjon og rydde det eksperimentelle arbeidsområdet fra overflødig slange.
- Utsett luftrøret ved forsiktig å adskille de omkringliggende glatte muskler ved stump disseksjon ( Figur 1E - som indikert av de grønne pilene).
- Tunge suturering
- Soak en 20 cm lang stykke 5/0 sutur (vi foreslår Silke, svart flettet) i PBS.
- Mens du holder rottens munn åpen, holder du forsiktig tungen med suturbindingspinnene.
- Pass suturen medialt gjennom spissen av tungen ( Figur 1I - hvit pil). Vær oppmerksom på å holde tungen fuktig med saltvann for å unngå potensielt vevskader.
- Fest en sløyfe ca 4 cm bred (diameteren kan endres basert på avstanden mellom dyret og kraftoverføreren).
MERK: Sørg for at suturen og tungen er våte for å lette innsetting og unngå unødvendige lesjoner av vevet.
2. Eksperimentell oppsett
Figur 2: Plassering og sikring av dyret.
(A) Musen er plassert på eksperimentell plattform. Kjeften er sikret og munnen holdes åpen ved anvendelse av vertikal spenning (grønn pil). Sutursløyfen er koblet til kraftoverføreren (hvit pil). (B) Elektrodene er koblet til. (C) Hver elektrode, montert på en mikromanipulator, er stabilt forbundet med nerven. Inlegget viser avslutningen av tHan hekte elektroden. (D) Den optimale lengden på tungen måles med en Vernier-tykkelse, fra innsatsen på nivået av hyoidbenet til spissen av tungen. I dette bildet ble elektrodene fjernet for klarhet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Merk: Plasser dyret på ryggen på apparatets oppvarmede brett, ved hjelp av følgende sikringsmålinger for å unngå bevegelse under forsøket.
- Sikre råttens nese til brettet med en plastbelagt metallisk vreng som er direkte forbundet med den oppvarmede plattformen ( figur 2A , 2B ).
- Opprettholde rottens munn åpnet ved å bruke vertikal spenning (bruk en 3-veis svivel knyttet til 9 kg testmonofilamentlinje og hold den på plass med en kamerastav) ( Figur 2A - grønn pil).
MERK: En alternativ tilnærming til stabilisering av rotte er å bruke en gnagemunngag eller en tilpasset modifikasjon av den. Det er viktig at munnen holdes åpen og stabil for å unngå bevegelser i nakken som kan påvirke kvaliteten på målingene. - Koble sutursløyfen til kraftoverføreren ( figur 2A - hvit pil).
- Ved å bruke kirurgisk tape, immobiliserer lemmer og buk i underlivet for å begrense bevegelsene under stimuleringene.
- Påfør de to stimulerende krokbipolare elektrodene til de dissekerte hypoglossale nerver, nært til crush-stedet ( figur 2C ).
- Bruk stimulerende bipolare elektroder skreddersydd av et par kirurgiske stål 29 gauge nålelektroder, holdt sammen i en avstand på 2 mm fra hverandre ved hjelp av en plaststøtte (her brukte vi to 1 ml serologiske pipetter festet sammen).
- Bøy nålelektrodene til en krokformLiten nok til å danne en stabil kontakt med nerveen (~ 1 mm diameter) ( figur 2C - innlegg).
- Koble de to ledningene til hver elektrode til et stablet dobbeltbindingspinne med banan jack x BNC jack, og koble deretter til stimulatormodulen til et in situ Muscle Test System (Tabell 3) ved hjelp av en BNC splitter.
MERK: Sørg for at dyret er stabilt og at nakken og tungen er justert til kraftoverføringsspaken. Fortsett å overvåke luftveiene og sørg for at begrensningene ikke forstyrrer åndedrettsvernet.
3. Optimal lengde (L 0 ) og maksimal isometrisk kraftbestemmelse
- Juster lengden på tungen gradvis og bruk isometriske strekkstimuleringer til en maksimal kraft er oppnådd.
- Definer L 0 som lengden der den isometriske kraftstyrken ( Tabell 1 ) er maksimal, og registrer for den etterfølgende normalisering avKraftmålingene, som det endres for hvert dyr. Ved hjelp av en Vernier-tykkelse måler du tungelengden fra innsatsen på nivået av hyoidbenet ( figur 2D ) til spissen av tungen.
MERK: Den riktige plasseringen av elektrodene er viktig for å sikre optimal kontakt med nerver. Optimal posisjonering bør utøve lignende og additiv krefter når de stimulerer en av de to nerver eller begge, henholdsvis.
- Definer L 0 som lengden der den isometriske kraftstyrken ( Tabell 1 ) er maksimal, og registrer for den etterfølgende normalisering avKraftmålingene, som det endres for hvert dyr. Ved hjelp av en Vernier-tykkelse måler du tungelengden fra innsatsen på nivået av hyoidbenet ( figur 2D ) til spissen av tungen.
- Før du starter eksperimentet, koble begge elektrodene til stimulatoren og administrer en teststansstimulering ( Tabell 1 ). Under denne sammentrekningen må du overvåke dyret for å sikre at stillingen er stabil, og kontroller for uønskede synlige sammentrekninger i nakke musklene.
- Mål isometrisk kraft ved å bruke en trik etterfulgt etter 20 s ved en tetanisk stimulering. Gjenta stimuleringene 3 ganger, slik at 4 minutter gjenopprettes mellom stimuleringssyklusene (en syklus inkluderer en tråkk og påE tetanisk stimulering), og registrer maksimale krøll- og tetaniske krefter.
- Opprettholde tungen vått til enhver tid ved å bruke noen dråper PBS mellom sammentrekninger.
MERK: Hvis halsmuskulaturen trekkes sammen, må du omhyggelig endre plasseringen av elektrodene slik at de ikke berører noe rundtliggende muskelvev og, om nødvendig, cauterize vevet i kontakt med elektrodene.
4. Viskoelastiske egenskaper Bestemmelse (Lissajouskurver)
- La tungen hvile i 3 - 5 min etter isometrisk kraftbestemmelse. Utfør Lissajous-kurver som begynner ved L 0 , derfor bør ikke dyrets og krafttransdusentens posisjon endres.
- Uten å stimulere hypoglossal nerver, bruk sykluser av passive strekker ( tabell 2 ) med økende forskyvning (d) dvs. 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50% av L 0 (høyere amplituder kan kreve en dobbel Modus kontrolleren med høyeR utfluktverdier enn 305C-LR). For eksempel vil en amplitude på 40% L 0 føre til deformasjon av tungen fra + 20% L 0 til -20% L 0 .
- Bruk fast 2 Hz sinusfrekvens med 10 repetisjoner i hver syklus, i en total varighet på 5 s hver syklus. Endringer av sinusfrekvensen har tidligere vært brukt med vev som membran 24 og kan bli vedtatt for å modifisere eksperimentell protokoll.
- Tillat 30 s mellom hver syklus og sørg for at tungen er våt under hele prosedyren.
MERK: Hold tungen våt under prosedyren og legg til noen dråper PBS. Forsikre deg om at fastholdingen som holder kjeften, forblir stabilt på plass under strekkene, spesielt når forskyvningen når 40% eller høyere.
- Umiddelbart etter ferdigstillelsen av forsøket, mens dyret fortsatt er under et dyp kirurgisk plan av anestesi, euthaniserer dyret i henhold til den godkjente IACUC-dyrprotesenocol. Dissect tungen for videre behandling ( dvs. frosset snitt eller lagring for biokjemiske analyser).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3: Representative resultater.
(A) Eksempler på vellykkede tråkk og tetanisk kraftspor. Tilsvarende stimulering er representert ved det røde sporet. (B) Eksempel på mislykkede tunge tetaniske sammentrekninger på grunn av submaximal sammentrekning (blå spor) og indirekte stimulering av nakke muskler. Begge forholdene kan forbedres ved å reposisjonere de stimulerende elektrodene eller unngå kontakten mellom elektrode-termineringene og det omgivende muskelvevet. (C) Eksempel på sinusbølgeforskyvning fra L0 (25% L0) som brukes til å bestemme viskoelastiske egenskaper av tungen. Gjennomsnittlig forlengelse (blå firkant) og forkortelse (grønn firkant) kan brukes til å beregne Peak-To-Peak force 24 . Den røde firkanten iDikterer området som vurderes for analysen (unntatt den første og den siste sinusbølgen). (D) Representasjon av kraft / forskyvningsforholdet som Lissajous-løkker, oppnådd økning av forskyvningen fra 5% til 50% L0. Området inne i hver løkke tilsvarer energitapet, definert som forskjellen mellom arbeidet på muskelen for å forlenge det og arbeidet som utføres av muskelen som det forkortes etter strekk 24 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Forventede verdier for tråkk og tetanic krefter i en 3 måneder gammel Zucker rotte (gjennomsnittlig kroppsvekt 400 g for mager og 700 g for obese Zucker rotter) er vist i Figur 3A . Den tetaniske kraften som utvikles etter stimulering, bør raskt toppe (svart pilehodet)Og senker sakte til stimuleringen stopper. Figur 3B viser eksempler på mislykkede sammentrekninger hvor kraftgenerasjonen ikke nådde et platånivå før stimulans slutten (blå linje - f.eks. Hvis tunge lengden ble satt til en verdi lavere enn L 0 , eller hvis dyrets overkropp ikke er Helt stabilisert), eller hvor stimulansen utløste sammentrekningen av nakke muskler (grønn linje). I de fleste tilfeller kan forsiktig reposisjonering av elektrodene forbedre sammentrekningen. Hvis nakke musklene synlig trekker seg under nervestimuleringen, kan du prøve å isolere ethvert kontaktpunkt mellom elektroder og muskelvev, enten ved å cauterizing muskelen eller ved å flytte elektrodene vekk fra den. Krafter kan normaliseres av volumet av tungen målt ved MR hvis dette er tilgjengelig. Et alternativ til bruk av volumetriske data er å normalisere mot tungens tyngde etter disseksjon.
figurene 3C og 3D . Figur 3C viser lengde- og kraftsporene separat, som når de kombineres som i Figur 3D, genererer de typiske Lissajous-løkke sporene. Det er viktig å sikre at tungen forblir våt mellom hver syklus ved å legge til noen dråper PBS. Økende forskyvning fra L 0 tilsvarer høyere passiv (arbeid utført på muskel under forlengelse) og aktiv (arbeid utført av muskelen under negative) krefter. Analysen av disse sporene kan være komplisert. En kurvemontering av maksimal gjennomsnittskraft og / eller midtpunkt for hver syklus kan brukes til å beskrive viskoelastiske egenskaper av tungen. En mer detaljert analyse av Lissajous arbeidsløkker er beskrevet av DA Syme 24 ved bruk avRåttemembranen.
| protokoll | Pulsspenning (V) | Pulsfrekvens (Hz) | Pulsbredde (ms) | Pulser per tog | Togvarighet (ms) |
| Rykke | 10 | 2500 | 0.2 | 1 | 0.2 |
| stivkrampe | 10 | 120 | 0.2 | 96 | 800 |
Tabell 1: Foreslåtte kontraksjonsstimuleringsparametere.
Isometrisk tregningskontraksjon oppnås ved bilateral nervestimulering med en enkelt elektrisk puls på 10V, som varer 0,2 ms. Etter 20 s oppnås en tetanisk isometrisk sammentrekning ved å stimulere bilateraltLy med et pulsspor (10 V, 120 Hz frekvens, for 800 ms). Trek / tetanus stimulering gjentas tre ganger med 3 - 5 min intervall mellom hver syklus. Den høyeste kvelden og høyeste tetaniske krefter fra de tre repetisjonene vurderes for analysen.
| Total avvik (d) fra L 0 (%) | Sin amplitude (% L 0 ) | Sinfrekvens (Hz) | Antall sykluser | Tid mellom sykluser |
| d | d / 2 | 2 | 10 | 30 |
Tabell 2: Lissajous-kurveparametre (Sinusformet avvik fra L 0 ).
Søknaden av LissajOus force / displacement protokollen begynner 3 - 5 min etter trøkk / tetanus stimulering. Hver syklus varer 5 s (10 repetisjoner ved 2 Hz frekvens) og utføres 30 s etter den forrige. % Forskyvningen fra L 0 (d) øker ved hver syklus, fra et vilkårlig minimum på 5% opp til 50% av L 0 . Høyere utflukter kan oppnås med andre kraftoverføringsmodeller ( tabell 3 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endringer i tungmetabolismen og / eller sammensetningen, f. Eks. Tungfettinfiltrering som følge av fedme, antas å forårsake kvantifiserbare endringer av parametrene vurdert av vår protokoll. Kvantifiseringen av tungekraft er av stor interesse, siden en ubalanse mellom fremspringende og retrusiv aktivitet eller generell tungevekst kan føre til okklusjon av øvre luftvei 15 . Treningsteknikker med sikte på å øke tunge styrke har blitt brukt med suksess i rotter 25 , 26 og også hos mennesker 27 , 28 , 29 , der de effektivt reduserte alvorlighetsgraden av søvnapné. I tillegg er hypoglossal nervestimulering nå en kirurgisk behandling for obstruktiv søvnapné 22 , 23 , 30 .
31 , søvnmedisin 10 , 25 og patogenesen av obstruktiv søvnapné 15 . Den beskrevne stimuleringsprotokollen og parametrene kan lett modifiseres for å oppnå annen fysiologisk informasjon, som for eksempel kraftfrekvensforhold, tretthet og utmattelseskapasitet, samt kinetikk av muskelkontraksjon som respons på stimulering.
Når den brukes uten stimuleringsfremkalte kraftmålinger, er den passive kraft / deformasjonsprotokollen vi beskriver, egnet for gjentatteAnalyse over tid, siden det ikke krever noen av de kirurgiske prosedyrene som brukes for nervestimulering og kraftmålinger, bortsett fra den minimalt invasive suturingen av tungen. I denne tilstanden kan den fysiologiske lengden av tungen beregnet av MR, brukes som referanse ( tabell 2 , parameter d) i stedet for den målte L 0 . For dette formål vil bruken av injiserbar anestesi eliminere behovet for tracheal intubasjon.
En begrensning av den nåværende tilnærmingen ligger i manglende evne til å skille mellom fremspringende og retrusive komponenter av tungenkontraksjonen. De stimulerende krokelektroder som beskrives i denne protokollen er plassert proksimalt til bifurkasjonen av nerveen, og forårsaker at hele tungen stimuleres til å stimuleres. Andre grupper har beskrevet bruk av silisiumnerven mansjettelektroder i rotter 19 , 32 eller kaniner 21 , som alLav selektiv tilgang og stimulering av en eller begge grener av hypoglossale nerver. I tillegg vil bruk av injiserbare anestetika i stedet for isofluraninhalasjon gi bedre tilgang til den submandibulære regionen der hypoglossal nerver grener seg.
Med praksis er denne protokollen gjeldende for mindre dyr som mus, der langt de fleste sykdomsmodeller er tilgjengelig. Spesielt er en serie musemodeller hvor tungenfysiologi endres, kjent 33 , 34 , 35 , 36 . Skaling ned vil kreve bruk av mindre kirurgiske verktøy, elektroder og trakealkanyler (hvis nødvendig), og eventuelt med en kraftgiver som er konstruert for lavere kraftområder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne undersøkelsen ble støttet av to National Institutes of Health Grants: HL089447 ("Fedme og OSA: Forstå betydningen av tunge fett og metabolisk funksjon") og HL094307 ("Forstå forholdet mellom fedme og tunge fett")
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SurgiSuite (heated Surgical tray) | Kent Scientific | SurgiSuite-LG | Includes heated platform |
| LED Lighting and Magnification Kit | Kent Scientific | SURGI- 5003 | |
| RC2 Rodent Circuit Controller | VetEquip | 922100 | |
| Isoflurane | Butler Schein Animal Health Supply | 29405 | |
| Alcohol Prep | Webcol | 6818 | |
| Cotton-tipped applicators | MediChoice | WOD1002 | |
| Hair clipper | Conair | ||
| Hair remover lotion | Nair | ||
| Medical tape | Transpore | 3M | |
| D-PBS | Corning | 21-030-CM | |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 503717-12 | |
| Hemostatic Forceps | Merit | 97-458 | Any tissue forceps can be used instead |
| Microdissecting Forceps, Angled, Serrated, 10.2 cm, SS | World Precision Instruments | 504479 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Blunt Micro Hook | Fine Science Tools | 10062-12 | |
| Microhemostat | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Thermal cautery | WPI | 501292 | Disposable cauteries are available at lower cost |
| IV 14g x 3.25" cannula | BD | B-D382268H | For tracheal cannulation |
| Braided silk non-absorbable suture size 4-0 | Harvard Apparatus | SP104 | For stabilization of the tracheal cannula |
| Braided non-absorbable silk 5/0 suture | Surgik LC, USA | ESILRC15387550 | For suturing the tongue |
| Plastic-coated metal twist-tie (or electrical wire) | For securing the rat's nose to the platform | ||
| Camera stick | |||
| 3 way-swivel and Trilene 9 Kg test monofilament line | Berkley | For securing the jaw and maintaining the mouth open | |
| Camera stick with adjustable angle | For supporting the 3 way-swivel and maintaining the mouth open. | ||
| in situ Muscle Test System | Aurora Scientific | 809C | This system is designed for mice and was modified by extending the platform. Alternatively the rat-specific 806D system can be used. |
| Dual-Mode Muscle lever (force transducer) | Aurora Scientific | 305C-LR | 309C offers higher excursion capabilities than 305C-LR. Link for more information and specifications: http://aurorascientific.com/products/muscle-physiology/dual-mode-muscle-levers/ |
| Needle Electrodes (surgical steel, 29 gauge) | AD Instruments | MLA1204 | 300C is recommended for use in mice. |
| Magnetic Stands | World Precision Instruments | M10 | Used for making the bipolar stimulating hook electrodes |
| Kite Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R and KITE-L | Require a steel plate |
| Stackable Double Binding Post with Banana Jack x BNC Jack | McMaster Carr | 6704K13 | |
| Carbon fiber composites digital caliper | VWR | 36934-152 |
References
- Sanders, I., Mu, L. A three-dimensional atlas of human tongue muscles. Anat Rec (Hoboken). 296 (7), 1102-1114 (2013).
- Ciucci, M. R., et al. Tongue force and timing deficits in a rat model of Parkinson disease. Behav Brain Res. 222 (2), 315-320 (2011).
- Easterling, C., Antinoja, J., Cashin, S., Barkhaus, P. E. Changes in tongue pressure, pulmonary function, and salivary flow in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Dysphagia. 28 (2), 217-225 (2013).
- Wang, Z. J., Huang, X. S. Images in clinical medicine. Myotonia of the tongue. N Engl J Med. 365 (15), e32 (2011).
- Ota, F., Connor, N. P., Konopacki, R. Alterations in contractile properties of tongue muscles in old rats. Ann Otol Rhinol Laryngol. 114 (10), 799-803 (2005).
- Schwarz, E. C., Thompson, J. M., Connor, N. P., Behan, M. The Effects of Aging on Hypoglossal Motoneurons in Rats. Dysphagia. 24 (1), 40 (2008).
- Pae, E. -K., Wu, J., Nguyen, D., Monti, R., Harper, R. M. Geniohyoid muscle properties and myosin heavy chain composition are altered after short-term intermittent hypoxic exposure. J Appl Physiol. 98 (3), 889-894 (2005).
- Fuller, D. D., Fregosi, R. F. Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia. J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).
- Ray, A. D., Farkas, G. A., Pendergast, D. R. In-situ mechanical characteristics of the tongue are not altered in the obese Zucker rat. Sleep. 32 (7), 957 (2009).
- Brennick, M. J., et al. Tongue fat infiltration in obese versus lean Zucker rats. Sleep. 37 (6), 1095-1102 (2014).
- Stedman, H. H., Sweeney, H. L., Shrager, J. B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy. Nature. 352 (6335), 536-539 (1991).
- Goodpaster, B. H., Wolf, D. Skeletal muscle lipid accumulation in obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes. Pediatr Diabetes. 5 (4), 219-226 (2004).
- Loro, E., et al. IL-15Rα is a determinant of muscle fuel utilization, and its loss protects against obesity. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (8), R835-R844 (2015).
- Rahemi, H., Nigam, N., Wakeling, J. M. The effect of intramuscular fat on skeletal muscle mechanics: implications for the elderly and obese. J R Soc Interface. 12 (109), 20150365 (2015).
- Kim, A. M., et al. Tongue fat and its relationship to obstructive sleep apnea. Sleep. 37 (10), 1639-1648 (2014).
- Kim, A. M., et al. Metabolic activity of the tongue in obstructive sleep apnea. A novel application of FDG positron emission tomography imaging. Am J Respir Crit Care Med. 189 (11), 1416-1425 (2014).
- Gilliam, E. E., Goldberg, S. J. Contractile properties of the tongue muscles: effects of hypoglossal nerve and extracellular motoneuron stimulation in rat. J Neurophysiol. 74 (2), 547-555 (1995).
- Sokoloff, A. J. Localization and contractile properties of intrinsic longitudinal motor units of the rat tongue. J Neurophysiol. 84 (2), 827-835 (2000).
- Becker, B. J., Russell, J. A., Connor, N. P. Effects of aging on evoked retrusive tongue actions. Arch Oral Biol. 60 (6), 966-971 (2015).
- Connor, N. P., et al. Tongue muscle plasticity following hypoglossal nerve stimulation in aged rats. Muscle Nerve. 47 (2), 230-240 (2013).
- Seo, J., et al. Nerve cuff electrode using embedded magnets and its application to hypoglossal nerve stimulation. J Neural Eng. 13 (6), 066014 (2016).
- Friedman, M., et al. Targeted hypoglossal nerve stimulation for the treatment of obstructive sleep apnea: Six-month results. Laryngoscope. 126 (11), 2618-2623 (2016).
- Heiser, C., Maurer, J. T., Steffen, A. Functional outcome of tongue motions with selective hypoglossal nerve stimulation in patients with obstructive sleep apnea. Sleep Breath. 20 (2), 553-560 (2016).
- Syme, D. A. Passive viscoelastic work of isolated rat, Rattus norvegicus, diaphragm muscle. J Physiol. 424, 301-315 (1990).
- Connor, N. P., et al. Effect of tongue exercise on protrusive force and muscle fiber area in aging rats. J Speech Lang Hear Res. 52 (3), 732-744 (2009).
- Schaser, A. J., Stang, K., Connor, N. P., Behan, M. The effect of age and tongue exercise on BDNF and TrkB in the hypoglossal nucleus of rats. Behav Brain Res. 226 (1), 235-241 (2012).
- Puhan, M. A., et al. Didgeridoo playing as alternative treatment for obstructive sleep apnea syndrome: randomised controlled trial. BMJ. 332 (7536), 266-270 (2006).
- Guimarães, K. C., Drager, L. F., Genta, P. R., Marcondes, B. F., Lorenzi-Filho, G. Effects of oropharyngeal exercises on patients with moderate obstructive sleep apnea syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 179 (10), 962-966 (2009).
- Ueda, H., Almeida, F. R., Chen, H., Lowe, A. A. Effect of 2 jaw exercises on occlusal function in patients with obstructive sleep apnea during oral appliance therapy: a randomized controlled trial. Am J Orthod Dentofacial Orthop. 135 (4), 430 (2009).
- Strollo, P. J., et al. Upper-airway stimulation for obstructive sleep apnea. N Engl J Med. 370 (2), 139-149 (2014).
- Perrier, P., Payan, Y., Zandipour, M., Perkell, J. Influences of tongue biomechanics on speech movements during the production of velar stop consonants: A modeling study. J Acoust Soc Am. 114 (3), 1582-1599 (2003).
- Connor, N. P., et al. Tongue muscle plasticity following hypoglossal nerve stimulation in aged rats. Muscle & nerve. 47 (2), 230-240 (2013).
- Brady, J. P., et al. AlphaB-crystallin in lens development and muscle integrity: a gene knockout approach. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (12), 2924-2934 (2001).
- Spassov, A., et al. Differential expression of myosin heavy chain isoforms in the masticatory muscles of dystrophin-deficient mice. Eur J Orthod. , ciq113 (2010).
- Lever, T. E., et al. Videofluoroscopic Validation of a Translational Murine Model of Presbyphagia. Dysphagia. 30 (3), 328-342 (2015).
- Gantois, I., et al. Ablation of D1 dopamine receptor-expressing cells generates mice with seizures, dystonia, hyperactivity, and impaired oral behavior. Proc Natl Acad Sci. 104 (10), 4182-4187 (2007).
