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Neuroscience

मॉडलिंग Amyloid-β ४२ विषाक्तता और वयस्क Zebrafish मस्तिष्क में Neurodegeneration

Published: October 25, 2017 doi: 10.3791/56014
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3, 2, 1,3
1German Centre for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Dresden within Helmholtz Association, 2B CUBE, Center for Molecular Bioengineering, Technische Universität Dresden, 3Center for Regenerative Therapies Dresden (CRTD), TU Dresden

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन संश्लेषण, लक्षण वर्णन, और monomeric amyloid के इंजेक्शन-β ४२ पेप्टाइड्स वयस्क zebrafish में amyloid विषाक्तता पैदा करने के लिए एक अल्जाइमर रोग मॉडल स्थापित करने के लिए, इसके बाद ऊतकीय विश्लेषण और का पता लगाने के द्वारा aggregations.

Abstract

अल्जाइमर रोग (AD) एक दुर्बल neurodegenerative रोग है जिसमें विषाक्त amyloid का संचय-β ४२ (aβ ४२) पेप्टाइड्स synaptic अध..., सूजन, ंयूरॉन मौत, और सीखने घाटे की ओर जाता है । मनुष्य प्रफलन क्षमता के कारण भाग में विज्ञापन के मामले में खो ंयूरॉंस को पुनर्जीवित नहीं कर सकते तंत्रिका स्टेम/जनक कोशिकाओं (NSPCs) और कम neurogenesis । इसलिए, कुशल अपक्षयी उपचारों को भी NSPCs के प्रसार और तंत्रिकाजन्य क्षमता में वृद्धि करनी चाहिए. Zebrafish (ढाणियो rerio) एक अपक्षयी जीव है, और हम बुनियादी आणविक कार्यक्रमों के साथ जो हम डिजाइन सकता है सीख सकते है चिकित्सीय दृष्टिकोण विज्ञापन से निपटने के लिए । इस कारण से, zebrafish में एक विज्ञापन की तरह मॉडल की पीढ़ी के लिए आवश्यक था । हमारी कार्यप्रणाली का प्रयोग, हम वयस्क zebrafish मस्तिष्क में ऊतक मर्मज्ञ क्षमता के साथ aβ ४२ पेप्टाइड के सिंथेटिक डेरिवेटिव शुरू कर सकते हैं, और रोग विकृति और अपक्षयी प्रतिक्रिया का विश्लेषण । मौजूदा तरीकों या पशु मॉडलों पर लाभ यह है कि zebrafish हमें सिखाने कैसे एक हड्डीवाला मस्तिष्क स्वाभाविक रूप से पुनर्जीवित कर सकते हैं, कर सकते है और इस तरह हमें अंतर्जात NSPCs लक्ष्यीकरण द्वारा मानव neurodegenerative रोगों के इलाज के लिए बेहतर मदद करते हैं । इसलिए, वयस्क zebrafish मस्तिष्क में स्थापित amyloid-विषाक्तता मॉडल तंत्रिका विज्ञान और नैदानिक चिकित्सा के क्षेत्र में अनुसंधान के लिए नए रास्ते खोल सकते हैं । इसके अतिरिक्त, इस विधि के सरल निष्पादन लागत प्रभावी और कुशल प्रयोगात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । इस पांडुलिपि संश्लेषण और zebrafish मस्तिष्क में aβ ४२ पेप्टाइड्स के इंजेक्शन का वर्णन है ।

Introduction

विज्ञापन एक पुरानी प्रगतिशील मस्तिष्क प्रांतस्था में न्यूरॉन्स और synapses के नुकसान की विशेषता रोग है1,2,3,4,5। विज्ञापन की शास्त्रीय neuropathological पहचान amyloid पेप्टाइड्स और neurofibrillary पेचीदा (NFTs)6के गठन का जमाव कर रहे हैं । बूढ़ा सजीले टुकड़े भी amyloid सजीले टुकड़े के रूप में जाना जाता है, amyloid-β (Aβ) पेप्टाइड्स कि मस्तिष्क pleated5में β-पैरेन्काइमा संरचनाओं फार्म से बना रहे हैं । विज्ञापन रोगियों में ४२ aβ का संचय रोग प्रगति में एक प्रारंभिक और महत्वपूर्ण भूमिका है । विज्ञापन synaptic शिथिलता, बिगड़ा प्लास्टिक के लिए अग्रणी घटनाओं का झरना चलाता है, और ंयूरॉन हानि7,8,9,10।

teleost zebrafish के वयस्क मस्तिष्क एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में कार्य करता है स्टेम सेल प्लास्टिक 11,12,13,14,15के विनियमन का अध्ययन 16,17,18,19,20 और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में विज्ञापन21,22,23 सहित विभिन्न रोगों ,24. उपलब्ध प्रायोगिक तरीकों की एक विशाल सरणी के कारण19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, इन अध्ययनों जानकारीपूर्ण और व्यवहार्य हैं । Zebrafish सीएनएस13,15,३२,३३,३४,३५,३६,३७की भरपाई कर सकते हैं, ३८, आण्विक के बाद सक्रिय कार्यक्रमों का उपयोग करके भाग में19,३९,४०,४१,४२,४३, ४४. इसलिए, zebrafish में एक neurodegenerative रोग मॉडल स्थापित करने में मदद कर सकते है उपंयास के बारे में प्रश्न के बारे में पता करने की क्षमता और स्टेम सेल जीवविज्ञान हड्डीवाला दिमाग में ।

हाल ही में, हम सिंथेटिक aβ ४२ पेप्टाइड्स (तालिका 1)३९इंजेक्शन द्वारा वयस्क zebrafish मस्तिष्क में एक amyloid विषाक्तता मॉडल विकसित की है । इस इंजेक्शन neurodegeneration phenotypes मानव मस्तिष्क विकृति की याद ताजा (जैसे, कोशिका मृत्यु, microglial सक्रियण, synaptic अध कि, और स्मृति घाटे), यह दर्शाता है कि zebrafish के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है neurodegeneration zebrafish मस्तिष्क में, aβ ४२ पेप्टाइड्स immunohistochemical दाग के साथ पता लगाया जा सकता है, और वयस्क zebrafish सीएनएस में पुनर्जनन के आणविक तंत्र३९पहचाना जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में, हम एक cerebroventricular इंजेक्शन (CVMI) विधि का उपयोग कर zebrafish मस्तिष्क में सिंथेटिक amyloid पेप्टाइड्स के इंजेक्शन का प्रदर्शन27,३९,४५,४६ amyloid साठा (चित्र 1) को नक़ल करने के लिए । CVMI, β-शीट संरचनाओं के रूप में इंजेक्शन पर कुल जो पेप्टाइड्स, वितरित करने का एक उपंयास रास्ता प्रदान करता है और विषाक्तता डालती । पेप्टाइड्स समान रूप से मस्तिष्क भर में वितरित कर रहे हैं, पूरे rostro-caudal अक्ष४५के साथ वेंट्रिकुलर क्षेत्र को लक्षित । इसके अतिरिक्त, इस विधि का विश्लेषण के लिए अनुमति देता है रूपात्मक और NSPCs के आणविक प्रतिक्रिया वयस्क zebrafish मस्तिष्क में निंनलिखित amyloid समावेशन । इस तरह के अध्ययनों से हमें स्तनधारियों में सफल मस्तिष्क की मरंमत के लिए एक अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा । हमारे विधि विज्ञापन के बाद एक सफल पुनर्जनन प्रतिक्रिया के आवश्यक आणविक तंत्र को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लक्षण की तरह खो ंयूरॉंस और कार्यात्मक वसूली की भरपाई के लिए प्रेरित ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > यह प्रोटोकॉल एक मानक प्रक्रिया यूरोपीय संघ के दिशानिर्देशों (2010/63) और कार्ल्सृहे Insitute प्रौद्योगिकी (किट) में जीवविज्ञान और चिकित्सा (EuFishBioMed) में मछली मॉडल के लिए यूरोपीय समाज द्वारा सुझाए गए हैं । यहां के बाद बताई गई सभी विधियों को एथिक्स कमीशन द्वारा अनुमोदित कर दिया गया है (Landesdirektion ड्रेसडेन; दस्तावेज़ संख्या TVV-52/

< p class = "jove_title" > 1. A & #946 की तैयारी; ४२ पेप्टाइड

  1. संश्लेषित पेप्टाइड्स (देखें तालिका 1 ) 2 के साथ मानक 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) रसायन विज्ञान का उपयोग-(1-benzotriazol-1-yl)-१, १, ३, ३- tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) एक स्वचालित ठोस चरण पेप्टाइड सिंथेसाइज़र पर युग्मन एजेंट के रूप में < सुप वर्ग = "xref" > ५२ . संश्लेषण का पैमाना था १०० & #181; मॉल.
  2. ठोस चरण (०.२ mmol की लोडिंग क्षमता) के रूप में Fmoc-संरक्षित राल के ५०० मिलीग्राम के साथ स्वचालित पेप्टाइड सिंथेसाइज़र लोड । आवश्यक मात्रा में एक एकाग्रता ०.५ मीटर पर भंग Fmoc-संरक्षित अमीनो एसिड लोड और के रूप में संबंधित सिंथेसाइज़र के लिए गणना की.
    नोट: गणना सक्षम करने के लिए प्रत्येक Fmoc के युग्मन-एमिनो एसिड दो बार के साथ 5 बार प्रत्येक इमारत ब्लॉक के अधिक राल के लिए कर रहे है < सुप वर्ग = "xref" > ४७ .
  3. dimethlyformamide (DMF) में पेप्टाइड संश्लेषण के लिए आवश्यक रिएजेंट भंग । उदाहरण के लिए, ०.४८ M, ४५% v/v N-Methylmorpholine (NMM) (आधार), और 5% v/v एसिटिक एनहाइड्राइड (कैपिंग मिश्रण) की एकाग्रता पर उत्प्रेरक, HBTU, तैयार गैर-प्रतिक्रिया अमीनो समूहों को कैप करने के लिए ।
  4. लगातार ठोस समर्थन एक ताजा तैयार दरार Trifluoroacetic एसिड (TFA) से मिलकर मिश्रण में एक आंदोलनकारी का उपयोग कर मिश्रण से राल से सभी पेप्टाइड्स सट: Triisopropylsilane (टिज सें): जल: Dithiothreitol (डीटीटी) at ९० (v/v): 5 (v/v): २.५ (v/v): २.५ (m/v), के लिए 4 ज. का संश्लेषण स्केल के लिए 10 मिलीलीटर का प्रयोग करें १०० & #181; मॉल.
  5. १०० मिलीलीटर बर्फ ठंडा diethyl ईथर के लिए दरार मिश्रण जोड़कर सट उत्पाद हाला । ०.४५ & #181 के एक ताकना आकार के साथ एक Polytetrafluoroethylene (PTFE) फिल्टर युक्त एक निस्पंदन इकाई के माध्यम से दर्रा; एम और 20 मिलीलीटर बर्फ के साथ धो-शीत diethyl ईथर.
  6. फिल्टर कागज से फ़िल्टर पेप्टाइड इकट्ठा करने और भंग १०० 5 मिलीलीटर आसुत जल में उपजी पेप्टाइड की मिलीग्राम: 1:1.
    7. पर acetonitrile ।
  7. के माध्यम से शुद्ध-चरण उच्च दाब तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) पर एक अर्द्ध preparative HPLC मनका आकार के छिद्रीय polystyrene divinylbenzene स्तम्भ से सुसज्जित 10 & #181; m.
    1. स्तंभ को पहले से गरम करें और ५० & #176; C स्तंभ हीटिंग डिवाइस का उपयोग करके बनाए रखें । 5% से १००% विलायक B पर 25 मिनट से 4 मिलीलीटर/
      पर एक ढाल लागू करके एक स्वचालित अंश कलेक्टर का उपयोग कर सभी प्रमुख भागों लीजिए नोट: विलायक A है ०.१% TFA में पानी और विलायक B है ०.१% TFA acetonitrile < सुप वर्ग = "xref" > ५२ .
    2. २२० एनएम पर वर्णलेख की निगरानी, उपयुक्त चोटियों इकट्ठा, और नियंत्रण रेखा का उपयोग कर विश्लेषण-MS.
  8. विश्लेषणात्मक रिवर्स चरण अल्ट्रा उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (UPLC) द्वारा २२० एनएम में एक यूवी डिटेक्टर के साथ निरीक्षण करते समय एक विश्लेषणात्मक C18 कॉलम (मनका आकार १.७ & #181; m) के माध्यम से नमूना पारित द्वारा शुद्धता की पुष्टि करें । मास स्पेक्ट्रोमेट्री.
    द्वारा पेप्टाइड उत्पाद की पुष्टि करें नोट: UPLC एक electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ईएसआई-MS) और मिलकर Quadrupole डिटेक्टर के लिए युग्मित है.
  9. Lyophilize एक गोल नीचे कुप्पी में वांछित पेप्टाइड के सही अंशों, ०.०५२ mbar के एक निर्वात को लागू करने के द्वारा, एक शराबी पाउडर के लिए. युगल वैक्यूम पंप पर एक फ्रीजिंग यूनिट को बनाए रखा-७८ & #176; ग. स्टोर at-८० & #176; c, अनिश्चितकाल.
  10. का उपयोग करें lyophilized पेप्टाइड का एक शेयर समाधान तैयार करने के लिए 1 मिमी के एक मिश्रण में acetonitrile: DMF: विश्लेषणात्मक ग्रेड पानी पर 1:1:1 प्रयोगों के लिए. इस समाधान के लिए संग्रहीत किया जा सकता कम से 6 महीने, के रूप में पेप्टाइड्स इस समाधान में समग्र नहीं है ।
< p class = "jove_title" > 2. इंजेक्शन मिश्रण की तैयारी

  1. तैयार फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) (१३७ mm NaCl, २.७ mm KCl, 10 mm Na 2 HPO 4 , 2 मिमी KH 2 PO 4 , पीएच ७.४) कमजोर के लिए lyophilized पेप्टाइड्स.
  2. 20 & #181 के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पेप्टाइड भंग, पंजाब में एम । इस समाधान को ताजा तैयार करें । अच्छी तरह से मिलाएं और इंजेक्शन तक बर्फ पर स्टोर । समाधान में एकत्रीकरण को रोकने के लिए 30 मिनट से अधिक न करें ।
< p class = "jove_title" > 3. संज्ञाहरण

  1. निश्चेतक के शेयर समाधान तैयार, ०.१% एथिल-m-aminobenzoate methanesulphonate (MESAB), नियमित रूप से मछली के पानी में परिसंचारी प्रणाली से । ०.००२५% (v/v) के अंतिम एकाग्रता के लिए anaesthetization समाधान तैयार करें ।
  2. प्रणाली पानी की 5 एल के साथ एक परिवहन कंटेनर में अपने टैंक से मछली की वांछित संख्या को हटा दें ।
  3. आधा-४० मिलीलीटर निश्चेतक के साथ एक प्लास्टिक पेट्री डिश (९० मिमी) भरें । इंजेक्शन के लिए इस डिश का इस्तेमाल करें ।
  4. opercular आंदोलन रह गया है जब तक निश्चेतक में मछली की मशीन ।
< p class = "jove_title" > 4. Cerebroventricular Microinjection

  1. इंजेक्शन उपकरण की तैयारी
    1. कांच इंजेक्शन केशिकाओं निम्नलिखित मापदंडों के साथ एक सुई खींचने का उपयोग कर तैयार: हीटिंग चक्र, ५३७; पुलिंग चक्र, २५०; वेग, १.५ s; समय, ८० ms.
    2. दबाव स्रोत पर 25 साई के लिए दबाव सेटिंग लाने के लिए ।
    3. निंन करने के लिए microinjector पैरामीटर सेट करें: दबाव 20 psi रखें; दबाव 10 psi बाहर निकालें; अवधि मान २.५; गेटिंग मान १०० ms.
    4. इंजेक्शन समाधान के साथ कांच केशिका लोड । microinjection धारक में कांच केशिका डालें । इंजेक्शन कोण को समायोजित करें ४५ & #176;.
      नोट: अधिक विस्तृत प्रोटोकॉल संदर्भ में वर्णित के रूप में पाया जा सकता है < सुप वर्ग = "xref" > २७ , < सुप वर्ग = "xref" > ४६ .
  2. एक नई पेट्री anaesthetization समाधान (३.३ कदम के रूप में) के साथ भरा पकवान में एक मछली जगह ।
  3. इंजेक्शन के लिए संदंश और ओरिएंट के साथ मछली पकड़ो ।
  4. एक भट्ठा उत्पंन ऑप्टिक tectum पर खोपड़ी में एक 30 जी सुई की नोक का उपयोग कर जहां दो पार्श्व प्लेटें मिलते हैं । मस्तिष्क के ऊतकों में टिप डालने मत करो, यह खून बह रहा है और नुकसान का कारण होगा । संदर्भ देखें < सुप वर्ग = "xref" > 27 , < सुप वर्ग = "xref" > ४५ , < सुप क्लास = "xref" > ४६ अतिरिक्त माहिती.
  5. कांच केशिका भट्ठा में डालें.
    1. सुई के केवल टिप का उपयोग करें और खोपड़ी के माध्यम से अधिक से अधिक 1 मिमी घुसना नहीं है । मछली पकड़ रखो और चीरा साइट के माध्यम से कांच केशिका की नोक डालें ।
    2. ओरिएंट एक ४५ & #176; कोण पर telencephalon की ओर कांच केशिकाओं की नोक । इंजेक्षन 1 & #181; L समाधान का. इंजेक्शन के तुरंत बाद तरल उड़कर.
< p class = "jove_title" > 5. वसूली

  1. मछली एक परिवहन कंटेनर को वापस जगह जब तक यह ठीक करता है । नियमित रूप से घूम मछली पानी इष्टतम पानी की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए कंटेनर कनेक्ट ।
    नोट: वसूली आम तौर पर 1 मिनट ले जाना चाहिए । यदि यह अब लेता है, मछली एक छोटे समय के लिए निश्चेतक में रखा जाना चाहिए (इस प्रयोगकर्ता द्वारा अनुकूलित करने की जरूरत है) ।
    2. < p class = "jove_title" > 6. टिशू तैयार करने और खोदी गई

    1. मछली का त्याग करने से पहले एक वांछित अवधि के लिए प्रतीक्षा करें ।
      नोट: यह प्रयोगात्मक प्रश्न पर निर्भर करता है । Amyloid साठा इंजेक्शन के बाद के रूप में 1 दिन के रूप में जल्दी देखा जा सकता है ।
    2. बलिदान नैतिक नियमों ( जैसे के आधार पर उपयुक्त विधि का उपयोग कर मछली, ०.१ एम MESAB के साथ मछली का इलाज) ।
    3. कट ऑप्टिक tectum ऊपर खोपड़ी पृष्ठीय पक्ष पर बताया forcep का उपयोग कर खोलने के लिए, और बस कवच फिन के पीछे सिर टुकड़े एक स्केलपेल का उपयोग कर ।
    4. 2% paraformaldehyde (पीएफए) का उपयोग कर सिर को ठीक रात में 4 & #176; C. एक पेंच ढक्कन के साथ एक प्लास्टिक ट्यूब में प्रति सिर पीएफए के 3 मिलीलीटर का उपयोग करें ।
      चेतावनी: उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते है जब हैंडलिंग पीएफए.
      5. cryoprotection और decalcification के लिए
    5. , 0.1 m फास्फेट बफर (पीएच ७.४) में तीन बार सिर धोने, तो उन्हें 20% सुक्रोज में स्थानांतरण/20% ethylenediaminetetraacetic (EDTA) समाधान और रात भर में 4 & #176; C.
    6. राल को खोदी में ऊतक एंबेड करने के लिए, ७.५% जिलेटिन में सिर फ्रीज/सूखी बर्फ पर प्लास्टिक प्रोटोकॉल मोल्ड में सुक्रोज समाधान (लगभग 3-5 एक ब्लॉक फ्रीज करने के लिए मिनट) । नमूनों की दुकान पर-८० & #176; C या अगले चरण (cryosectioning) पर जारी रखें.
    7. धारा 12 म & #181; m थिक cryosections का उपयोग कर एक cryostat के रूप में वर्णित < सुप class = "xref" > 28 , < सुप class = "xref" > 42 . cryosections को सीधे ग्लास स्लाइड पर ट्रांसफ़र करें और स्टोर पर-20 & #176; C लंबी अवधि के उपयोग के लिए ।
    < p class = "jove_title" > 7. Immunohistochemical धुंधला और माइक्रोस्कोपी

    < p class = "jove_content" > नोट: एक humidified चैंबर में सभी गर्मी चरणों प्रदर्शन. और, सभी धुलाई कदम 10 मिनट प्रत्येक के लिए कर रहे हैं ।

    1. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए वर्गों सूखी । गल जाने के बाद, पंजाब में दो बार वर्गों और PBSTx (०.०३% ट्राइटन-X-१००) के साथ पंजाब में एकबार धो लें ।
      2. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ
    2. मशीन (anti-A & #946; ४२ एंटीबॉडी; 1:500 PBSTx में कमजोर पड़ने पर) 4 & #176; ग रात भर. & #160; अगले दिन, पंजाब में एक बार और PBSTx में दो बार धो लो ।
    3. माध्यमिक एंटीबॉडी (प्रतिदीप्ति युग्मित डिटेक्शन, 1:500 कमजोर पड़ने) के साथ वर्गों के साथ DAPI (1 & #956; जी/एमएल) PBSTx में 2 ज के लिए कमरे के तापमान पर ।
      4. PBSTx में तीन बार
    4. धो लें । अंतिम धुलाई के बाद, स्लाइड को एक coverslip & #160 के साथ माउंट करें; प्रयोग १०० & #956; L ७०% ग्लिसरॉल.
    5. (४८८ उत्तेजना रेंज और एक मानक हरी फिल्टर के साथ 20X PL एपीओ एनए ०.७ उद्देश्य के साथ उदाहरण के लिए) एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर फ्लोरोसेंट छवियों का अधिग्रहण; < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा २ ) < सुप वर्ग = "xref" > ३९ .

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Representative Results

HPLC को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया था पेप्टाइड और मास स्पेक्ट्रोमेट्री शुद्ध amyloid β पेप्टाइड्स की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया है. HPLC कॉलम ५० डिग्री सेल्सियस के लिए गरम किया गया था Aβ पेप्टाइड्स की जुदाई में सुधार और सभी भागों एकत्र किए गए । सही संश्लेषित पेप्टाइड की पहचान करने के लिए, मास स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण सभी अंशों के लिए किया गया था । UPLC वर्णलेख यौगिक की पवित्रता को दर्शाता है । HPLC अंश है कि UPLC पर एक चोटी की उपज (यानी, सही द्रव्यमान के लिए आवश्यक amyloid β पेप्टाइड के अनुपात चार्ज) आगे प्रयोगों के लिए संसाधित किया गया था (चित्रा 2).

समुच्चय बनाने में पेप्टाइड्स की कार्यक्षमता विभिन्न स्पेक्ट्रोस्कोपी तरीकों का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है३९,४८,४९, और भी अधिक 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर पंजाब में पेप्टाइड्स मशीन द्वारा, जो होगा उपज समुच्चय । इस मामले में, हाला और बड़े समुच्चय समाधान में देखा जाना चाहिए ।

cerebroventricular microinjection के बाद, मस्तिष्क में कुल पेप्टाइड्स और फार्म amyloid जमाव (चित्रा 3). इन समुच्चय ज्यादातर intracellular जमाव के रूप में देखा जाता है, लेकिन यह भी रक्त वाहिकाओं के आसपास । इस तरह के एकत्रीकरण ऊतक में amyloid पेप्टाइड्स के एक सफल संचय के संकेत हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: पेप्टाइड संश्लेषण के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, शुद्धि, इंजेक्शन, और विश्लेषण. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: देशी amyloid के लक्षण वर्णन-β ४२ पेप्टाइड. देशी amyloid के मास स्पेक्ट्रोमेट्री लक्षण वर्णन-β ४२ पेप्टाइड (A) और CPP-टैग amyloid-β ४२ पेप्टाइड (TR-aβ ४२; ख). (ग) के chromatograph शुद्ध, देशी, और TR-aβ ४२ पेप्टाइड पर अल्ट्रा उच्च दाब तरल क्रोमैटोग्राफी (UPLC) । X-अक्षेस को मास-चार्ज अनुपात (m/z) (A, B) और मिनट में रेफरेंस टाइम (C) निरूपित करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: इंजेक्शन के बाद एक वयस्क zebrafish मस्तिष्क धारा 1 दिन में amyloid जमाव के Immunohistochemical धुंधला । aβ ४२ हरे रंग में है, और नाभिक नीले रंग में हैं । ग्रीन क्लस्टर की पहचान कुशल aβ ४२ एकत्रीकरण इंगित करता है । स्केल बार्स = १०० µm । यह आंकड़ा३९संदर्भ से संशोधित किया गया है ।

पेप्टाइड पेप्टाइड अनुक्रम मेगावाट (जी/
aβ ४२ DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA ४५१४.१
TR-aβ ४२ GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA ५९१९.८

तालिका 1: aβ ४२ और TR-aβ ४२ पेप्टाइड अनुक्रम ।

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Discussion

amyloid पेप्टाइड्स अनुक्रम भिन्नता या विभिन्न टैग को शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक तले amyloid पेप्टाइड उत्पंन किया जा सकता है, और पेप्टाइड्स पेप्टाइड अंत के N-टर्मिनस पर फ्लोरोसेंट टैग के साथ लेबल किया जा सकता है या वाहक पेप्टाइड्स के साथ टैग३९। इसी तरह, इस प्रोटोकॉल में, वाहक पेप्टाइड सेल है, क्योंकि इसकी प्रभावशीलता के मस्तिष्क ऊतक३९में गहरी कार्गो परिवहन के पेप्टाइड TR है । इसके अतिरिक्त, हमारे विधि इंजेक्शन और विषाक्त एकत्रीकरण५०,५१का कारण बन सकता है कि विभिंन पेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । इसलिए, हमारे सिस्टम zebrafish मस्तिष्क में विषाक्त प्रोटीन के मैनुअल इंजेक्शन के लिए एक बहुमुखी विधि प्रदान करता है और इस तरह के विषाक्तता के सेलुलर प्रभाव का विश्लेषण ।

Amyloid पेप्टाइड्स कुल जल्दी है, और इसलिए, स्टॉक पानी में रखा जाना चाहिए-DMF-acetonitrile समाधान, और केवल ०.५ ज के साथ पंजाबियों इंजेक्शन से पहले मिलाया जाना चाहिए । यदि समाधान में बड़े समुच्चय हैं, इंजेक्शन समाधान इंजेक्शन से पहले केवल 10 मिनट तैयार किया जाना चाहिए । इंजेक्शन दक्षता अनुरूप परिणाम उपज के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है । कृपया एक अच्छा और सुसंगत इंजेक्शन प्रदर्शन के लिए हमारे पिछले जौव कागज४६ देखें । यदि कोई एकत्रीकरण इंजेक्शन के बाद देखा जाता है, इंजेक्शन विधि अनुकूलित किया जाना चाहिए ।

हमारा तरीका इंजेक्शन के अणुओं के आकार के मामले में सीमित है । हम पहले से पता चला है कि plasmids या कम oligomers वेंट्रिकुलर कोशिकाओं द्वारा कुशलतापूर्वक लिया जा सकता है४५,४६, तथापि, गहरे मस्तिष्क के ऊतकों में कुशल प्रसव के लिए, बड़े अणुओं (जैसे, एंटीबॉडी, बड़े प्रोटीन) का उपयोग नहीं किया जा सकता । इसके अतिरिक्त, lipophilic अणुओं को आसानी से गहरे ऊतकों घुसना नहीं हो सकता है क्योंकि ऐसे अणुओं वेंट्रिकुलर कोशिकाओं की पहली कुछ परतों से तनहा हो जाएगा ।

neurodegeneration के माउस मॉडलों की पीढ़ी के समय लेने वाली है और इन मॉडलों के रखरखाव काफी महंगा है । हमारे इंजेक्शन विधि विषाक्त amyloid जमाव के लिए एक तेजी से मॉडल है, और neurodegeneration । इसके अतिरिक्त, zebrafish एक बेहतर अपक्षय स्तनधारी मॉडल की तुलना में क्षमता है, और जांच कैसे हड्डीवाला दिमाग पर ध्यान केंद्रित कर neurodegeneration के बाद एक पुनर्जनन प्रतिक्रिया माउंट सकता है निश्चित रूप से तेजी से परख प्रणालियों से लाभ होगा zebrafish.

संश्लेषित पेप्टाइड की गुणवत्ता और इसकी शुद्धता प्रयोग की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं । इस गुणवत्ता को सुनिश्चित करने के लिए, संश्लेषित पेप्टाइड्स अच्छी तरह से तरल क्रोमैटोग्राफी और जन स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर विशेषता होना चाहिए । इसके अतिरिक्त,३९ वर्णित के रूप में परिपत्र dichroism और एकत्रीकरण अध्ययनों का सुझाव दिया है ।

मछली मस्तिष्क में इंजेक्शन एक सुसंगत एकत्रीकरण और रोग के परिणाम को सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । एक अनुदैर्ध्य अध्ययन है कि एकत्रीकरण और amyloid पेप्टाइड्स की मंजूरी गतिशीलता का विश्लेषण करती है, किया जा सकता है अगर वांछित । हम एक amyloid एक वाहक पेप्टाइड के लिए युग्मित करने के लिए मस्तिष्क के ऊतकों में समान वितरण और पैठ सुनिश्चित पेप्टाइड का उपयोग करें । युगल amyloid पेप्टाइड्स भी इसी तरह के परिणाम दे लेकिन वितरण और एकत्रीकरण की समयरेखा अलग है३९। प्रयोगकर्ता उद्देश्य के आधार पर amyloid पेप्टाइड्स के वांछित संस्करण का चयन कर सकते हैं ।

वहां अंय हेरफेर अध्ययन के साथ संयोजन में हमारे विधि के उपयोग के लिए काफी क्षमता है । amyloid पेप्टाइड्स की CVMI दवा उपचार या अन्य यौगिकों के इंजेक्शन के साथ संयुक्त किया जा सकता है एक रोग हालत में विभिन्न अणुओं के synergistic प्रभाव का परीक्षण. अंततः, हमारे तेजी से और उपंयास मॉडल भी एक आसान प्रयोगशाला की स्थापना में छोटे पैमाने पर दवा स्क्रीनिंग दृष्टिकोण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

हमारे मैनुअल microinjection विधि कुशलतापूर्वक amyloid जमाव की नकल करने के लिए वयस्क zebrafish मस्तिष्क में amyloid पेप्टाइड्स इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । मस्तिष्क में Amyloid जमाव साइटोटोक्सिक प्रभाव और विज्ञापन विकृति में परिणाम, इसलिए एक तीव्र neurodegenerative हालत प्रदर्शित । इस विधि के लिए भविष्य के दृष्टिकोण के लिए यह एक तीव्र अपक्षयी मॉडल में उपयोग करने के लिए zebrafish मस्तिष्क में neuropathology अध्ययन और उसके पुनर्उत्पादक प्रतिक्रिया होगा । इस तरह की समझ नई चिकित्सकीय रणनीतियों डिजाइन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मंच प्रदान करेगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

यह काम DZNE और Helmholtz एसोसिएशन (VH-एनजी-१०२१), CRTD, टू ड्रेसडेन (FZ-१११, 043_261518), और DFG (KI1524 6) (सीके) द्वारा समर्थित था; और लाइबनिट्स एसोसिएशन द्वारा (देखा-२०११-आईपीएफ-2) और BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.) । हम भी पेप्टाइड संश्लेषण के लिए Ulrike Hofmann, और नंदिनी असोकन, प्रयाग Murawala, और Elly तनाका की प्रक्रिया फिल्माने के दौरान मदद के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fmoc-protected amino acids IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1030 Activator
Oxyma IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1180 Racemization supressor
N,N-Diisopropylethylamine IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-003 Base
Dimethylformamide IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-004 Solvent
N-Methylmorpholine Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany A12158 Base
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) 157260 ALDRICH Activator
Piperidine MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 822299 Fmoc deprotection reagent
Dichlormethane (DCM) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 106050 Solvent
Formic acid (FA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 100264 Buffer component for HPLC
Trifluoroacetic acid (TFA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 808260 Clevage Mixture reagent
Triisopropylsilane(TIS) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 233781 ALDRICH Clevage Mixture reagent
Acetonitrile (for UPLC/LCMS) Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH 34967-1L Solvent
Acetonitrile (for HPLC) VWR International Ltd, England 83639.320 Solvent
Diethylether VWR International Ltd, England 23811.326 Solvent for peptide precipitation
Dithiotritol (DTT) VWR International Ltd, England 0281-25G Clevage Mixture reagent
TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) S30023 Solid phase for SPPS
Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters Intavis AG (Cologne, Germany) 34.274 Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 11806-50-N Filteration of precipitated peptides
Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe KC78.1 Pre-filteration for HPLC
Peptide Synthesizer Intavis, Cologne, Germany ResPep SL Automated solid-phase peptide synthesizer
Water Alliance HPLC Waters, Milford Massachusetts, USA Waters 2998, Waters e2695 Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)
PolymerX, bead size 10μm, 250x10 mm Phenomenex Ltd. Germany 00G-4328-N0 Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column
Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA LCPAK0001 Water purification system
Filtration Unit Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 16307 Filtration unit for peptide precipitation
UPLC Aquity with UV Detector Waters, Milford Massachusetts, USA M09UPA 664M Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50x2.1 mm Waters, Milford Massachusetts, USA 186002350 Analytical C18 column
ACQUITY TQ Detector Waters, Milford Massachusetts, USA QBB908 Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany 16706, 101542 Lyophilizer with vaccum pump
Paradigm plate reader Beckman Coulter
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) Sigma-Aldrich A5040
Petri dishes Sarstedt 821.472
Phosphate-buffered saline Life Technologies, GIBCO 10010-056
Needle Becton-Dickinson 305178
Dissecting microscope Olympus, Leica, Zeiss Varies with the manufacturer
Dumont Tweezers World Precision Instruments 501985
Gillies Dissecting Forceps World Precision Instruments 501265
Glass injection capillaries World Precision Instruments TWF10
PicoNozzle World Precision Instruments 5430-12
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments SYS-PV820
Ring illuminator; Ring Light Guide Parkland Scientific ILL-RLG
Cryostat Leica CM1950

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तंत्रिका विज्ञान अंक १२८ Amyloid β ४२ zebrafish neurodegeneration cerebroventricular microinjection अल्जाइमर रोग ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण
मॉडलिंग Amyloid-β ४२ विषाक्तता और वयस्क Zebrafish मस्तिष्क में Neurodegeneration
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Bhattarai, P., Thomas, A. K., Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Mashkaryan, V., Zhang, Y., Kizil, C. Modeling Amyloid-β42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (128), e56014, doi:10.3791/56014 (2017).

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