Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

النمذجة سمية اميلويد-β42 ونيوروديجينيريشن في المخ الزرد الكبار

Published: October 25, 2017 doi: 10.3791/56014
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3, 2, 1,3
1German Centre for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Dresden within Helmholtz Association, 2B CUBE, Center for Molecular Bioengineering, Technische Universität Dresden, 3Center for Regenerative Therapies Dresden (CRTD), TU Dresden

Summary

ويصف هذا البروتوكول التوليف، وتوصيف، وحقن من الببتيدات β42 اميلويد أحادي لتوليد سمية اميلويد في الزرد الكبار وضع نموذج مرض الزهايمر، تليها تحليلات غذائها والكشف عن التجميعات.

Abstract

مرض الزهايمر (ميلادي) هو المنهكة المرض الأعصاب التي تراكم السامة اميلويد-β42 الببتيدات (Aβ42) يؤدي إلى انحطاط متشابك، التهاب، موت الخلايا العصبية، وتعلم العجز. البشر لا يمكن تجديد الخلايا العصبية المفقودة في حالة الإعلان جزئيا بسبب ضعف القدرات التكاثري للخلايا الجذعية العصبية/السلف (نسبكس) والخلايا تخفيض. ولذلك، ينبغي أيضا أن يعزز كفاءة العلاجات التجدد الانتشار وقدرة العصبية نسبكس. الزرد (دانيو rerio) كائن التجدد، ويمكننا أن نتعلم البرامج الجزيئية الأساسية التي يمكن أن نصمم النهج العلاجي للتصدي للإعلانات. ولهذا السبب، من الضروري توليد نموذج مثل الإعلان في الزرد. استخدام منهجيتنا، يمكننا إدخال المشتقات الاصطناعية من الببتيد Aβ42 مع القدرة على اختراق أنسجة الدماغ الزرد الكبار، وتحليلها باثولوجيا المرض والاستجابة التجدد. ميزة على الطرق القائمة أو نماذج حيوانية الزرد تلك يمكن أن تعلمنا كيف يمكن بطبيعة الحال تجديد دماغ فقاريات، ومما يساعدنا على علاج أمراض الأعصاب البشرية أفضل من خلال استهداف نسبكس الذاتية. ولذلك، طراز اميلويد-سمية في الدماغ الزرد الكبار قد فتح آفاقاً جديدة للبحث في مجال علم الأعصاب والطب السريري. بالإضافة إلى ذلك، يسمح تنفيذ هذا الأسلوب بسيطة لتقييم تجريبية فعالة من حيث التكلفة والكفاءة. ويصف هذه المخطوطة التوليف وحقن من الببتيدات Aβ42 في الدماغ الزرد.

Introduction

الإعلان هو مرض مزمن تدريجي تتسم بفقدان الخلايا العصبية وسينابسيس في قشرة الدماغ1،2،3،،من45. بصمات لاثيل الكلاسيكي للإعلان هي ترسب الببتيدات اميلويد والتشابك تشكيل نيوروفيبريلاري (NFTs)6. خرف لويحات، يعرف أيضا باسم لويحات اميلويد، تتألف من الببتيدات اميلويد-بيتا (Aβ) التي تشكل هياكل الطيات بيتا في الدماغ حمة5. تراكم Aβ42 في المرضى الإعلانية دور مبكر وحاسم في تطور المرض. إعلان يطلق سلسلة أحداث التي أدت إلى خلل متشابك اللدونة البصر وفقدان الخلايا العصبية7،8،،من910.

الدماغ الكبار من الزرد تيليوست بمثابة نموذجا ممتازا لدراسة تنظيم الخلايا الجذعية اللدونة11،،من1213،،من1415، 16،،من1718،،من1920 والأمراض المختلفة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، بما في ذلك الإعلان21،22،23 ،24. ونظرا لمجموعة واسعة من الأساليب التجريبية المتاحة19،،من2025،26،27،،من2829، 30 , 31، من هذه الدراسات مفيدة ومجدية. ويمكن تجديد الزرد الجهاز العصبي المركزي13،15،32،،من3334،35،36،37، 38، في جزء منه باستخدام البرامج الجزيئية تفعيلها بعد فقدان الخلايا العصبية19،39،،من4041،،من4243، 44. ولذلك يمكن أن يساعد وضع نموذج مرض الأعصاب في الزرد عنوان رواية أسئلة بشأن التجدد البيولوجيا القدرة، والخلايا الجذعية في أدمغة الفقاريات.

في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير نموذج سمية اميلويد في الدماغ الزرد الكبار عن طريق حقن الاصطناعية Aβ42 الببتيدات (الجدول 1)39. تسبب هذه الحقن تعمل نيوروديجينيريشن يذكرنا بأمراض المخ البشري (مثلموت الخلية، التنشيط ميكروجليال، وانحطاط متشابك والعجز في الذاكرة)، مما يشير إلى أن الزرد يمكن استخدامها للحصول على نيوروديجينيريشن في المخ الزرد، حددت Aβ42 يمكن اكتشاف الببتيدات مع ستاينينجس المناعي، والآليات الجزيئية للتجدد في الزرد البالغين يمكن أن يكون الجهاز العصبي المركزي39. في هذا البروتوكول، ونظهر حقن الببتيدات اميلويد الاصطناعية في الدماغ الزرد استخدام سيريبروفينتريكولار حقن (كفمي) أسلوب27،39،،من4546 لتقليد ترسب اميلويد (الشكل 1). كفمي يوفر طريقة جديدة لإيصال الببتيدات، تجميع عند الحقن كهياكل β-ورقة وممارسة السمية. الببتيدات توزع بالتساوي في جميع أنحاء الدماغ، واستهداف منطقة البطين على طول محور rostro والذيلية كامل45. بالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا الأسلوب لتحليل استجابة الجزيئية والمورفولوجية نسبكس في المخ الزرد الكبار عقب تضمينات اميلويد. هذه الدراسات سوف يتيح لنا نظرة ثاقبة لإصلاح الدماغ الناجح في الثدييات. يمكن استخدام لدينا طريقة لفهم إليه استجابة التجديد الناجح الجزيئية الضرورية بعد الإعلان تشبه أعراض للحث على تجديد الخلايا العصبية المفقودة واستعادة الوظيفية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

هذا البروتوكول إجراء موحد اقترح المبادئ التوجيهية للاتحاد الأوروبي (2010/63) و "الجمعية الأوروبية" "نماذج الأسماك" في علم الأحياء والطب (يوفيشبيوميد) في كارلسروه معهد للتكنولوجيا (مجموعة). جميع الأساليب الموصوفة هنا بعد موافقة لجنة الأخلاقيات (درسدن لانديسديريكشن؛ والوثيقة رقم تفف-52/2015)-

1. إعداد الببتيد Aβ42

  1. Synthesize الببتيدات (انظر الجدول 1) باستخدام الكيمياء قياسي 9-فلورينيلميثوكسيكاربونيل (معتدلاً) مع 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- تيتراميثيلورونويومهيكسافلورفوسفاتي (هبتو) ككاشف اقتران المعني المزج الآلي المرحلة الصلبة ببتيد 52. وكان نطاق التوليف 100 µmol-
    2. تحميل
  2. المزج الآلي الببتيد مع 500 ملغ الراتنج المحمية معتدلاً في المرحلة الصلبة (تحميل قدرة 0.2 ميللي مول/غرام). تحميل المذاب الأحماض الأمينية المحمية معتدلاً بتركيز 0.5 متر في الحجم المطلوب ومحسوبة لمركب كل منهما.
    ملاحظة: الحسابات مصنوعة لتمكين اقتران كل من الأحماض الأمينية المحمية معتدلاً مرتين مع فائض 5 مرات في كل كتلة راتنج 47.
  3. حل الكواشف اللازمة لتوليف الببتيد في ديميثليفورماميدي (DMF). على سبيل المثال، إعداد المنشط، هبتو، بتركيز 0.48 م، 45% v/v ميثيلمورفوليني ن (نم) (القاعدة)، و 5% v/v "أنهيدريد الخل" (خليط متوجا) كاب المجموعات الأمينية غير رد.
  4. تهزم جميع الببتيدات من الراتنج بالاختلاط باستمرار دعم متين استخدام المحرض في خليط انقسام طازجة تتكون من حامض Trifluoroacetic (تفا): Triisopropylsilane(TIS): المياه: ديثيوثريتول (DTT) في 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2.5 (m/v)، ل 4 h. استخدام 10 مل لتوليف جدول 100 µmol-
  5. يعجل المنتج ملصوق بإضافة خليط الانقسام إلى 100 مل المثلج إثيل الاثير. تمرير من خلال وحدة ترشيح التي تحتوي على عامل تصفية تترافلوروايثيلين (PTFE) مع حجم مسام ميكرومتر 0.45 والغسيل مع مل 20 المثلج إثيل الاثير.
  6. جمع الببتيد التي تمت تصفيتها من ورق الترشيح وتذوب 100 مغ من سرع من الببتيد في 5 مل منزوع الماء المقطر: الاسيتو الانيتريل 1:1.
  7. نق عن طريق عكس المرحلة اللوني السائل عالي الضغط ([هبلك]) على [هبلك] شبه محضرة مزودة بعمود ديفينيلبينزيني البوليستيرين مسامية من حبة حجم 10 ميكرون.
    1. قبل الحرارة العمود والحفاظ على الأقل 50 درجة مئوية باستخدام عمود تدفئة الجهاز. جمع جميع الكسور الرئيسية استخدام جامع كسر الآلي بتطبيق تدرج من 5% إلى 100% المذيب ب أكثر من 25 دقيقة في 4 مل/دقيقة
      ملاحظة: (أ) المذيبات هو 0.1% هو تفا في الماء والمذيبات ب 0.1% تفا في الاسيتو الانيتريل 52.
    2. رصد chromatogram 220 نانومتر، جمع قمم مناسبة، وتحليل استخدام LC-السيدة
  8. تأكيد النقاء بعكس التحليلي المرحلة العالية الضغط السائل اللوني (أوبلك) 220 نانومتر بالرصد مع جهاز "كشف الأشعة فوق البنفسجية" أثناء مروره العينة من خلال عمود C18 تحليلية (حبة حجم 1.7 ميكرومتر). تأكيد المنتج الببتيد بواسطة الكتلي.
    ملاحظة: يقترن في أوبلك إلى اليكتروسبراي التأين الكتلي (أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد) و "كشف الرباعي جنبا إلى جنب".
  9. ليوفيليزي الصحيح كسور الببتيد المرجوة في قارورة قاع جولة، بتطبيق فراغ من 0.052 [مبر]، على شكل مسحوق رقيق. زوجان مضخة فراغ لوحدة تجميد للاحتفاظ في مخزن ° C.-78 في-80 درجة مئوية، إلى أجل غير مسمى-
  10. استخدام الببتيد المجففة بالتبريد لتحضير حلاً أسهم من 1 ملم في خليط من الاسيتو الانيتريل: DMF: المياه المرتبة التحليلية في 1:1:1 للتجارب. ويمكن تخزين هذا الحل لمدة 6 أشهر على الأقل، كما لا تجميع الببتيدات في هذا الحل-

2. إعداد "الخليط حقن"

  1. إعداد المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) (كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل، 10 مم نا 2 هبو 4، 2 مم خ 2 ص 4، ودرجة الحموضة 7.4 ملم 137) لتمييع الببتيدات المجففة بالتبريد.
  2. حل الببتيد بتركيز نهائي من 20 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني. إعداد هذا الحل الطازجة. يخلط جيدا وتخزينها على الجليد حتى الحقن. لا تتجاوز 30 دقيقة لمنع التراكم في الحل-

3. التخدير

  1. تحضير الحل الأسهم من المسكنات، 0.1% إيثيل-m-أمينوبينزواتي ميثانيسولفوناتي (ميساب)، في المياه الأسماك العادية من تعميم النظام. إعداد حل التنويم بتركيز نهائي 0.0025% (v/v)-
  2. إزالة العدد المطلوب من الأسماك من دباباتهم في حاوية نقل مع 5 لتر الماء النظام.
  3. النصف-التعبئة بلاستيكية طبق بتري (90 ملم) مع 40 مل المسكنات. استخدم هذا الطبق لحقن.
  4. احتضان السمك في المسكنات حتى توقف حركة أوبيركولار-

4. Microinjection سيريبروفينتريكولار

  1. إعداد جهاز حقن
    1. تحضير الزجاج حقن الشعيرات الدموية باستخدام ساحبة إبرة مع المعلمات التالية: تدفئة دورة، 537؛ سحب دورة، 250؛ والسرعة، 1.5 s; الوقت، والسيدة 80
    2. جلب إعداد الضغط على مصدر الضغط إلى 25 رطل/بوصة مربعة.
    3. تعيين المعلمات ميكروينجيكتور على ما يلي: إجراء ضغط 20 رطل/بوصة مربعة؛ وإخراج الضغط 10 psi؛ قيمة فترة 2.5 النابضة القيمة 100 السيدة
      4. تحميل
    4. الشعرية الزجاج مع الحل الحقن. إدراج حامل microinjection الشعرية الزجاج. ضبط زاوية الحقن إلى 45°.
      ملاحظة: يمكن بروتوكولات أكثر تفصيلاً كما هو موضح في مراجع 27 ، 46-
  2. الأسماك مكان واحد في طبق بتري جديدة مليئة بالحل التنويم (كما هو الحال في الخطوة 3، 3)-
  3. عقد الأسماك بالملقط والمشرق لحقن.
  4. توليد شق استخدام تلميح إبرة ز 30 في الجمجمة عبر tectum الألياف البصرية حيث تلتقي الألواح الجانبية اثنين. لا تقم بإدراج التلميح إلى أنسجة المخ، ويسبب هذا النزيف والأضرار. انظر مراجع 27 ، ، من 45 46 تفاصيل إضافية-
  5. إدراج الشعرية الزجاج في الشق. استخدام سوى غيض الإبرة
    1. ولم تخترق أكثر من 1 مم من خلال الجمجمة. الحفاظ على الضغط الأسماك وإدراج غيض الزجاج الشعرية من خلال موقع شق.
    2. توجيه غيض الزجاج الشعرية نحو تيلينسيفالون بزاوية 45 درجة. حقن 1 ميليلتر من الحل. تسارع شرط السائل فورا بعد الحقن.

5. استرداد

  1. مكان الأسماك مرة أخرى إلى حاوية نقل حتى أنه يتعافى. توصيل الحاوية للمياه الأسماك المتداولة بشكل منتظم لضمان نوعية المياه الأمثل.
    ملاحظة: ينبغي أن الانتعاش عادة 1 دقيقة. إذا كان الأمر يستغرق وقتاً أطول، الأسماك يجب أن يوضع في المسكنات لفترة أقصر (هذا يحتاج إلى أن يكون الأمثل بالمجرب).

    2. 6. إعداد الأنسجة وسيكتيونينج

    1. الانتظار لفترة زمنية قبل التضحية بالسمك المطلوب.
      ملاحظة: هذا يعتمد على مسألة تجريبية. يمكن رؤية ترسب اميلويد لها في أقرب وقت بعد حقن يوم 1-
    2. التضحية الأسماك باستخدام الأسلوب المناسب تبعاً للقواعد الأخلاقية (مثلاً، علاج الأسماك مع 0.1 [م] مصعب)-
    3. قص فتح الجمجمة أعلاه تكتم الألياف البصرية باستخدام فورسيب أشار في الجهة الظهرية، وتشريح الرأس فقط وراء الزعنفة الصدرية استخدام مشرط.
    4. إصلاح رؤساء استخدام 2% بارافورمالدهيد (PFA) بين عشية وضحاها في 4 مل ° 3 استخدام جيم من منهاج عمل بيجين في الرأس في أنبوب بلاستيكي مع غطاء المسمار.
      تنبيه: ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة عند التعامل مع منهاج عمل بيجين-
    5. كريوبروتيكشن وديكالسيفيكيشن، تغسل الرؤساء ثلاث مرات في 0.1 متر العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.4)، ثم تحويلها إلى حل الإيثيلين (يدتا) sucrose/20% 20% واحتضان بين عشية وضحاها في 4 ° C.
    6. لتضمين الأنسجة إلى تقطيع الراتنج، تجميد الرؤوس في محلول السكروز gelatin/20% 7.5 ٪ في قوالب بلاستيكية علم الأنسجة على الثلج الجاف (حوالي 3-5 دقيقة لتجميد كتلة). تخزين العينات في-80 درجة مئوية، أو الاستمرار في الخطوة التالية (كريوسيكتيونينج)-
      7. القسم
    7. إلى الرؤساء إلى 12 ميكرومتر سميكة كريوسيكتيونس استخدام كريوستات ك وصف 28 ، 42. نقل كريوسيكشنز مباشرة على الشرائح الزجاجية وتخزينها في-20 درجة مئوية للاستخدام طويل الأجل-

    7. تلوين المناعي والفحص المجهري

    ملاحظة: جميع الخطوات حضانة في دائرة هوميديفيد. وتوجد جميع خطوات الغسيل لمدة 10 دقائق-

    1. الجاف للفروع لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذوبان الجليد، يغسل الفروع مرتين في برنامج تلفزيوني ومرة في ببستكس (برنامج تلفزيوني مع 0.03% تريتون-X-100)-
    2. إينكوباتي مع جسم الأولية (الأجسام المضادة-Aβ42؛ وتمييع 1: 500 في ببستكس) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد اليوم، ويغسل مرة واحدة في برنامج تلفزيوني ومرتين في ببستكس-
    3. احتضان الفروع مع جسم الثانوية (إلى جانب الأسفار الكشف، وتمييع 1: 500) جنبا إلى جنب مع DAPI (1 ميكروغرام/مل) في ببستكس ح 2 في درجة حرارة الغرفة-
    4. يغسل ثلاث مرات في ببستكس. بعد الغسيل النهائي، جبل الشرائح مع ساترة استخدام 100 ميكروليتر 70% والغليسيرول.
    5. الحصول على الصور الفلورية استخدام مجهر [كنفوكل] (على سبيل المثال مع الهدف 20 X PL APO N.A. 0.7 مع مجموعة الإثارة 488 وعامل تصفية خضراء قياسية؛ الشكل 2) 39-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

[هبلك] كان يستخدم لتنقية الببتيد المركب وقد استخدمت الكتلي لتوصيف الببتيدات المنقي بيتا اميلويد. كانت ساخنة العمود [هبلك] إلى 50 درجة مئوية لتحسين فصل الببتيدات Aβ وجمعت جميع الكسور. تحديد الببتيد مركباً بشكل صحيح، أجرى التحليل الطيفي الشامل لجميع الكسور. تشروماتوجرام أوبلك يظهر نقاء المجمع. كذلك تمت معالجة الكسر [هبلك] التي تسفر عن ذروة واحدة في أوبلك (أي، الكتلة الصحيحة لشحن نسبة المطلوبة بيتا اميلويد الببتيد) للتجارب (الشكل 2).

ويمكن تقييم الأداء الوظيفي لالببتيدات في تشكيل المجاميع باستخدام مختلف الطرق الطيفية39،،من4849، وأيضا التي تفرخ الببتيدات في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لأكثر من 1 ح، والتي سوف تسفر عن المجاميع. وفي هذه الحالة، ينبغي النظر إلى رواسب ومجاميع كبيرة في الحل.

وبعد سيريبروفينتريكولار microinjection، الببتيدات التجميعية في الدماغ، وشكل ترسبات اميلويد (الشكل 3). وتعتبر هذه المجاميع معظمها ترسبات داخل الخلايا، ولكن أيضا حول الأوعية الدموية. هذه المجموعات دلائل تراكم ناجحة من الببتيدات اميلويد في الأنسجة.

Figure 1
رقم 1: التمثيل التخطيطي الببتيد التوليف وتنقية، والحقن، وتحليلات- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: وصف الببتيد اميلويد أصلية-β42- وصف الطيف الكتلي الببتيد اميلويد الأصلية-β42 (A) والببتيد اميلويد-β42 معلم حزب الشعب الكمبودي (TR-Aβ42؛ ب)-(ج) اللوني لتنقية، أصلي، وار-Aβ42 الببتيد في أولتراهيغ ضغط السائل اللوني (أوبلك). إكساكسيس تدل على نسبة الكتلة بتهمة (m/z) (أو ب) والوقت شطف في دقائق (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: المناعي تلطيخ ترسب اميلويد في قسم الدماغ الزرد الكبار بعد حقن يوم 1- Aβ42 باللون الأخضر، ونوى باللون الأزرق. الكشف عن مجموعات الأخضر يشير إلى كفاءة Aβ42 التجميع. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. لقد تم تعديل هذا الرقم من مرجع39.

الببتيد الببتيد تسلسل ميغاواط (g/mol)
AΒ42 دايفرهدسجييفهقكلففايدفجسنكجاييجلمفجففيا 4514.1
TR-AΒ42 جوتلنساجيلكينلكالالاكيلدايفرهدسجييفهقكلففايدفجسنكجاييجلمفجففيا 5919.8

الجدول 1: Aβ42 وار-Aβ42 الببتيد تسلسل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكن تعديل الببتيدات اميلويد لتشمل الاختلافات تسلسل أو العلامات المختلفة. على سبيل المثال، يمكن أن تتولد من ببتيد اميلويد مجمعة، ويمكن المسمى بواسطة العلامات الفلورية في ن-المحطة نهاية الببتيد الببتيدات أو معلم مع الناقل الببتيدات39. وبالمثل، هو الببتيد الناقل في هذا البروتوكول، اختراق الخلية الببتيد آر بسبب فعاليته لنقل البضائع العميق في أنسجة الدماغ39. بالإضافة إلى ذلك، لدينا أسلوب يسمح للحقن وتحليلات من الببتيدات المختلفة التي يمكن أن تسبب السمية تجميعات50،51. ولذلك، يوفر نظامنا أسلوب متعدد الاستخدامات لحقن يدوي من البروتينات السامة في الدماغ الزرد، وتحليل آثار هذه السمية الخلوية.

اميلويد الببتيدات التجميعية بسرعة، ومن ثم الأسهم يجب أن يوضع في الماء-DMF-الاسيتو الانيتريل الحل، وينبغي أن تكون مختلطة مع برنامج تلفزيوني فقط 0.5 ح قبل الحقن. إذا كانت هناك مجاميع كبيرة في الحل، وينبغي إعداد الحل حقن فقط 10 دقيقة قبل الحقن. حقن الكفاءة معياراً هاما تسفر عن نتائج متسقة. يرجى الرجوع إلى أعمالنا السابقة جوف الورقة46 لأداء حقنه جيدة ومتسقة. إذا كان التجميع لم ينظر بعد الحقن، يجب أن يكون الأمثل طريقة الحقن.

أسلوبنا محدودة من حيث حجم الجزيئات بالحقن. أظهرنا سابقا أن البلازميدات أو ليغومرات قصيرة يمكن أن تتخذها كفاءة خلايا البطين45،46، بيد لتقديم بكفاءة في أنسجة المخ العميق، الجزيئات الكبيرة (مثل، والأجسام المضادة، كبير لا يمكن استخدام البروتينات). بالإضافة إلى ذلك، جزيئات محبتين قد لا بسهولة اختراق الأنسجة العميقة لأنه سوف يعزل هذه الجزيئات بطبقات القليلة الأولى من خلايا البطين.

توليد نماذج الماوس من نيوروديجينيريشن مضيعة للوقت وصيانة هذه النماذج مكلفة جداً. لدينا أسلوب الحقن نموذج سريع لترسب السامة اميلويد، ونيوروديجينيريشن. بالإضافة إلى ذلك، الزرد لديه قدرة التجدد متفوقة مقارنة بنماذج الثدييات، والتحقيقات تركز على أدمغة الفقاريات كيف يمكن تحميل استجابة تجديد بعد نيوروديجينيريشن سوف تستفيد بالتأكيد من نظم الفحص السريع في الزرد.

نوعية الببتيد المركب والنقاء، مهمة لنجاح التجربة. لضمان هذه الجودة، الببتيدات المركب يجب أن دقة تتسم باستخدام كروماتوغرافيا سائلة والتحليل الطيفي الشامل. بالإضافة إلى ذلك، تقترح الدراسات تلوانيه وتجميع التعميم ك وصف39 .

حقن في الدماغ الأسماك خطوة حاسمة لضمان تجميع متسقة والنتيجة المرضية. يمكن إجراء دراسة طولية يحلل ديناميات التجميع وتخليصها من الببتيدات اميلويد، إذا رغبت في ذلك. نحن نستخدم ببتيد اميلويد بالإضافة إلى ببتيد الناقل ضمان التوزيع المتساوي واختراق أنسجة المخ. الببتيد اميلويد أونكوبليد أيضا تعطي نتائج مماثلة ولكن الجدول الزمني لتوزيع وتجميع مختلف39. يمكن اختيار المجرب الإصدار المطلوب من الببتيدات اميلويد تبعاً للهدف.

وهناك إمكانات كبيرة لاستخدام أسلوبنا في تركيبة مع غيرها من الدراسات التلاعب. يمكن أن يكون كفمي الببتيدات اميلويد جنبا إلى جنب مع العلاج بالعقاقير أو الحقن بمركبات أخرى لاختبار آثار التآزر من جزيئات مختلفة في حالة مرض. في نهاية المطاف، يمكن أيضا استخدام نموذجنا السريع ورواية لنهج فحص المخدرات الصغيرة في إعداد مختبر سهلة.

يمكن استخدام الأسلوب اليدوي microinjection لدينا كفاءة حقن الدماغ الزرد الكبار لتقليد ترسب اميلويد الببتيد اميلويد. ترسبات اميلويد في المخ استخلاص الآثار السامة للخلايا والنتائج في علم الأمراض الإعلانية، ومن ثم عرض شرط الأعصاب حادة. الآفاق المستقبلية لهذا الأسلوب سيكون للاستفادة منها في نموذج التنكسية حادة للدراسة أمراض الأعصاب في الدماغ الزرد والتجدد استجابة منه. وسيوفر هذا الفهم منصة هامة لتصميم استراتيجيات علاجية جديدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgments

ودعمت هذا العمل دزني ورابطة هلمهولتز (VH-الحرس الوطني-1021)، الاتفاقية، تو درسدن (FZ-111، 043_261518)، و DFG (KI1524/6) (كورونا)؛ ومن رابطة لايبنتز (شهد-2011-الحكومي-2) والألمانية (بيوليثومورفي 03Z2E512) (Y.Z.). كما نود أن نشكر اولريكي هوفمان لتوليف الببتيد، و Asokan نانديني وبريج موراوالا تاناكا اللي للحصول على مساعدة أثناء تصوير هذا الإجراء.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fmoc-protected amino acids IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1030 Activator
Oxyma IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1180 Racemization supressor
N,N-Diisopropylethylamine IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-003 Base
Dimethylformamide IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-004 Solvent
N-Methylmorpholine Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany A12158 Base
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) 157260 ALDRICH Activator
Piperidine MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 822299 Fmoc deprotection reagent
Dichlormethane (DCM) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 106050 Solvent
Formic acid (FA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 100264 Buffer component for HPLC
Trifluoroacetic acid (TFA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 808260 Clevage Mixture reagent
Triisopropylsilane(TIS) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 233781 ALDRICH Clevage Mixture reagent
Acetonitrile (for UPLC/LCMS) Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH 34967-1L Solvent
Acetonitrile (for HPLC) VWR International Ltd, England 83639.320 Solvent
Diethylether VWR International Ltd, England 23811.326 Solvent for peptide precipitation
Dithiotritol (DTT) VWR International Ltd, England 0281-25G Clevage Mixture reagent
TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) S30023 Solid phase for SPPS
Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters Intavis AG (Cologne, Germany) 34.274 Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 11806-50-N Filteration of precipitated peptides
Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe KC78.1 Pre-filteration for HPLC
Peptide Synthesizer Intavis, Cologne, Germany ResPep SL Automated solid-phase peptide synthesizer
Water Alliance HPLC Waters, Milford Massachusetts, USA Waters 2998, Waters e2695 Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)
PolymerX, bead size 10μm, 250x10 mm Phenomenex Ltd. Germany 00G-4328-N0 Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column
Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA LCPAK0001 Water purification system
Filtration Unit Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 16307 Filtration unit for peptide precipitation
UPLC Aquity with UV Detector Waters, Milford Massachusetts, USA M09UPA 664M Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50x2.1 mm Waters, Milford Massachusetts, USA 186002350 Analytical C18 column
ACQUITY TQ Detector Waters, Milford Massachusetts, USA QBB908 Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany 16706, 101542 Lyophilizer with vaccum pump
Paradigm plate reader Beckman Coulter
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) Sigma-Aldrich A5040
Petri dishes Sarstedt 821.472
Phosphate-buffered saline Life Technologies, GIBCO 10010-056
Needle Becton-Dickinson 305178
Dissecting microscope Olympus, Leica, Zeiss Varies with the manufacturer
Dumont Tweezers World Precision Instruments 501985
Gillies Dissecting Forceps World Precision Instruments 501265
Glass injection capillaries World Precision Instruments TWF10
PicoNozzle World Precision Instruments 5430-12
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments SYS-PV820
Ring illuminator; Ring Light Guide Parkland Scientific ILL-RLG
Cryostat Leica CM1950

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
  3. Serpell, L. C. Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
  4. Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer's disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
  5. Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
  6. Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
  7. Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer's disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
  8. McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
  9. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
  10. Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer's disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
  11. Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
  12. Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
  13. Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
  14. Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
  15. Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
  16. Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
  17. Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
  18. Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
  19. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  20. Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
  21. Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer's disease? Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
  22. Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer's disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
  23. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
  24. Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
  25. Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
  26. Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
  27. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).
  28. Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
  29. Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
  30. McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
  31. Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
  32. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
  33. Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
  34. Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
  35. Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
  36. Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
  37. Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
  38. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  39. Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
  40. Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
  41. Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
  42. Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
  43. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  44. Katz, S., et al. A Nuclear Role for miR-9 and Argonaute Proteins in Balancing Quiescent and Activated Neural Stem Cell States. Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
  45. Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073 (2015).
  46. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
  47. Sewald, N., Jakubke, H. Peptides: Chemistry and Biology. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. (2009).
  48. Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chemistry. 22 (25), 8685-8693 (2016).
  49. Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
  50. Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
  51. Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
  52. Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).

Tags

علم الأعصاب، 128 قضية، β42 اميلويد، الزرد، نيوروديجينيريشن، microinjection سيريبروفينتريكولار، ومرض الزهايمر، والمرحلة الصلبة الببتيد التوليف
النمذجة سمية اميلويد-β42 ونيوروديجينيريشن في المخ الزرد الكبار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhattarai, P., Thomas, A. K.,… More

Bhattarai, P., Thomas, A. K., Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Mashkaryan, V., Zhang, Y., Kizil, C. Modeling Amyloid-β42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (128), e56014, doi:10.3791/56014 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter