Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Modellering Amyloid-β42 toksicitet og Neurodegeneration i voksen zebrafisk hjerne

Published: October 25, 2017 doi: 10.3791/56014
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3, 2, 1,3
1German Centre for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Dresden within Helmholtz Association, 2B CUBE, Center for Molecular Bioengineering, Technische Universität Dresden, 3Center for Regenerative Therapies Dresden (CRTD), TU Dresden

Summary

Denne protokol beskriver syntese, karakterisering og injektion af monomere amyloid-β42 peptider til at generere amyloid toksicitet i voksen zebrafisk at etablere en Alzheimers sygdom model, efterfulgt af histologiske analyser og påvisning af sammenlægninger.

Abstract

Alzheimers sygdom (AD) er en invaliderende neurodegenerativ sygdom i hvilken ophobning af giftige amyloid-β42 (Aβ42) peptider fører til synaptic degeneration, betændelse, neuronal død, og lære underskud. Mennesker kan ikke regenerere tabte neuroner for annonce delvis på grund af nedsat proliferativ kapacitet af neurale stem/stamceller (NSPCs) og reduceret neurogenese. Derfor, effektive regenerative behandlinger bør også forbedre spredningen og neurogen NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) er en regenerativ skadegoereren, og vi kan lære de grundlæggende molekylære programmer, som vi kunne designe terapeutiske tilgange til at tackle annonce. Af denne grund var generation af en AD-lignende model i zebrafisk nødvendigt. Ved hjælp af vores metodik, kan vi indføre syntetiske derivater af Aβ42 peptid hos væv gennemtrængende evne i voksen zebrafisk hjernen og analysere sygdom patologi og regenerativ respons. Fordelen i forhold til eksisterende metoder eller dyremodeller er at zebrafisk kan lære os, hvordan en hvirveldyr hjerne kan naturligvis regenerere og således hjælpe os med at behandle menneskelige neurodegenerative sygdomme bedre ved at målrette endogene NSPCs. Derfor, den amyloid-toksicitet model etableret i hjernen, voksen zebrafisk kan åbne nye muligheder for forskning inden for neurovidenskab og klinisk medicin. Derudover simpel udførelse af denne metode giver mulighed for omkostningseffektiv og effektiv eksperimentelle vurdering. Dette manuskript beskriver syntese og injektion af Aβ42 peptider i zebrafisk hjernen.

Introduction

Annonce er en kronisk fremadskridende sygdom karakteriseret ved tab af neuroner og synapser i hjernebarken1,2,3,4,5. Klassisk Neuropatologisk kendetegnende for annonce er aflejring af amyloid peptider og dannelsen af den neurofibrillary tangles (NFTs)6. Senile plaques, også kaldet amyloid plaques, er sammensat af amyloid-β (Aβ) peptider, der danner β-plisseret strukturer i hjernen parenkym5. Ophobning af Aβ42 i AD patienter har en tidlig og kritiske rolle i sygdomsprogression. Annonce udløser en kaskade af begivenheder, der førte til synaptic dysfunktion, nedsat plasticitet og neuronal tab7,8,9,10.

Den voksne hjerne af teleost zebrafisk fungerer som en fremragende model til at studere reguleringen af stamcelle plasticitet11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 og forskellige sygdomme i centralnervesystemet (CNS), herunder AD21,22,23 ,24. På grund af en bred vifte af tilgængelige eksperimentelle metoder19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, disse undersøgelser er informative og gennemførlige. Zebrafisk kan genopbygge CNS13,15,32,33,34,35,36,37, 38, dels ved hjælp af molekylære programmer aktiveres efter neuronal tab19,39,40,41,42,43, 44. Derfor, om oprettelse af en neurodegenerativ sygdom model i zebrafisk kan hjælpe adresse roman spørgsmål vedrørende regenerative evne og stamceller biologi i hvirveldyr hjerner.

For nylig har udviklet vi en amyloid toksicitet model i voksen zebrafisk hjernen ved at indsprøjte syntetiske Aβ42 peptider (tabel 1)39. Denne injektion forårsaget neurodegeneration fænotyper minder om menneskelige hjerne patologi (fxcelledød, microglial aktivering, synaptic degeneration og hukommelse underskud), der angiver, at zebrafisk kan bruges til at fremkalde neurodegeneration i zebrafisk hjernen, Aβ42 peptider kan spores med immunhistokemiske stainings, og molekylære mekanismer for regenerering i voksen zebrafisk CNS kan være identificeret39. I denne protokol vise vi injektion af syntetiske amyloid peptider i zebrafisk hjernen ved hjælp af en cerebroventricular indsprøjtning (CVMI) metode27,39,45,46 at efterligne amyloid aflejring (figur 1). CVMI giver en ny måde at levere peptider, som samlede på injektion som β-plade strukturer og udøve toksicitet. Peptider er fordelt jævnt over hele hjernen, målretning ventrikulær området langs hele rostro-caudale akse45. Derudover tillader denne metode til at analysere de morfologiske og molekylære svar af NSPCs i voksen zebrafisk hjernen efter amyloid optagelser. Disse undersøgelser vil give os et indblik for vellykket hjernen reparation i pattedyr. Vores metode kan bruges til at forstå den nødvendige molekylær mekanisme for en vellykket regenerering svar efter annonce-lignende symptomer til at fremkalde opfyldning af tabte neuroner og funktionel genopretning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

denne protokol er en standardprocedure, som foreslået af EU 's retningslinjer (2010/63) og det europæiske samfund for fisk modeller i biologi og medicin (EuFishBioMed) i Karlsruhe Insitute af teknologi (KIT). Alle metoder beskrevet efter her er blevet godkendt af etik Kommissionen (Landesdirektion Dresden, bilagsnummer TVV-52/2015).

1. forberedelse af Aβ42 peptid

  1. Synthesize peptider (Se tabel 1) ved hjælp af standard 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) kemi med 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) som kobling reagenset på en automatiseret faststadie synthesizer 52. Omfanget af syntesen var 100 µmol.
  2. Indlæses den automatiserede peptid synthesizer med 500 mg af harpiks, der er beskyttet med Fmoc som den faste fase (lastekapacitet på 0,2 mmol/g). Indlæse de opløste Fmoc-beskyttet aminosyrer i en koncentration på 0,5 M i volumen kræves og beregnet for de respektive synthesizer.
    NOTE: Beregningerne er lavet til at aktivere koblingen af hver Fmoc-beskyttet aminosyre to gange med 5 gange overskydende af hver byggesten til harpiks 47.
  3. Opløses de nødvendige reagenser til faststadie peptidsyntese i dimethlyformamide (DMF). For eksempel, forberede activator, HBTU, i en koncentration på 0,48 M, 45% v/v N-Methylmorpholine (NMM) (base) og 5% v/v eddikesyreanhydrid (takstlofter blandingen) til cap de ikke reagerede amino grupper.
  4. Spaltes alle peptider fra harpiks af løbende blanding solid støtte ved hjælp af en agitator i en frisklavet kavalergang blanding bestående af trifluoreddikesyre (TFA): Triisopropylsilane(TIS): vand: Dithiothreitol (DTT) 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2,5 (m/v), til 4 h. Brug 10 mL for syntese omfanget af 100 µmol.
  5. Bundfald kløvet produktet ved at tilføje kavalergang blanding i 100 mL iskold diethylether. Passere gennem en filtrering enhed indeholder en polytetrafluorethylen (PTFE) filter med en porestørrelse på 0,45 µm og vask med 20 mL iskold diethylether.
  6. Indsamler de filtrerede peptid fra filtrerpapir og Opløs 100 mg af udfældet peptid i 5 mL destilleret deioniseret vand: acetonitril på 1:1.
  7. Rense via omvendt-fase højtryks væskekromatografi (HPLC) på en semi-forberedende HPLC udstyret med en porøs polystyren divinylbenzen kolonne af perle størrelse 10 µm.
    1. Pre heat kolonnen og vedligeholde ved 50 ° C ved hjælp af en kolonne opvarmning enhed. Indsamle alle de store fraktioner ved hjælp af en automatiseret brøkdel samler ved anvendelse af en gradient fra 5% til 100% væske B over 25 min. ved 4 mL/min.
      Bemærk: Opløsningsmiddel A er 0,1% TFA i vand og opløsningsmiddel B er 0,1% TFA i acetonitril 52.
    2. Overvåge kromatogrammet på 220 nm, indsamle relevante toppene, og analysere ved hjælp af LC-MS.
  8. Bekræft renhed af analytiske omvendt fase ultra-høj pres Liquid Chromatography (UPLC) på 220 nm ved overvågning med en UV-detektor mens bestået prøven gennem en analytisk C18 kolonne (perle størrelse 1.7 µm). Bekræfte peptid produkt af massespektrometri.
    Bemærk: UPLC er koblet til en electrospray Ionisation massespektrometri (ESI-MS) og Tandem Quadrupol detektor.
  9. Lyophilize de rigtige fraktioner af den ønskede peptid i en rund bund kolbe, ved at anvende et vakuum af 0.052 mbar, til en fluffy pulver. Par vakuumpumpe til en frysning enhed vedligeholdes på-78 ° C. opbevares ved-80 ° C, på ubestemt tid.
  10. Bruge de frysetørrede peptid til at forberede en stamopløsning af 1 mM i en blanding af acetonitril: DMF: analysekvalitet vand på 1:1:1 for eksperimenterne. Denne opløsning kan opbevares i mindst 6 måneder, som peptider ikke samlet i denne løsning.

2. Forberedelse af injektion blandingen

  1. forberede fosfatbufferet saltopløsning (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) for fortynding de frysetørrede peptider.
  2. Opløses peptid til en endelig koncentration på 20 µM i PBS. Forberede denne løsning frisk. Bland godt og opbevares på is indtil injektion. Ikke overstiger 30 min for at forhindre akkumulering i løsning.

3. Anæstesi

  1. Forbered stamopløsningen af anæstetika, 0,1% ethyl-m-aminobenzoat methanesulphonate (MESAB), i regelmæssig fiskevand fra den cirkulerende systemet. Forberede bedøvelse løsning til en endelig koncentration på 0,0025% (v/v).
  2. Fjerne det ønskede antal fisk fra deres kampvogne i en transport beholder med 5 L system vand.
  3. Halv-Fyld en plastik petriskål (90 mm) med 40 mL anæstetika. Brug denne parabol for injektioner.
  4. Ruger fisk i bedøvelsesmidler, indtil bevægelsen opercular er ophørt.

4. Cerebroventricular mikroinjektion

  1. forberedelse af injektion apparater
    1. Forbered glas injektion kapillærer ved hjælp af en nål aftrækker med følgende parametre: varme cyklus, 537 trækker cyklus, 250; hastighed, 1.5 s; tid, 80 ms.
    2. bringe indstillingen pres på trykkilden til 25 psi.
    3. Microinjector parametre er angivet følgende: hold presset 20 psi; skubbe pres 10 psi; periodeværdi 2.5; gating værdien 100 ms.
    4. Belastning glas kapillær med injektion løsning. Indsæt glas kapillær i mikroinjektion holderen. Justere injektion vinkel på 45°.
      Bemærk: Mere detaljerede protokoller kan findes som beskrevet i referencer 27 , 46.
  2. Sted én fisk ind i en ny petriskål fyldt med bedøvelse løsning (som i trin 3.3).
  3. Hold fisken med pincet og orient injektionsvæske.
  4. Genererer en slids med spidsen af en 30 G nål i kraniet via det optiske tectum hvor to laterale pladerne mødes. Indsæt ikke spidsen i hjernevævet, dette vil forårsage blødning og skader. Se referencer 27 , 45 , 46 for yderligere detaljer.
  5. Indsætte glas kapillær ind i slidsen.
    1. Bruger kun spidsen af nålen og trænge ikke mere end 1 mm gennem kraniet. Holde holde fisken og sæt spidsen af glas kapillær gennem webstedet indsnit.
    2. Orient spidsen af glas kapillær mod telencephalon på en 45° vinkel. Injicér 1 µL af opløsningen. Flydende spreder umiddelbart efter injektion.

5. Recovery

  1. sted fisken tilbage til en transport beholder indtil den genindvinder. Tilslut beholderen til det regelmæssigt cirkulerende fiskevand til at sikre optimal vandkvalitet.
    Bemærk: Nyttiggørelse bør normalt tage 1 min. Hvis det tager længere tid, fisken skal holdes i anæstetika i kortere tid (dette skal optimeres ved eksperimentatoren).

6. Væv forberedelse og Sectioning

  1. vente på en ønskede periode før du ofrer fisken.
    Bemærk: Dette afhænger af den eksperimentelle spørgsmål. Amyloid aflejring kan ses så tidligt som 1 dag efter indsprøjtning.
  2. Ofre fisk ved hjælp af passende metode afhængig af de etiske regler (f.eks. behandling af fisk med 0,1 M MESAB).
  3. Skære åbne kraniet ovenfor den optiske tectum med spidse forcep på den dorsale side og dissekere hovedet lige bag brystfinnen ved hjælp af en skalpel.
  4. Løse hoveder med 2% PARAFORMALDEHYD (PFA) natten over ved 4 ° C. Brug 3 mL af PFA pr. indbygger i et plastikrør med skrue låg.
    Forsigtig: Bære de egnede personlige værnemidler når håndtering PFA.
  5. For cryoprotection og afkalkning, vaske hovedet tre gange i 0,1 M fosfat Buffer (pH 7,4), derefter overføre dem til 20% sucrose/20% ethylendiamintetra (EDTA) opløsning og inkuberes natten over ved 4 ° C.
  6. Til at integrere væv i skæring harpiks, fryse hoveder i 7,5% gelatin/20% rørsukkeropløsning plast histologi forme på tøris (ca. 3-5 min. til at fryse en blok). Gemme prøver på-80 ° C eller fortsætte til det næste trin (cryosectioning).
  7. Afsnit lederne i 12 µm tykt snit frosset organmateriale ved hjælp af en kryostaten som beskrevet 28 , 42. Overføre snit frosset organmateriale direkte på glas dias og opbevares ved-20 ° C for langvarige skik.

7. Immunhistokemisk farvning og mikroskopi

Bemærk: udføre alle inkubation trin i en fugtig kammer. Og alle skridt, vask er i 10 min.

  1. Tørre sektioner i 30 min. ved stuetemperatur. Efter optøning, vaske afsnittene to gange i PBS og en gang i PBSTx (PBS med 0,03% Triton-X-100).
  2. Incubate med den primære antistof (anti-Aβ42 antistoffer; 1: 500 fortynding i PBSTx) på 4 ° C natten. efter dag, vaske en gang i PBS og to gange i PBSTx.
  3. Ruger sektioner med den sekundære antistof (registrering af fluorescens-tilkoblet, 1: 500 fortynding) sammen med DAPI (1 μg/mL) i PBSTx i 2 timer ved stuetemperatur.
  4. Vaskes tre gange i PBSTx. Efter den sidste vask, montere dias med en coverslip ved hjælp af 100 μL 70% glycerol.
  5. Erhverve fluorescerende billeder ved hjælp af en Konfokal mikroskop (for eksempel med 20 X PL APO N.A. 0,7 mål med 488 excitation rækkevidde og en standard grønt filter; figur 2) 39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HPLC blev brugt til at rense den syntetiserede peptid og massespektrometri er blevet brugt til at karakterisere renset amyloid β peptider. HPLC kolonne blev opvarmet til 50 ° C til at forbedre adskillelse af Aβ peptider og alle fraktioner blev indsamlet. For at identificere den korrekt syntetiserede peptid, blev masse spektroskopi analyse udført for alle fraktioner. UPLC kromatogrammet viser renheden af sammensat. HPLC brøkdel, der gav et højdepunkt på UPLC (dvs., den korrekte masse at oplade forholdet mellem kræves amyloid β peptid) blev yderligere behandlet for eksperimenter (figur 2).

Funktionaliteten af peptider i danner aggregater kan vurderes ved hjælp af forskellige spektroskopiformer39,48,49, og også ved at inkubere peptider i PBS ved stuetemperatur for mere end 1 h, som vil udbytte aggregater. I dette tilfælde skal bundfald og store aggregater ses i løsning.

Efter cerebroventricular mikroinjektion, peptider samlede i hjernen og form amyloid depositioner (figur 3). Disse aggregater er for det meste ses som intracellulære depositioner, men også omkring blodkarrene. Disse sammenlægninger er tegn på en vellykket ophobning af amyloid peptider i vævet.

Figure 1
Figur 1: skematisk fremstilling af faststadie peptidsyntese, rensning, injektion og analyser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: karakterisering af indfødte amyloid-β42 peptid. Massespektrometri karakterisering af indfødte amyloid-β42 peptid (A) og CPP-tagged amyloid-β42 peptid (TR-Aβ42; B). (C) chromatografen af renset, indfødte og TR-Aβ42 peptid på ultrahøjfrekvenssystem pres Liquid Chromatography (UPLC). X-Axes betegne masse til ladning forhold (m/z) (A, B) og eluering tid i minutter (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: immunhistokemisk farvning af amyloid aflejring i en voksen zebrafisk hjernen sektion 1 dag efter indsprøjtning. Aβ42 er i grøn, og kerner er i blå. Påvisning af grønne klynger angiver effektiv Aβ42 sammenlægning. Skalere barer = 100 µm. Dette tal er blevet ændret fra reference39.

Peptid Peptid sekvens MW (g/mol)
AΒ42 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA 4514.1
TR-AΒ42 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA 5919.8

Tabel 1: Aβ42 og TR-Aβ42 peptid sekvenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De amyloid peptider kan ændres til at omfatte sekvens variationer eller forskellige tags. For eksempel, en scrambled amyloid peptid kan genereres, og peptider kan mærket med fluorescerende tags på N-terminus peptid afslutning eller markeret med carrier peptider39. Ligeledes, i denne protokol, carrier peptid er den celle-gennemtrængende peptid TR på grund af sin effektivitet til transport cargo dybt i hjernen væv39. Derudover tillader vores metode til injektion og analyser af forskellige peptider, der kan forårsage giftige sammenlægninger50,51. Derfor, vores system tilbyder en alsidig metode til manuel injektion af giftige proteiner i zebrafisk hjernen og analysere de cellulære virkningerne af sådanne toksicitet.

Amyloid peptider samlede hurtigt, og derfor bestandene skal holdes i opløsningen vand-DMF-acetonitril, og bør være blandet med PBS kun 0,5 h før injektionen. Hvis der er store aggregater i opløsningen, bør injektion løsning være forberedt kun 10 min før injektionen. Injektion effektivitet er en vigtig parameter for giver ensartede resultater. Henvises til vores tidligere JoVE papir46 til at udføre en god og ensartet indsprøjtning. Hvis ingen akkumulering ses efter indsprøjtning, skal injektion metode optimeres.

Vores metode er begrænset med hensyn til størrelsen af molekyler skal injiceres. Tidligere viste vi, at plasmider eller korte oligomerer kan tages op effektivt af ventrikulær celler45,46, dog for effektiv levering i dyb brain væv, store molekyler (fx, antistoffer, store proteiner) kan ikke bruges. Derudover lipofile molekyler kan ikke nemt trænger gennem de dybe væv fordi sådanne molekyler vil være afsondret af de første par lag af ventrikulær celler.

Generation af musemodeller af neurodegeneration er tidskrævende og vedligeholdelse af disse modeller er ret dyrt. Vores injektion metode er en hurtig model for giftige amyloid aflejring, og neurodegeneration. Derudover zebrafisk har en overlegen regenerative evne i forhold til pattedyr modeller og undersøgelser med fokus på hvordan hvirveldyr hjerner kunne montere en regenerering svar efter neurodegeneration vil helt sikkert nyde godt af hurtig assay systemer i zebrafisk.

Kvaliteten af den syntetiserede peptid og dens renhed er vigtigt for succesen for eksperimentet. For at sikre denne kvalitet, skal syntetiserede peptider grundigt karakteriseres ved hjælp af væskekromatografi og masse spektroskopi. Derudover er cirkulære dichroism og sammenlægning undersøgelser som beskrevet39 antydet.

Indsprøjtning i fisk hjernen er et afgørende skridt til at sikre en konsekvent sammenlægning og patologiske resultatet. En langsgående studie, der analyserer sammenlægning og clearance dynamikken af de amyloid peptider kan udføres, hvis det ønskes. Vi bruger en amyloid peptid koblet til et luftfartsselskab peptid for at sikre ligelig fordeling og indtrængen i hjernevæv. Frakoblet amyloid peptider også give lignende resultater men tidslinjen af distribution og sammenlægning er forskellige39. Eksperimentatoren kan vælge den ønskede version af amyloid peptider afhængig af formålet.

Der er stort potentiale for brug af vores metode i kombination med andre undersøgelser, manipulation. CVMI af amyloid peptider kan kombineres med lægemiddelsbehandlinger eller injektion af andre forbindelser til at teste de synergistiske virkninger af forskellige molekyler i en sygdom tilstand. Vores hurtige og roman model kan i sidste ende, også bruges til små narkotika-screening tilgange i en let laboratorium indstilling.

Vores manuel mikroinjektion metode kan anvendes effektivt at tilføre voksen zebrafisk hjernen til at efterligne amyloid aflejring amyloid peptider. Amyloid depositioner i hjernen fremkalde cytotoksisk effekt og resultater i AD patologi, dermed vise en akut neurodegenerative tilstand. Fremtidsperspektiver for denne metode ville være at udnytte det i en akut degenerative model til at studere neuropatologiske i zebrafisk hjerne og regenerativ svaret heraf. Sådan forståelse vil give en vigtig platform for at designe nye terapeutiske strategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at videregive

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af DZNE og Helmholtz Association (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) og DFG (KI1524/6) (C.K.); og af Leibniz Association (SAW-2011-IPF-2) og BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Vi vil også gerne takke Ulrike Hofmann for peptidsyntese og Nandini Asokan, Prayag Murawala og Elly Tanaka til hjælp under optagelserne af proceduren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fmoc-protected amino acids IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1030 Activator
Oxyma IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1180 Racemization supressor
N,N-Diisopropylethylamine IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-003 Base
Dimethylformamide IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-004 Solvent
N-Methylmorpholine Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany A12158 Base
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) 157260 ALDRICH Activator
Piperidine MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 822299 Fmoc deprotection reagent
Dichlormethane (DCM) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 106050 Solvent
Formic acid (FA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 100264 Buffer component for HPLC
Trifluoroacetic acid (TFA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 808260 Clevage Mixture reagent
Triisopropylsilane(TIS) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 233781 ALDRICH Clevage Mixture reagent
Acetonitrile (for UPLC/LCMS) Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH 34967-1L Solvent
Acetonitrile (for HPLC) VWR International Ltd, England 83639.320 Solvent
Diethylether VWR International Ltd, England 23811.326 Solvent for peptide precipitation
Dithiotritol (DTT) VWR International Ltd, England 0281-25G Clevage Mixture reagent
TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) S30023 Solid phase for SPPS
Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters Intavis AG (Cologne, Germany) 34.274 Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 11806-50-N Filteration of precipitated peptides
Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe KC78.1 Pre-filteration for HPLC
Peptide Synthesizer Intavis, Cologne, Germany ResPep SL Automated solid-phase peptide synthesizer
Water Alliance HPLC Waters, Milford Massachusetts, USA Waters 2998, Waters e2695 Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)
PolymerX, bead size 10μm, 250x10 mm Phenomenex Ltd. Germany 00G-4328-N0 Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column
Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA LCPAK0001 Water purification system
Filtration Unit Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 16307 Filtration unit for peptide precipitation
UPLC Aquity with UV Detector Waters, Milford Massachusetts, USA M09UPA 664M Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50x2.1 mm Waters, Milford Massachusetts, USA 186002350 Analytical C18 column
ACQUITY TQ Detector Waters, Milford Massachusetts, USA QBB908 Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany 16706, 101542 Lyophilizer with vaccum pump
Paradigm plate reader Beckman Coulter
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) Sigma-Aldrich A5040
Petri dishes Sarstedt 821.472
Phosphate-buffered saline Life Technologies, GIBCO 10010-056
Needle Becton-Dickinson 305178
Dissecting microscope Olympus, Leica, Zeiss Varies with the manufacturer
Dumont Tweezers World Precision Instruments 501985
Gillies Dissecting Forceps World Precision Instruments 501265
Glass injection capillaries World Precision Instruments TWF10
PicoNozzle World Precision Instruments 5430-12
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments SYS-PV820
Ring illuminator; Ring Light Guide Parkland Scientific ILL-RLG
Cryostat Leica CM1950

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
  3. Serpell, L. C. Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
  4. Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer's disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
  5. Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
  6. Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
  7. Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer's disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
  8. McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
  9. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
  10. Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer's disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
  11. Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
  12. Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
  13. Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
  14. Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
  15. Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
  16. Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
  17. Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
  18. Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
  19. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  20. Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
  21. Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer's disease? Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
  22. Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer's disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
  23. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
  24. Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
  25. Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
  26. Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
  27. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).
  28. Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
  29. Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
  30. McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
  31. Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
  32. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
  33. Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
  34. Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
  35. Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
  36. Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
  37. Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
  38. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  39. Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
  40. Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
  41. Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
  42. Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
  43. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  44. Katz, S., et al. A Nuclear Role for miR-9 and Argonaute Proteins in Balancing Quiescent and Activated Neural Stem Cell States. Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
  45. Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073 (2015).
  46. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
  47. Sewald, N., Jakubke, H. Peptides: Chemistry and Biology. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. (2009).
  48. Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chemistry. 22 (25), 8685-8693 (2016).
  49. Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
  50. Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
  51. Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
  52. Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).

Tags

Neurovidenskab spørgsmålet 128 Amyloid β42 zebrafisk neurodegeneration cerebroventricular mikroinjektion Alzheimers sygdom faste fase faststadie peptidsyntese
Modellering Amyloid-β42 toksicitet og Neurodegeneration i voksen zebrafisk hjerne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhattarai, P., Thomas, A. K.,… More

Bhattarai, P., Thomas, A. K., Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Mashkaryan, V., Zhang, Y., Kizil, C. Modeling Amyloid-β42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (128), e56014, doi:10.3791/56014 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter