Summary
Dit protocol beschrijft de synthese, karakterisering en injectie van monomeer amyloid-β42 peptiden voor het genereren van amyloïde toxiciteit in volwassen zebrafish om een model van de ziekte van Alzheimer, gevolgd door histologische analyses en detectie van samenvoegingen.
Abstract
De ziekte van Alzheimer (AD) is een slopende neurodegeneratieve ziekte in welke accumulatie van giftige amyloid-β42 (Aβ42) peptiden leidt tot synaptic degeneratie, ontsteking, neuronale dood, en leren van tekorten. Mensen kunnen niet verloren neuronen in het geval van AD ten dele als gevolg van verminderde proliferatieve capaciteit van de neurale stamcellen/voorlopercellen (NSPCs) en de verlaagde neurogenese regenereren. Daarom, efficiënte regeneratieve therapie moeten ook het versterken van de proliferatie neurogene capaciteit van NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is een regeneratieve organisme, en we kunnen leren van de fundamentele moleculaire programma's waarmee we kunnen ontwerpen therapeutische benaderingen aan te pakken van AD. Om deze reden was de generatie van een AD-achtig model in zebrafish noodzakelijk. Met behulp van onze methodologie, kunnen we introduceren synthetische derivaten van Aβ42 peptide met weefsel indringend vermogen in het brein van volwassen zebrafish, en analyseren van de pathologie van de ziekte en de regeneratieve reactie. Het voordeel ten opzichte van de bestaande methoden of dierlijke modellen is dat zebrafish kan ons leren hoe een gewervelde brein kan natuurlijk regenereren, en dus helpen ons voor de behandeling van menselijke neurodegeneratieve ziekten beter richten op endogene NSPCs. Dus, het model van de amyloid-toxiciteit vastgesteld in de hersenen van volwassen zebrafish kan openen nieuwe mogelijkheden voor onderzoek op het gebied van de neurowetenschappen en klinische geneeskunde Bovendien is de eenvoudige uitvoering van deze methode zorgt voor kosteneffectieve en efficiënte experimentele evaluatie. Dit manuscript beschrijft de synthese en de injectie van Aβ42 peptiden in zebrafish hersenen.
Introduction
AD is een chronische progressieve ziekte die wordt gekenmerkt door het verlies aan neuronen en synapses in de hersenschors1,2,3,4,5. De klassieke neuropathologische kenmerken van AD zijn de afzetting van amyloid peptiden en vorming van de neurofibrillary tangles (NFTs)6. Seniele plaques, ook bekend als amyloïde plaques, zijn samengesteld uit amyloid-β (Aβ) peptiden die vormen van β-geplooid structuren in de hersenen parenchym5. De ophoping van Aβ42 in AD patiënten heeft een vroege en kritische rol bij progressie van de ziekte. AD triggert een cascade van gebeurtenissen die leiden tot synaptic dysfunctie, verminderde plasticiteit en neuronale verlies7,8,9,10.
Het volwassen brein van teleost zebrafish dient als een uitstekend model voor het bestuderen van de regulering van de stamcel plasticiteit11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 en diverse ziekten in het centrale zenuwstelsel (CNS), met inbegrip van AD21,22,23 ,24. Als gevolg van een breed scala van beschikbare experimentele methoden19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, deze studies zijn informatief en haalbaar. Zebrafish kan het aanvullen van de CNS13,15,32,33,34,35,,36,,37, 38, gedeeltelijk met behulp van moleculaire programma's geactiveerd na neuronale verlies19,39,40,41,42,43, 44. Daarom, tot oprichting van een neurodegeneratieve ziekte model in zebrafish kan helpen nieuwe kwesties met betrekking tot de regeneratieve vermogen en stamcel biologie in gewervelde hersenen.
Onlangs, ontwikkelde we een model van de amyloïde toxiciteit in volwassen zebrafish hersenen door het injecteren van synthetische Aβ42 peptiden (tabel 1)39. Deze financiële injectie veroorzaakt neurodegeneratie fenotypen denken aan menselijk brein pathologie (b.v., celdood, microglial activering, synaptic degeneratie en geheugen tekorten), die aangeeft dat zebrafish kan worden gebruikt voor het opwekken neurodegeneratie in zebrafish hersenen, Aβ42 peptiden kunnen worden opgespoord met immunohistochemische technieken, en moleculaire mechanismen van regeneratie in volwassen zebrafish die CNS kan worden geïdentificeerd39. In dit protocol tonen we de injectie van synthetische amyloïde peptiden in de hersenen van de zebravis met behulp van een cerebroventricular injectie (CVMI) methode27,39,45,46 om na te bootsen amyloïde afzetting (Figuur 1). CVMI biedt een nieuwe manier van het leveren van de peptiden, die statistische na injectie als β-sheet structuren en uitoefenen toxiciteit. De peptiden zijn gelijkmatig verspreid in de hersenen, gericht op de ventriculaire gebied langs de gehele rostro-caudal as45. Bovendien kunt deze methode voor het analyseren van de morfologische en moleculair reactie van de NSPCs in volwassen zebrafish hersenen na amyloïde insluitsels. Dergelijk onderzoek levert ons een inzicht voor succesvolle hersenen reparatie bij zoogdieren. Onze methode kan worden gebruikt om te begrijpen van de nodige moleculair mechanisme van de reactie van een succesvolle regeneratie na AD-achtige symptomen voor het opwekken van aanvulling van verloren neuronen en functionele herstel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
dit protocol is een standaardprocedure die is voorgesteld door de EU-richtsnoeren (2010/63) en de European Society for vis modellen in de biologie en de geneeskunde (EuFishBioMed) in Karlsruhe Instituut van technologie (KIT). Alle methoden die worden beschreven na hier zijn goedgekeurd door de ethische Commissie (Landesdirektion Dresden; documentnummer TVV-52/2015).
1. voorbereiding van de Peptide van de Aβ42
- Synthesize peptiden (Zie tabel 1) met behulp van de standaard 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-chemie met 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) als de koppeling reagens op een geautomatiseerde solid-phase peptide synthesizer 52. De omvang van de synthese was 100 µmol.
- Laden de geautomatiseerde peptide synthesizer met 500 mg van de hars Fmoc-beschermd als de vaste fase (laadvermogen van 0,2 mmol/g). Laden van de opgeloste Fmoc-beschermd aminozuren in een concentratie van 0,5 M in het gebruikte volume en zoals berekend voor de respectieve synthesizer.
Opmerking: De berekeningen worden gemaakt om de koppeling van elk aminozuur Fmoc-beschermd tweemaal met 5 keer overmaat van elke bouwsteen naar de hars 47. - Los de benodigde reagentia voor peptide synthese in dimethlyformamide (DMF). Bijvoorbeeld de activator, HBTU, met een concentratie van 0.48 M, 45% v/v N-Methylmorfoline (NMM) (de basis), en 5% v/v azijnzuur-Anhydride (de overkoepelende mengsel) voor te bereiden op het niet hebben gereageerd amino groepen cap.
- Alle de peptiden klieven van de hars door het continu mengen van de solide ondersteuning met behulp van een roerwerk in een mengsel van vers bereide decollete, bestaande uit trifluorazijnzuur (TFA): Triisopropylsilane(TIS): water: Dithiothreitol (DTT) bij 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2,5 (m/v), voor 4 h. gebruiken 10 mL voor de omvang van de synthese van 100 µmol.
- Neerslag het gekloofd product door het decollete mengsel toevoegen aan 100 mL diethylether ijskoud. Passeren van een filtratie-eenheid met een filter van polytetrafluorethyleen (PTFE) met een poriegrootte van 0,45 µm en wassen met 20 mL diethylether ijskoude.
- De gefilterde peptide van het koffiefilter verzamelen en los 100 mg geprecipiteerde peptide in 5 mL gedestilleerd gedeïoniseerd water: acetonitril op 1:1.
- Zuiveren via omgekeerde-fase hogedruk vloeibare chromatografie (HPLC) op een semi-preparatieve HPLC uitgerust met een poreuze polystyreen divinylbenzeen kolom kraal maat 10 µm.
- Verwarm de kolom en onderhouden bij 50 ° C een kolom apparatuur voor verwarming gebruiken. Verzamelen van alle van de grote fracties met behulp van een geautomatiseerde breuk verzamelaar door houdende toepassing van een helling van 5% tot 100% oplosmiddel B meer dan 25 min op 4 mL/min.
Opmerking: Oplosmiddel A is 0,1% TFA in water en oplosmiddel B is 0,1% TFA in acetonitril 52. - Toezicht op het chromatogram op 220 nm, de juiste pieken verzamelen en analyseren met behulp van de LC-MS.
- Verwarm de kolom en onderhouden bij 50 ° C een kolom apparatuur voor verwarming gebruiken. Verzamelen van alle van de grote fracties met behulp van een geautomatiseerde breuk verzamelaar door houdende toepassing van een helling van 5% tot 100% oplosmiddel B meer dan 25 min op 4 mL/min.
- Bevestigen de zuiverheid door analytische omgekeerde fase ultra-hoge druk vloeibare chromatografie (UPLC) op 220 nm door te controleren met een UV-Detector tijdens het passeren van het monster door een kolom voor analytische C18 (kraal grootte 1.7 µm). Bevestig de peptide product door massaspectrometrie.
Opmerking: De UPLC is gekoppeld aan een electrospray ionisatie massaspectrometrie (ESI-MS) en Tandem vierpolige Detector. - Lyophilize de juiste breuken van de gewenste peptide in een kolf met ronde bodem, door een vacuüm van 0.052 mbar, tot een pluizige poeder toe te passen. Koppel de vacuümpomp aan een bevriezing eenheid op-78 ° C. winkel bij-80 ° C, voor onbepaalde tijd gehandhaafd.
- De gelyofiliseerd peptide gebruiken om te bereiden van een stamoplossing van 1 mM in een mengsel van acetonitril: DMF: analytisch zuiver water 1:1:1 voor de experimenten. Deze oplossing kan worden opgeslagen voor ten minste 6 maanden, aangezien de peptiden niet in deze oplossing aggregaat doen.
2. Voorbereiding van het mengsel injectie
- -fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM nb 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) voor te bereiden voor het verdunnen van het gelyofiliseerd peptiden.
- Los de peptide aan een eindconcentratie van 20 µM in PBS. Deze oplossing vers bereiden. Meng goed en bewaren in de ijskast tot de injectie. Niet meer dan 30 minuten om te voorkomen dat de samenvoeging in oplossing.
3. Verdoving
- voorbereiden de stockoplossing van de verdoving, 0,1% ethyl-m-aminobenzoaat methanesulphonate (MESAB), in regelmatig vis water uit de circulerende systeem. Bereid de oplossing van de anaesthetization om een eindconcentratie van 0.0025% (v/v).
- Verwijderen van het gewenste aantal vis uit hun tanks in een container vervoer met 5 L systeem water.
- Half-Vul een plastic petrischaal (90 mm) met 40 mL verdoving. Gebruik dit gerecht voor injecties.
- De vis in de verdoving uit te broeden, totdat de operculaire beweging heeft opgehouden.
4. Cerebroventricular Microinjection
- voorbereiding van injectie apparatuur
- voorbereiden het glas injectie haarvaten met behulp van een naald trekker met de volgende parameters: verwarming cyclus, 537; trekken cyclus, 250; snelheid, 1.5 s; tijd, 80 ms.
- brengen de drukafstelling op de bron van de druk naar 25 psi.
- De microinjector parameters ingesteld op de volgende: ruim 20 psi druk; uitwerpen druk 10 psi periode waarde 2.5; gating waarde 100 ms.
- Laden de glazen viscometerbuizen met de oplossing voor injectie. De glazen viscometerbuizen in de houder microinjection invoegen. Aanpassen van de hoek van de injectie tot 45°.
Opmerking: Meer gedetailleerde protocollen kunnen worden gevonden zoals beschreven in verwijzingen 27 , 46.
- Plaats één vis in een nieuwe petrischaal gevuld met anaesthetization oplossing (zoals in stap 3.3).
- Houden de vis met de pincet en de Oriënt voor injectie.
- Genereren een spleet met de punt van een naald 30 G in de schedel via de optische tectum waar de twee zijdelingse platen elkaar ontmoeten. Voeg niet de tip in het hersenweefsel, dit zou bloeden en schade veroorzaken. Zie referenties 27 , 45 , 46 voor extra details.
- De glazen viscometerbuizen in de gleuf invoegen.
- Gebruiken van slechts het topje van de naald en niet meer dan 1 mm door de schedel doen doordringen. Houd ingedrukt de vis en breng de tip van de glazen capillaire via de site van de incisie.
- Oriënteren op het puntje van het glas capillaire naar de telencephalon in een hoek van 45°. Injecteren 1 µL van de oplossing. De vloeistof verspreidt onmiddellijk na injectie.
5. Herstel
- plaats de vis terug naar een container vervoer tot het herstelt. De container verbinden met het regelmatig circulerende water vis om optimale waterkwaliteit.
Opmerking: Het herstel moet normaal gesproken duren 1 min. Als het langer duurt, de vis moet worden bewaard in de verdoving voor een kortere tijd (dit moet worden geoptimaliseerd door de experimentator).
6. Weefsel voorbereiding en Sectioning
- wachten op een gewenste periode van tijd voordat de vis offeren.
Opmerking: Dit hangt af van de experimentele vraag. Amyloïde afzetting kan worden gezien zo spoedig 1 dag na injectie. - De vis met de juiste methode afhankelijk van de ethische regels offeren (b.v., behandelen de vis met 0,1 M MESAB).
- De schedel boven de optische tectum met puntige forcep aan de dorsale zijde opengesneden en ontleden de kop net achter de borstvin met behulp van een scalpel.
- Bevestigen de hoofden met behulp van 2% paraformaldehyde (PFA) 's nachts bij 4 ° C. gebruik 3 mL PFA per hoofd in een kunststof buis met een schroefdeksel.
Let op: Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bij hantering van de PFA. - Cryoprotection en botontkalking, wassen de hoofden driemaal in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7.4), dan ze vervolgens overbrengen naar 20% sucrose/20% ethyleendiamminetetra (EDTA) oplossing en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
- Inbedden van het weefsel in de hars, afdelen bevriezen de hoofden in gelatin/20% 7,5% sacharoseoplossing in kunststof histologie mallen op droog ijs (ongeveer 3-5 min te bevriezen van een blok). Opslaan van de monsters bij-80 ° C of doorgaan naar de volgende stap (cryosectioning).
- Afdeling de hoofden in 12 µm dik cryosecties met behulp van een cryostaat als beschreven 28 , 42. De cryosecties rechtstreeks op glas dia's overzetten en opslaan bij-20 ° C voor langdurig gebruik.
7. Immunohistochemische kleuring en microscopie
Opmerking: alle incubatie stappen in een bevochtigde kamer. En alle wassen stappen zijn voor elke 10 min.
- De secties gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur drogen. Na het ontdooien, wassen de secties tweemaal in PBS en eenmaal in PBSTx (PBS met 0,03% Triton-X-100).
- Incubate met het primaire antilichaam (anti-Aβ42 antistof; 1:500 verdunning in PBSTx) bij 4 ° C's nachts. wassen na dag, één keer in PBS en tweemaal PBSTx.
- Broeden de secties met de secundair antilichaam (fluorescentie-coupled detection, 1:500 verdunning) samen met de DAPI (1 μg/mL) in PBSTx gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Wassen drie keer in PBSTx. Na het laatste wassen, mount de dia's met een dekglaasje aan met behulp van 100 μl 70% glycerol.
- Ophaal fluorescerende beelden met behulp van een confocal microscoop (bijvoorbeeld met 20 X PL APO N.A. 0,7 doelstelling met 488 excitatie bereik en een standaard groen filter; Figuur 2) 39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HPLC werd gebruikt voor het zuiveren van de gesynthetiseerde peptide en massaspectrometrie is gebruikt voor het karakteriseren van de gezuiverde amyloïde β-peptiden. De HPLC-kolom werd verwarmd tot 50 ° C om de scheiding van de Aβ peptiden en alle fracties werden verzameld. Om te identificeren van de correct samengestelde peptide, werd massaspectrometrie analyse uitgevoerd voor alle fracties. Het chromatogram UPLC toont de zuiverheid van de stof. De HPLC-fractie dat leverde één piek op de UPLC (dat wil zeggen, de juiste massa in rekening te brengen van de verhouding van de vereiste amyloïde β-peptide) werd verder verwerkt voor experimenten (Figuur 2).
De functionaliteit van de peptiden in de vorming van aggregaten kan worden beoordeeld met behulp van de verschillende spectroscopische methoden39,-48,49, en ook door de peptiden in PBS bij kamertemperatuur gedurende meer dan 1 uur aan het broeden, welke opbrengst aggregaten. In dit geval moeten precipitaten en grote aggregaten worden gezien in de oplossing.
Na cerebroventricular microinjection, de peptiden geaggregeerde in de hersenen en het formulier amyloïde depositie (Figuur 3). Deze aggregaten zijn meestal gezien als intracellulaire depositie, maar ook rond de bloedvaten. Dergelijke aggregaties zijn aanwijzingen van een succesvolle ophoping van amyloïde peptiden in het weefsel.
Figuur 1: schematische weergave van de peptide synthese, zuivering, injectie en analyses. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: karakterisering van inheemse amyloid-β42 peptide. Massaspectrometrie karakterisering van inheemse amyloid-β42 peptide (A) en de CPP-gelabeld amyloid-β42 peptide (TR-Aβ42; B). (C) de chromatograaf van de gezuiverde, native en TR-Aβ42 peptide op de Ultra-high druk vloeibare chromatografie (UPLC). X-Axes geven de verhouding van de massa-naar-charge (m/z) (A, B) en de elutie tijd in minuten (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: immunohistochemische kleuring van amyloïde afzetting in een volwassen zebrafish hersenen sectie 1 dag na injectie. Aβ42 is in het groen, en kernen zijn in het blauw. Detectie van groene clusters geeft aan efficiënte Aβ42 aggregatie. Schaal bars = 100 µm. Dit cijfer is gewijzigd verwijzing €39.
| Peptide | Peptide volgorde | MW (g/mol) | |||
| AΒ42 | DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA | 4514.1 | |||
| TR-AΒ42 | GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA | 5919.8 | |||
Tabel 1: Aβ42 en TR-Aβ42 peptide reeksen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De amyloïde peptiden kunnen worden gewijzigd zodat reeks variaties of verschillende labels. Bijvoorbeeld, een gecodeerde amyloïde peptide kan worden gegenereerd, en de peptiden kunnen worden gelabeld met de fluorescerende labels op de N-terminus van de peptide-einde of gelabeld met vervoerder peptiden39. Ook in dit protocol is de peptide vervoerder de cel-penetrating peptide TR vanwege de doeltreffendheid ervan naar vervoer cargo diep in de hersenen weefsel39. Daarnaast zorgt onze methode voor injectie en analyses van verschillende peptiden die leiden toxische aggregaties50,51 tot kunnen. Daarom, ons systeem biedt een veelzijdige methode voor Handleiding injectie van giftige proteïnen in de hersenen van de zebravis en analyseren van de cellulaire gevolgen van dergelijke toxiciteit.
Amyloïde peptiden statistische snel, en dat is dus, de voorraden moeten worden bewaard in de water-DMF-acetonitrilmengsel oplossing, en moeten worden gemengd met PBS enige 0,5 h vóór de injectie. Als er grote aggregaten in de oplossing, moet de oplossing van de injectie bereid zijn slechts 10 minuten vóór de injectie. Injectie-efficiëntie is een belangrijke parameter voor consistente resultaten oplevert. Raadpleeg onze vorige JoVE paper46 voor het uitvoeren van een goede en consistente injectie. Als geen aggregatie wordt gezien na injectie, moet de methode van de injectie worden geoptimaliseerd.
Onze methode is beperkt in termen van de grootte van de moleculen te worden geïnjecteerd. We toonden eerder dat de plasmiden of korte oligomeren kunnen worden overgenomen efficiënt door de ventriculaire cellen45,46, echter voor efficiënte levering in diepe brein weefsels, grote moleculen (bijv., antilichamen, grote eiwitten) kunnen niet worden gebruikt. Bovendien lipofiele moleculen kunnen niet gemakkelijk doordringen tot de diepe weefsels omdat dergelijke moleculen door de eerste paar lagen van ventriculaire cellen zal worden afgezonderd.
De generatie van Muismodellen van neurodegeneratie is tijdrovend en onderhoud van deze modellen is vrij duur. Onze methode injectie is een snelle model voor giftige amyloid depositie, en neurodegeneratie. Bovendien, de zebravis heeft een superieure regeneratieve vermogen ten opzichte van zoogdieren modellen, en onderzoeken gericht op hoe gewervelde hersenen zou kunnen monteren een regeneratie reactie nadat neurodegeneratie zal zeker profiteren van de snelle test systemen in zebravis.
De kwaliteit van de gesynthetiseerde peptide en de zuiverheid zijn belangrijk voor het succes van het experiment. Om ervoor te zorgen deze kwaliteit, moeten gesynthetiseerde peptiden worden grondig gekarakteriseerd met behulp van vloeibare chromatografie en massaspectrometrie. Bovendien, worden circulair dichroïsme en aggregatie studies als beschreven39 voorgesteld.
Injectie in de hersenen van de vis is een cruciale stap om te zorgen voor een consistente aggregatie en pathologische uitkomst. Een longitudinale studie die de aggregatie en ruimen van bouwterreinen dynamiek van de amyloïde peptiden analyseert kan worden uitgevoerd, indien gewenst. We gebruiken een amyloïde peptide gekoppeld aan een peptide vervoerder om gelijke verdeling en penetratie in het hersenweefsel. Afgekoppeld amyloïde peptiden ook geven vergelijkbare resultaten maar de tijdlijn van de distributie en aggregatie is verschillende39. De experimentator kunt kiezen de gewenste versie van amyloïde peptiden afhankelijk van het doel.
Er is een groot potentieel voor het gebruik van onze werkwijze in combinatie met andere studies van manipulatie. CVMI van amyloïde peptides kan worden gecombineerd met de drug behandelingen of injectie van andere verbindingen voor het testen van de synergetische effecten van verschillende moleculen in een toestand van de ziekte. Uiteindelijk kan onze snelle en nieuwe model ook worden gebruikt voor kleinschalige drug-screening benaderingen in de instelling van een gemakkelijk laboratorium.
Onze handmatige microinjection methode kan efficiënt worden gebruikt om te injecteren amyloïde peptiden in de hersenen van de volwassen zebrafish na te bootsen amyloïde afzetting. Amyloïde afzettingen in de hersenen ontlokken cytotoxisch effect en resultaten in AD pathologie, vandaar het weergeven van een acute neurodegeneratieve aandoening. De vooruitzichten voor deze methode zou zijn om het te gebruiken in een acute degeneratieve model het neuropathologie in zebrafish hersenen en de regeneratieve reactie daarvan te bestuderen. Dergelijke begrip krijgt een belangrijk platform voor het ontwerpen van nieuwe therapeutische strategieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door DZNE en de Helmholtz Association (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518), en DFG (KI1524/6) (CK); en door het Leibniz Association (SAW-2011-IPF-2) en goedgekeurd (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Wij ook bedank Ulrike Hofmann voor peptide synthese en Nandini Asokan, Prayag Murawala en Elly Tanaka voor hulp tijdens het filmen van de procedure.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fmoc-protected amino acids | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS) | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1030 | Activator |
| Oxyma | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1180 | Racemization supressor |
| N,N-Diisopropylethylamine | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-003 | Base |
| Dimethylformamide | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-004 | Solvent |
| N-Methylmorpholine | Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany | A12158 | Base |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) | 157260 ALDRICH | Activator |
| Piperidine | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 822299 | Fmoc deprotection reagent |
| Dichlormethane (DCM) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 106050 | Solvent |
| Formic acid (FA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 100264 | Buffer component for HPLC |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 808260 | Clevage Mixture reagent |
| Triisopropylsilane(TIS) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 233781 ALDRICH | Clevage Mixture reagent |
| Acetonitrile (for UPLC/LCMS) | Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH | 34967-1L | Solvent |
| Acetonitrile (for HPLC) | VWR International Ltd, England | 83639.320 | Solvent |
| Diethylether | VWR International Ltd, England | 23811.326 | Solvent for peptide precipitation |
| Dithiotritol (DTT) | VWR International Ltd, England | 0281-25G | Clevage Mixture reagent |
| TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin | Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) | S30023 | Solid phase for SPPS |
| Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters | Intavis AG (Cologne, Germany) | 34.274 | Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 11806-50-N | Filteration of precipitated peptides |
| Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter | Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe | KC78.1 | Pre-filteration for HPLC |
| Peptide Synthesizer | Intavis, Cologne, Germany | ResPep SL | Automated solid-phase peptide synthesizer |
| Water Alliance HPLC | Waters, Milford Massachusetts, USA | Waters 2998, Waters e2695 | Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC) |
| PolymerX, bead size 10μm, 250x10 mm | Phenomenex Ltd. Germany | 00G-4328-N0 | Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column |
| Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA | LCPAK0001 | Water purification system |
| Filtration Unit | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 16307 | Filtration unit for peptide precipitation |
| UPLC Aquity with UV Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | M09UPA 664M | Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS |
| ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50x2.1 mm | Waters, Milford Massachusetts, USA | 186002350 | Analytical C18 column |
| ACQUITY TQ Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | QBB908 | Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) |
| CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 | Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany | 16706, 101542 | Lyophilizer with vaccum pump |
| Paradigm plate reader | Beckman Coulter | ||
| MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 821.472 | |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | |
| Needle | Becton-Dickinson | 305178 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | |
| Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | |
| Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | |
| Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | |
| PicoNozzle | World Precision Instruments | 5430-12 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | |
| Cryostat | Leica | CM1950 |
References
- LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
- Serpell, L. C. Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
- Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer's disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
- Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
- Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer's disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
- McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
- Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer's disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
- Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
- Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
- Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer's disease? Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
- Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer's disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
- Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
- Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
- Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
- Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
- Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).
- Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
- Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
- Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
- Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
- Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
- Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
- Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
- Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Katz, S., et al. A Nuclear Role for miR-9 and Argonaute Proteins in Balancing Quiescent and Activated Neural Stem Cell States. Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
- Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073 (2015).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
- Sewald, N., Jakubke, H. Peptides: Chemistry and Biology. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. (2009).
- Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chemistry. 22 (25), 8685-8693 (2016).
- Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
- Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
- Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
- Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).
