Summary
Questo protocollo descrive la sintesi, la caratterizzazione e l'iniezione dei peptidi monomerici amiloide-β42 per la generazione di tossicità dell'amiloide in zebrafish adulto per stabilire un modello di malattia di Alzheimer, seguito da analisi istologiche e rilevazione di aggregazioni.
Abstract
Morbo di Alzheimer (annuncio) è una malattia neurodegenerative in cui accumulo di amiloide tossico-β42 (Aβ42) peptidi conduce a degenerazione sinaptica, infiammazione, morte di un neurone debilitante e deficit dell'apprendimento. Gli esseri umani non possono rigenerare i neuroni persi nel caso di annuncio in parte a causa di alterata capacità proliferativa delle cellule staminali/progenitrici neurali (NSPCs) e ridotta neurogenesi. Di conseguenza, terapie rigenerative efficiente dovrebbero anche migliorare la proliferazione e neurogena capacità di NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) è un organismo rigenerativo, e possiamo imparare i programmi base molecolari con cui potremmo progettare approcci terapeutici per affrontare AD. Per questo motivo, la generazione di un modello di annuncio-come in zebrafish era necessaria. Utilizzando la nostra metodologia, possiamo introdurre derivati sintetici di Aβ42 peptide con capacità penetrante di tessuto nel cervello adulto zebrafish e analizzare la patologia della malattia e della risposta rigenerativa. Il vantaggio sopra i metodi esistenti o modelli animali è che zebrafish può insegnarci come un cervello dei vertebrati può rigenerare naturalmente e quindi ci aiutano a curare le malattie neurodegenerative umana meglio prendendo di mira NSPCs endogeno. Pertanto, il modello di tossicità dell'amiloide stabilito nel cervello adulto zebrafish può aprire nuove strade per la ricerca nel campo delle neuroscienze e della medicina clinica. Inoltre, la semplice esecuzione di questo metodo consente conveniente ed efficiente valutazione sperimentale. Questo manoscritto descrive la sintesi e l'iniezione di Aβ42 peptidi nel cervello di zebrafish.
Introduction
Annuncio è una malattia cronica progressiva caratterizzata dalla perdita di neuroni e sinapsi in corteccia cerebrale1,2,3,4,5. I marchi di garanzia neuropathological classiche dell'annuncio sono la deposizione dei peptidi amiloidi e formazione del neurofibrillary tangles (NFTs)6. Le placche senili, noto anche come placche amiloidi, sono composti da peptidi dell'amiloide-β (Aβ) che formano strutture β-pieghettato in parenchima del cervello5. L'accumulo di Aβ42 nei pazienti dell'annuncio ha un ruolo critico e primo in progressione di malattia. Annuncio innesca una cascata di eventi che conducono alla disfunzione sinaptica, plasticità alterata e perdita di un neurone7,8,9,10.
Il cervello adulto di teleostei zebrafish serve come un eccellente modello per studiare la regolazione della plasticità delle cellule staminali11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 e varie malattie nel sistema nervoso centrale (CNS), tra cui annuncio21,22,23 ,24. A causa di una vasta gamma di metodi sperimentali disponibili19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, questi studi sono informativi e fattibile. Zebrafish può ricostituire il CNS13,15,32,33,34,35,36,37, 38, in parte utilizzando programmi molecolari attivati dopo la perdita di un neurone19,39,40,41,42,43, 44. Quindi, che stabilisce un modello di malattia neurodegenerative in zebrafish può aiutare a affrontare le questioni romanzo per quanto riguarda biologia rigenerativa di capacità e di cellule staminali nel cervello dei vertebrati.
Recentemente, abbiamo sviluppato un modello di tossicità dell'amiloide nel cervello adulto zebrafish iniettando sintetico Aβ42 peptidi (tabella 1)39. Questa iniezione causato neurodegenerazione fenotipi ricordano la patologia del cervello umano (ad esempio, la morte delle cellule, l'attivazione microgliale, degenerazione sinaptica e i deficit di memoria), che indica che zebrafish può essere utilizzato per suscitare neurodegenerazione nel cervello di zebrafish, Aβ42 peptidi possono essere rilevati con gli stainings di immunohistochemical e meccanismi molecolari della rigenerazione in zebrafish adulto che CNS può essere identificato39. In questo protocollo, dimostriamo l'iniezione di peptidi sintetici dell'amiloide nel cervello zebrafish utilizzando un intracerebroventricolare iniezione (CVMI) metodo27,39,45,46 per imitare il deposito dell'amiloide (Figura 1). CVMI fornisce un nuovo modo di erogare i peptidi, che aggregano all'iniezione come β-foglio strutture ed esercitano tossicità. I peptidi sono distribuiti uniformemente in tutto il cervello, come target l'area ventricolare lungo l'intero asse rostro-caudale45. Inoltre, questo metodo consente per analizzare la risposta morfologica e molecolare di NSPCs nel cervello adulto zebrafish dopo inclusioni dell'amiloide. Tali studi ci fornirà un'idea per la riparazione del danno cerebrale successo nei mammiferi. Il nostro metodo può essere utilizzato per capire il meccanismo molecolare necessario di una risposta di successo di rigenerazione dopo annuncio-come i sintomi per indurre la rigenerazione dei neuroni persi e recupero funzionale.
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Protocol
questo protocollo è una procedura standard suggerita da orientamenti dell'Unione europea (2010/63) e della European Society for Fish modelli in biologia e medicina (EuFishBioMed) a Karlsruhe Insitute di Technology (KIT). Tutti i metodi descritti qui dopo sono stati approvati dalla Commissione etica (Landesdirektion Dresda; documento numero TVV-52/2015).
1. preparazione di Aβ42 Peptide
- Synthesize peptidi (Vedi tabella 1) usando la chimica standard 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) con 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) come il reagente di accoppiamento su un sintetizzatore di automatizzato del peptide di fase solida 52. La scala della sintesi era 100 µmol.
- Caricare il sintetizzatore di peptidi automatizzato con 500 mg di resina Fmoc-protetto come fase solida (capacità di carico di 0,2 mmol/g). Caricare i disciolti amminoacidi Fmoc-protetto ad una concentrazione di 0,5 M nel volume richiesto e calcolata per il sintetizzatore rispettivo.
Nota: I calcoli sono effettuati per consentire l'accoppiamento di ciascun amminoacido Fmoc-protetto due volte con eccesso di 5 volte di ogni blocco di costruzione per la resina 47. - Sciogliere i reagenti necessari per la sintesi peptidica in dimethlyformamide (DMF). Ad esempio, preparare l'attivatore, HBTU, ad una concentrazione di 0,48 M, 45% v/v N-metilmorpholin-(NMM) (base) e 5% v/v l'anidride acetica (la miscela di tappatura) per ricoprire i gruppi amminici non reagiti.
- Cleave tutti i peptidi dalla resina mescolando continuamente il supporto solido utilizzando un agitatore in una miscela preparata clivaggio composto da acido trifluoroacetico (TFA): Triisopropylsilane(TIS): acqua: ditiotreitolo (DTT) a 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2,5 (m/v), per 4 h. uso 10 mL per la scala di sintesi di 100 µmol.
- Precipitare il prodotto fenduto aggiungendo la miscela di fenditura per 100 mL di etere etilico ghiacciata. Passare attraverso un'unità di filtrazione contenente un filtro di politetrafluoroetilene (PTFE) con un diametro dei pori di 0,45 µm e lavare con 20 mL di etere etilico ghiacciata.
- Raccogliere il peptide filtrato dal filtro di carta e sciogliere 100 mg del peptide precipitato in 5 mL acqua distillata o deionizzata: acetonitrile 1:1.
- Purificare tramite cromatografia liquida fase inversa ad alta pressione (HPLC) su un semi-preparatorio HPLC dotato di una colonna di divinilbenzene polistirolo poroso di perlina dimensioni 10 µm.
- Pre-riscaldare la colonna e mantenere a 50 ° C, utilizzando una colonna dispositivo di riscaldamento. Raccogliere tutte le principali frazioni utilizzando un collettore automatico frazione applicando una sfumatura dal 5% al 100% di solvente B su 25 min a 4 mL/min
Nota: A solvente è 0,1% TFA in acqua e solvente B è 0,1% TFA in acetonitrile 52. - Monitorare il cromatogramma a 220 nm, raccogliere le cime appropriate e analizzare mediante LC-MS.
- Pre-riscaldare la colonna e mantenere a 50 ° C, utilizzando una colonna dispositivo di riscaldamento. Raccogliere tutte le principali frazioni utilizzando un collettore automatico frazione applicando una sfumatura dal 5% al 100% di solvente B su 25 min a 4 mL/min
- Conferma la purezza di analitica inversa fase ultra-alta pressione liquido cromatografia (UPLC) a 220 nm monitorando con un rivelatore UV mentre far passare il campione attraverso una colonna C18 analitica (perlina dimensioni 1,7 µm). Confermare il prodotto di peptidi mediante spettrometria di massa.
Nota: Il UPLC è accoppiato un spettrometria totale ionizzazione electrospray (ESI-MS) e Tandem quadrupolo Detector. - Lyophilize le frazioni corrette del peptide desiderato in un pallone a fondo tondo, applicando un vuoto di 0.052 mbar, per un soffice polvere. Accoppiare la pompa del vuoto ad un congelamento unità mantenuta a-78 ° C. Store a-80 ° C, a tempo indeterminato.
- Utilizzare il peptide liofilizzato per preparare una soluzione stock di 1 mM in una miscela di acetonitrile: DMF: acqua di grado analitico a 1:1:1 per gli esperimenti. Questa soluzione può essere conservata per almeno 6 mesi, come i peptidi non si aggregano in questa soluzione.
2. Preparazione della miscela di iniezione
- preparare il tampone fosfato salino (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na 2 HPO 4, 2mm KH 2 PO 4, pH 7.4) per diluire i peptidi liofilizzati.
- Sciogliere il peptide ad una concentrazione finale di 20 µM in PBS. Preparare questa soluzione fresca. Mescolare bene e conservare il ghiaccio fino al momento dell'iniezione. Non superare i 30 minuti per impedire l'aggregazione in soluzione.
3. Anestesia
sistema- preparare la soluzione di riserva degli anestetici, 0.1% m-aminobenzoate dell'etile methanesulphonate (MESAB), in acqua di pesci regolare la circolazione. Preparare la soluzione di anestetizzazione a una concentrazione finale di 0,0025% (v/v).
- Rimuovere il numero desiderato di pesce da loro carri armati in un contenitore di trasporto con 5 L di acqua sistema.
- Riempire a metà una plastica Petri (90 mm) con anestetici di 40 mL. Utilizzare questo piatto p.p.i.
- Incubare il pesce negli anestetici finché non ha cessato il movimento opercular.
4. Intracerebroventricolare Microinjection
- preparazione dell'apparato di iniezione
- preparare il vetro capillari di iniezione utilizzando un estrattore di ago con i seguenti parametri: riscaldamento ciclo, 537; trazione ciclo, 250; velocità, 1.5 s; tempo, 80 ms
- portare l'impostazione di pressione sulla fonte di pressione di 25 psi.
- Impostare i parametri di microinjector seguenti: hold pressione 20 psi; espellere pressione 10 psi; valore periodo 2,5; gating valore 100 ms.
- Caricare il capillare di vetro con la soluzione di iniezione. Il titolare di microiniezione, inserire il capillare di vetro. Regolare l'angolo di iniezione a 45°.
Nota: Protocolli più dettagliati possono essere trovati come descritto in riferimenti 27 , 46.
- Il un pesce posto in una nuova piastra di Petri riempito con soluzione di anestetizzazione (come descritto al punto 3.3).
- Tenere il pesce con il forcipe e orient iniettabile.
- Generare una fessura con la punta di un ago 30g nel cranio sopra il tectum ottica dove si incontrano le due piastre laterali. Non inserire la punta nel tessuto cerebrale, questo causerebbe danni e sanguinamento. Vedi riferimenti 27 , 45 , 46 per ulteriori dettagli.
- Inserire il capillare di vetro nella fessura.
- Utilizzare solo la punta dell'ago e non penetrano più di 1 mm attraverso il cranio. Continuare a tenere premuto il pesce e inserire la punta del capillare attraverso il sito di incisione vetro.
- Consente di orientare la punta del vetro capillare verso il telencefalo un'angolazione di 45°. Iniettare 1 µ l della soluzione. Il liquido si disperde immediatamente dopo l'iniezione.
5. Recupero
- posto il pesce torna a un contenitore di trasporto fino a quando si recupera. Collegare il contenitore per l'acqua di pesce regolarmente circolanti per garantire la qualità dell'acqua ottimale.
Nota: Il recupero dovrebbe essere 1 min. Se prende più lungamente, il pesce deve essere conservato negli anestetici per un tempo più breve (questo deve essere ottimizzato dallo sperimentatore).
6. Preparazione dei tessuti e sezionamento
- attesa per un periodo di tempo prima di sacrificare il pesce desiderato.
Nota: Questo dipende dalla domanda sperimentale. Deposito dell'amiloide può essere visto più presto 1 giorno dopo l'iniezione. - Sacrificare il pesce utilizzando il metodo appropriato a seconda delle norme etiche (per esempio, trattare il pesce con 0,1 M MESAB).
- Taglio aperto il cranio sopra il tectum ottica mediante pinza punta sul lato dorsale e sezionare la testa appena dietro la pinna pettorale usando un bisturi.
- Difficoltà le teste utilizzando 2% paraformaldeide (PFA) durante la notte a 4 ° C. uso 3 mL di PFA a testa in un tubo di plastica con coperchio a vite.
Attenzione: Indossare l'attrezzatura di protezione idonea per maneggiare PFA. - Per crioprotezione e decalcificazione, lavare le teste tre volte in 0.1M tampone fosfato (pH 7,4), quindi trasferirli in sucrose/20% 20% soluzione di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare per una notte a 4 ° C.
- Per incorporare il tessuto di resina, di sezionamento congelare le teste in soluzione di saccarosio al 7,5% gelatin/20% in stampi di plastica istologia su ghiaccio secco (circa 3-5 min di congelare un blocco). Conservare i campioni a-80 ° C o continuare con il passaggio successivo (cryosectioning).
- Sezione le teste in 12 µm spessore cryosections utilizzando un criostato come descritto 28 , 42. Trasferire il cryosections direttamente su vetrini e conservare a-20 ° C per uso a lungo termine.
7. La colorazione immunoistochimica e microscopia
Nota: eseguire tutte le fasi di incubazione in una camera umidificata. E, tutti i passaggi del lavaggio sono per 10 min ogni.
- Asciugare le sezioni per 30 min a temperatura ambiente. Dopo lo scongelamento, lavare le sezioni due volte in PBS e una volta in PBSTx (PBS con 0,03% Triton X-100).
- Incubate con l'anticorpo primario (anticorpo anti-Aβ42; diluizione 1: 500 in PBSTx) a 4 ° C durante la notte. a seguito di giorno, lavare una volta in PBS e due volte in PBSTx.
- Incubare le sezioni con l'anticorpo secondario (rilevazione di fluorescenza-accoppiato, diluizione 1: 500) insieme con DAPI (1 μg/mL) in PBSTx per 2 h a temperatura ambiente.
- Lavare tre volte in PBSTx. Dopo il lavaggio finale, montare i vetrini con un vetrino coprioggetto utilizzando 100 μL 70% glicerolo.
- Acquisire immagini fluorescenti utilizzando un microscopio confocale (ad esempio con obiettivo 20 X PL APO N.A. 0,7 con 488 gamma di eccitazione e un filtro verde standard; Figura 2) 39.
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Representative Results
HPLC è stato utilizzato per purificare il peptide sintetizzato e spettrometria di massa è stata utilizzata per caratterizzare i peptidi purificati β amiloide. La colonna HPLC è stata riscaldata a 50 ° C per migliorare la separazione dei peptidi Aβ e tutte le frazioni sono stati raccolti. Per identificare il peptide sintetizzato correttamente, analisi di spettroscopia di massa è stata effettuata per tutte le frazioni. Il cromatogramma UPLC Mostra la purezza del composto. La frazione HPLC che ha reso un picco su UPLC (cioè, la massa corretta per caricare il rapporto del peptide β amiloide richiesto) è stato ulteriormente elaborata per esperimenti (Figura 2).
La funzionalità dei peptidi nel formare aggregati possa essere valutata utilizzando vari metodi spettroscopici39,48,49, e anche incubando i peptidi in PBS a temperatura ambiente per più di 1 h, che verrà resa di aggregati. In questo caso, dovrebbero essere visto precipitati e grandi aggregati in soluzione.
Dopo microiniezione intracerebroventricolare, i peptidi aggregano nel cervello e forma dell'amiloide deposizioni (Figura 3). Questi aggregati sono per lo più visto come deposizioni intracellulare, ma anche intorno ai vasi sanguigni. Tali aggregazioni sono indicazioni di un'accumulazione del successo dei peptidi amiloidi nel tessuto.
Figura 1: rappresentazione schematica della sintesi del peptide, la purificazione, iniezione e analisi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: caratterizzazione del peptide amiloide nativo-β42. Caratterizzazione di spettrometria di massa del peptide amiloide nativo-β42 (A) e il peptide amiloide-β42 CPP-etichetta (TR-Aβ42; B). (C) il cromatografo di purificato, nativo e TR-Aβ42 peptide su ultra-alta pressione liquido cromatografia (UPLC). X-axes denotare il rapporto massa / carica (m/z) (A, B) e il tempo di eluizione in minuti (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: la macchiatura di Immunohistochemical del deposito dell'amiloide in una sezione del cervello di zebrafish adulto 1 giorno dopo l'iniezione. Aβ42 è in verde, e i nuclei sono in blu. Rilevamento dei cluster verde indica l'aggregazione di Aβ42 efficiente. Scala bar = 100 µm. Questa figura è stata modificata da riferimento39.
| Peptide | Sequenza del peptide | MW (g/mol) | |||
| AΒ42 | DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA | 4514.1 | |||
| TR-AΒ42 | GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA | 5919.8 | |||
Tabella 1: Aβ42 e TR-Aβ42 sequenze peptidiche.
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Discussion
I peptidi dell'amiloide possono essere modificati per includere le variazioni di sequenza o vari tag. Per esempio, può essere generato un peptide amiloide uova strapazzato, e i peptidi possono essere etichettati con tag fluorescente al N-terminale dell'estremità del peptide o etichettati come vettore peptidi39. Allo stesso modo, in questo protocollo, il peptide vettore è il cellula-penetrante peptide TR a causa della sua efficacia a carico di trasporto profondo nel tessuto di cervello39. Inoltre, il nostro metodo permette per iniezione e analisi di vari peptidi che possono causare tossico aggregazioni50,51. Di conseguenza, il nostro sistema offre un metodo versatile per iniezione manuale di proteine tossiche nel cervello di zebrafish e analizzando gli effetti cellulari di tale tossicità.
Peptidi amiloidi aggregazione rapidamente e quindi, le scorte devono essere tenute nella soluzione acqua-DMF-acetonitrile e devono essere miscelate con PBS solo 0,5 h prima dell'iniezione. Se non ci sono grandi aggregati nella soluzione, la soluzione di iniezione deve essere preparata solo 10 min prima dell'iniezione. Efficienza di iniezione è un parametro importante per producendo risultati coerenti. Fare riferimento alla nostra precedente JoVE carta46 per l'esecuzione di un'iniezione di buono e coerente. Se nessuna aggregazione è visto dopo l'iniezione, il metodo di iniezione deve essere ottimizzato.
Il nostro metodo è limitato in termini di dimensioni delle molecole per essere iniettato. Precedentemente abbiamo indicato che i plasmidi o oligomeri brevi possono essere preso in modo efficiente dalla cellule ventricolari45,46, tuttavia, per la distribuzione efficiente in tessuti cerebrali profonde, grandi molecole (ad es., anticorpi, grandi proteine) non possono essere utilizzati. Inoltre, molecole lipofile non possono facilmente penetrare nei tessuti profondi perché tali molecole verranno essere sequestrate dai primi pochi strati di cellule ventricolari.
La generazione di modelli murini di neurodegenerazione è che richiede tempo e la manutenzione di questi modelli è abbastanza costosa. Il nostro metodo di iniezione è un modello rapido per il deposito dell'amiloide tossico e la neurodegenerazione. Inoltre, il pesce zebra ha una capacità rigenerativa superiore rispetto ai modelli dei mammiferi e le indagini concentrandosi sui cervelli come vertebrati potrebbero montare una risposta di rigenerazione dopo neurodegenerazione certamente trarranno beneficio da sistemi di dosaggio rapido in zebrafish.
La qualità della sua purezza e il peptide sintetizzato sono importanti per il successo dell'esperimento. Per garantire questa qualità, peptidi sintetizzati devono essere accuratamente caratterizzate mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa. Inoltre, studi di aggregazione e dicroismo circolari come descritto39 sono suggeriti.
Iniezione nel cervello pesce è un passo fondamentale per garantire un coerenza aggregazione e risultato patologico. Uno studio longitudinale che analizza le dinamiche di aggregazione e la clearance dei peptidi dell'amiloide può essere eseguito, se lo si desidera. Usiamo un peptide amiloide accoppiato ad un peptide vettore per garantire uguale distribuzione e penetrazione nel tessuto cerebrale. Peptidi amiloidi disgiunti anche dare risultati simili, ma la sequenza temporale della distribuzione e dell'aggregazione è diverso39. Lo sperimentatore può scegliere la versione desiderata di peptidi amiloidi a seconda l'obiettivo.
C'è un grande potenziale per l'utilizzo del nostro metodo in combinazione con altri studi di manipolazione. CVMI dei peptidi amiloidi possono essere combinati con trattamenti farmacologici o iniezione di altri composti per testare gli effetti sinergici di varie molecole in una condizione di malattia. In definitiva, il nostro modello di romanzo e rapido utilizzabile anche per approcci di screening di farmaci su piccola scala in un ambiente di laboratorio facile.
Il nostro metodo di microiniezione manuale può essere utilizzato in modo efficiente per iniettare peptidi amiloidi nel cervello adulto zebrafish per imitare il deposito dell'amiloide. Depositi dell'amiloide nel cervello di suscitare effetto citotossico e risultati in patologia di annuncio, quindi visualizzati da una condizione acuta neurodegenerative. Le prospettive future per questo metodo sarebbe quella di utilizzarlo in un modello degenerante acuto per studiare il neuropathology nel cervello di zebrafish e la risposta rigenerativa della stessa. Tale comprensione fornirà un'importante piattaforma per la progettazione di nuove strategie terapeutiche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da DZNE e l'Associazione Helmholtz (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) e DFG (KI1524/6) (C.K.); e dall'associazione di Leibniz (SAW-2011-IPF-2) e BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Vorremmo anche ringraziare Ulrike Hofmann per sintesi peptidica e Nandini Asokan, Prayag Murawala e Elly Tanaka per aiuto durante le riprese la procedura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fmoc-protected amino acids | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS) | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1030 | Activator |
| Oxyma | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1180 | Racemization supressor |
| N,N-Diisopropylethylamine | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-003 | Base |
| Dimethylformamide | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-004 | Solvent |
| N-Methylmorpholine | Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany | A12158 | Base |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) | 157260 ALDRICH | Activator |
| Piperidine | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 822299 | Fmoc deprotection reagent |
| Dichlormethane (DCM) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 106050 | Solvent |
| Formic acid (FA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 100264 | Buffer component for HPLC |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 808260 | Clevage Mixture reagent |
| Triisopropylsilane(TIS) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 233781 ALDRICH | Clevage Mixture reagent |
| Acetonitrile (for UPLC/LCMS) | Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH | 34967-1L | Solvent |
| Acetonitrile (for HPLC) | VWR International Ltd, England | 83639.320 | Solvent |
| Diethylether | VWR International Ltd, England | 23811.326 | Solvent for peptide precipitation |
| Dithiotritol (DTT) | VWR International Ltd, England | 0281-25G | Clevage Mixture reagent |
| TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin | Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) | S30023 | Solid phase for SPPS |
| Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters | Intavis AG (Cologne, Germany) | 34.274 | Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 11806-50-N | Filteration of precipitated peptides |
| Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter | Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe | KC78.1 | Pre-filteration for HPLC |
| Peptide Synthesizer | Intavis, Cologne, Germany | ResPep SL | Automated solid-phase peptide synthesizer |
| Water Alliance HPLC | Waters, Milford Massachusetts, USA | Waters 2998, Waters e2695 | Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC) |
| PolymerX, bead size 10μm, 250x10 mm | Phenomenex Ltd. Germany | 00G-4328-N0 | Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column |
| Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA | LCPAK0001 | Water purification system |
| Filtration Unit | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 16307 | Filtration unit for peptide precipitation |
| UPLC Aquity with UV Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | M09UPA 664M | Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS |
| ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50x2.1 mm | Waters, Milford Massachusetts, USA | 186002350 | Analytical C18 column |
| ACQUITY TQ Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | QBB908 | Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) |
| CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 | Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany | 16706, 101542 | Lyophilizer with vaccum pump |
| Paradigm plate reader | Beckman Coulter | ||
| MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 821.472 | |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | |
| Needle | Becton-Dickinson | 305178 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | |
| Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | |
| Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | |
| Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | |
| PicoNozzle | World Precision Instruments | 5430-12 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | |
| Cryostat | Leica | CM1950 |
References
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