Summary
Det här protokollet beskriver den syntes, karakterisering och injektion av monomer amyloid-β42 peptider för att generera amyloid toxicitet i vuxen zebrafiskar att upprätta en Alzheimers sjukdom modell, följt av histologiska analyser och upptäckt av aggregeringar.
Abstract
Alzheimers sjukdom (AD) är en handikappande neurodegenerativ sjukdom i vilken ansamling av giftiga amyloid-β42 (Aβ42) peptider leder till synaptic degeneration, inflammation, neuronala dödsfall, och lärande underskott. Människor kan inte återskapa förlorade nervceller i fallet AD delvis på grund av nedsatt proliferativ kapacitet av neurala stamceller/stamceller (NSPCs) och minskad neurogenes. Därför effektiv regenerativ terapier bör också förbättra spridningen och neurogen kapacitet NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) är en regenerativ organism och vi kan lära dig de grundläggande molekylära program som vi kan utforma terapeutiska metoder att tackla AD. Därför var det nödvändigt att generationen av en AD-liknande modell i zebrafiskar. Med vår metod, kan vi införa syntetiska derivat av Aβ42 peptid med vävnad genomträngande anlagen in i vuxen zebrafiskar hjärnan och analysera sjukdom patologi och regenerativ svar. Fördelen över befintliga metoder eller djurmodeller är däri Sebrafisken kan lära oss hur en ryggradsdjurens hjärna kan naturligt regenerera, och därmed hjälpa oss att behandla mänskliga neurodegenerativa sjukdomar bättre genom att rikta endogena NSPCs. Den amyloid-toxicity modellen etablerad i vuxen zebrafiskar hjärnan kan därför öppna nya vägar för forskning inom neurovetenskap och klinisk medicin. Dessutom kan det enkelt utförandet av denna metod för kostnadseffektivt och experimentell utvärdering. Detta manuskript beskriver syntes och injektion av Aβ42 peptider i zebrafiskar hjärnan.
Introduction
AD är en kronisk progressiv sjukdom som kännetecknas av förlust av nervceller och synapser i hjärnbarken1,2,3,4,5. Klassiskt neuropatologiska kännetecken för AD är nedfallet av amyloida peptider och bildandet av de neurofibrillära tangles (NTFS)6. Senila plack, även känd som amyloida plack, består av β-amyloid (Aβ) peptider som bildar β-veckad strukturer i hjärnparenkymet5. Ansamling av Aβ42 i AD patienter har en början och kritisk roll i sjukdomsprogression. AD utlöser en kaskad av händelser som leder till synaptic dysfunktion, nedsatt plasticitet och neuronala förlust7,8,9,10.
Den vuxna hjärnan av lever zebrafiskar fungerar som en utmärkt modell att studera regleringen av stamceller plasticitet11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 och olika sjukdomar i det centrala nervsystemet (CNS), inklusive AD21,22,23 ,24. På grund av en stor mängd tillgängliga experimentella metoder19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, dessa studier är informativ och genomförbart. Zebrafiskar kan fylla på CNS13,15,32,33,34,35,36,37, 38, delvis med hjälp av molekylär program aktiveras efter neuronala förlust19,39,40,41,42,43, 44. Därför kan om en neurodegenerativ sjukdom modell i zebrafiskar hjälpa adress roman frågor om regenerativ förmåga och stamcell biologi i ryggradsdjur hjärnor.
Nyligen har utvecklat vi en amyloid toxicitet modell i vuxen zebrafiskar hjärnan genom att injicera syntetiska Aβ42 peptider (tabell 1)39. Denna injektion orsakade neurodegeneration fenotyper som påminner om hjärnans patologi (t.ex., celldöd, mikrogliala aktiveringen, synaptic degeneration och minne underskott), vilket indikerar att zebrafiskar kan användas för att framkalla neurodegeneration i zebrafiskar hjärna, Aβ42 peptider kan upptäckas med immunhistokemiska färgningar och molekylära mekanismer av förnyelse i vuxen zebrafiskar CNS kan vara identifierade39. I detta protokoll visar vi en injektion av syntetiska amyloida peptider i zebrafiskar hjärnan med hjälp av en cerebroventricular injektion (CVMI) metod27,39,45,46 att efterlikna amyloid nedfall (figur 1). CVMI ger ett nytt sätt att leverera de peptider, som samlade vid injektion som β-ark strukturer och utöva toxicitet. Peptiderna fördelas jämnt i hela hjärnan, inriktning ventrikulära området längs den hela rostro-kaudala axis45. Dessutom tillåter denna metod för att analysera NSPCs i vuxen zebrafiskar hjärnan efter amyloid inneslutningar morfologiska och molekylära svar. Sådana studier kommer att ge oss en inblick för framgångsrika hjärnan reparation hos däggdjur. Vår metod kan användas för att förstå den nödvändiga molekylära mekanismen av en lyckad förnyelse svar efter AD-liknande symtom att inducera påfyllning av förlorade nervceller och funktionell återhämtning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
detta protokoll är ett standardförfarande som föreslagits av de EU-riktlinjerna (2010/63) och European Society for fisk modeller i biologi och medicin (EuFishBioMed) i Karlsruhe Insitute av teknik (KIT). Alla metoder beskrivs efter här har godkänts av etik kommissionen (Landesdirektion Dresden, dokumentnummer TVV-52/2015).
1. förberedelse av Aβ42 peptid
- Synthesize peptider (se tabell 1) med standard 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) kemi med 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) som koppling reagens på en automatiserad fasta fasen peptid synthesizer 52. Omfattningen av syntesen var 100 µmol.
- Laddas den automatisera peptid synthesizer med 500 mg av Fmoc-skyddade kådan som den fasta fasen (lastningskapacitet 0,2 mmol/g). Ladda de upplösta Fmoc-skyddade aminosyrorna vid en koncentration av 0,5 M i den volym som krävs och som beräknades för respektive syntet.
Anmärkning: Beräkningarna är gjorda för att aktivera kopplingen av varje Fmoc-skyddade aminosyra två gånger med 5 gånger överskott av varje byggsten till harts 47. - Lös krävs reagenser för peptid syntes i dimethlyformamide (DMF). Till exempel förbereda aktivator, HBTU, med en koncentration på 0,48 M, 45% v/v N-Methylmorpholine (NMM) (basen) och 5% v/v ättiksyraanhydrid (tak blandningen) till cap de icke-reagerade aminogrupper.
- Klyva alla peptiderna från kådan genom att kontinuerligt blanda fast stöd använder en agitator i en nylagad klyvning blandning bestående av trifluorättiksyra (TFA): Triisopropylsilane(TIS): vatten: Ditiotreitol (DTT) 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2.5 (m/v), för 4 h. använda 10 mL för syntes omfattning 100 µmol.
- Fällningen klyvs produkten genom att lägga till klyvning blandningen 100 mL iskallt dietyleter. Passera genom en filtrering enhet som innehåller ett av polytetrafluoreten (PTFE) filter med porstorlek 0,45 µm och tvätta med 20 mL iskallt dietyleter.
- Samla den filtrerade peptiden från pappersfiltret och Lös 100 mg av utfällda peptid i 5 mL destillerat avjoniserat vatten: acetonitril 1:1.
- Rena via omvänd-fas högtrycks vätskekromatografi (HPLC) på en semi preparativ HPLC utrustad med en porös polystyren divinylbensen kolumn pärla storlek 10 µm.
- Pre-Värm kolonnen och underhåll vid 50 ° C med en kolumn som uppvärmning enhet. Samla alla stora fraktioner med en automatiserad bråkdel samlare genom att tillämpa en gradient från 5% till 100% lösningsmedel B över 25 min på 4 mL/min.
Obs: Lösningsmedel A är 0,1% transfettsyror i vatten och lösningsmedel B är 0,1% transfettsyror i acetonitril 52. - Övervaka kromatogrammet 220 nm, samla in lämplig topparna och analysera med hjälp av LC-MS.
- Pre-Värm kolonnen och underhåll vid 50 ° C med en kolumn som uppvärmning enhet. Samla alla stora fraktioner med en automatiserad bråkdel samlare genom att tillämpa en gradient från 5% till 100% lösningsmedel B över 25 min på 4 mL/min.
- Bekräfta renheten av analytiska omvänd fas ultrahöga tryck flytande kromatografi (UPLC) 220 nm genom övervakning med en UV-detektor stundbortgång provet genom en C18 Analyskolonn (pärla storlek 1,7 µm). Bekräfta den peptid produkten genom masspektrometri.
Obs: UPLC är kopplat till en elektrospray masspektrometri med jonisering (ESI-MS) och Tandem Quadrupole detektor. - Lyophilize de rätta fraktionerna av önskad peptiden i en rund botten kolv, genom att tillämpa vakuum 0,052 mbar, till ett fluffigt pulver. Par vakuumpumpen till en frysning enhet temperatur på-78 ° C. förvaras vid-80 ° C, på obestämd tid.
- Använda den frystorkade peptiden för att förbereda en stamlösning 1 mm i en blandning av acetonitril: DMF: analyskvalitet vatten 1:1:1 för experiment. Denna lösning kan förvaras i minst 6 månader, som peptiderna inte samlade i denna lösning.
2. Förberedelse av injektionen blandningen
- förbereda fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) för att späda ut de frystorkade peptiderna.
- Lös peptiden till en slutlig koncentration av 20 µM i PBS. Förbereda denna lösning färska. Blanda väl och förvara på is tills injektionen. Inte överstiger 30 min för att förhindra aggregering i lösning.
3. Anestesi
- Förbered stamlösning av anestetika, 0,1% etyl-m-aminobensoat methanesulphonate (MESAB), i vanlig fiskevatten från de cirkulerande system. Bereda anaesthetization lösning till en slutlig koncentration av 0,0025% (v/v).
- Ta bort önskat antal fisk från sina tankar i en transportbehållare med 5 L system vatten.
- Halv-fylla en plast petriskål (90 mm) med 40 mL anestetika. Använda denna maträtt för injektioner.
- Inkubera fisken i bedövningsmedel tills den opercular rörelsen upphört.
4. Cerebroventricular Mikroskop
- förberedelse av injektionen apparater
- Förbered glaset injektion kapillärer med hjälp av nålen avdragare med följande parametrar: uppvärmning cykel, 537; dra cykeln, 250; hastighet, 1.5 s; gången, 80 ms.
- föra inställningen trycket på trycket källa till 25 psi.
- Ange parametrarna microinjector följande: Håll tryck 20 psi; mata ut trycket 10 psi; periodvärdet 2,5; Usenets värdet 100 ms.
- Ladda glas kapillären med injektionslösningen. Sätt glas kapillären i Mikroskop hållaren. Justera vinkel injektion till 45°.
Obs: Mer detaljerade protokoll kan hittas som beskrivs i referenser 27 , 46.
- Plats en fisk i en ny petriskål fylld med anaesthetization lösning (som i steg 3.3).
- Håll fisken med pincett och orient injektionsvätska.
- Generera en skåra med en 30 G nålspetsen i skallen över den fiberoptiska tectum där de två laterala plattorna möts. Sätt inte in spetsen i hjärnvävnaden, detta skulle leda till blödningar och skador. Se referenser 27 , 45 , 46 för ytterligare detaljer.
- In skåran glas kapillären.
- Använd endast spetsen av nålen och tränga inte mer än 1 mm genom skallen. Fortsätt att hålla fisken och för in glaset kapillär genom snittet webbplatsen.
- Orient spetsen på glaset kapillär mot telencephalon i 45° vinkel. Injicera 1 µL av lösningen. Vätskan skingrar omedelbart efter injektion.
5. Återställning
- plats fisken tillbaka till en transportbehållare tills det återvinner. Anslut behållaren till regelbundet cirkulerande fiskevatten för att säkerställa optimal vattenkvalitet.
Obs: Återhämtningen bör normalt ta 1 min. Om det tar längre tid, fisken måste hållas i bedövningsmedel under kortare tid (detta behöver optimeras genom att försöksledaren).
6. Vävnad förberedelse och Sectioning
- vänta för en önskad tidsperiod innan att offra fisken.
Obs: Detta beror på den experimentella frågan. Amyloid nedfall kan ses så tidigt som 1 dag efter injektion. - Offra fisken med hjälp av lämplig metod beroende på de etiska reglerna (t.ex., behandla fisken med 0,1 M MESAB).
- Uppskuren skallbasen ovan den fiberoptiska tectum med spetsiga forcep på ryggsidan och dissekera huvudet precis bakom bröstmuskeln fenan använda skalpell.
- Fixa cheferna använder 2% PARAFORMALDEHYD (PFA) över natten vid 4 ° C. användning 3 mL av PFA per capita i ett plaströr med skruv lock.
FÖRSIKTIGHET: Använd lämplig personlig skyddsutrustning vid hantering av PFA. - För cryoprotection och urkalkning, tvätta huvudet tre gånger i 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4), sedan överföra dem till 20% sucrose/20% etylendiamintetraättiksyra (EDTA) lösning och inkubera över natten vid 4 ° C.
- Att bädda in vävnaden i snittning harts, frysa huvuden i 7,5% gelatin/20% sackaroslösning i plast histologi formar på torris (cirka 3-5 min att frysa ett block). Lagra proverna vid-80 ° C eller fortsätta till nästa steg (kryosnitt).
- Avsnitt huvuden till 12 µm tjock kryosnitt med en kryostat som beskrivs 28 , 42. Överföra kryosnitt direkt på objektglas och förvaras vid-20 ° C för långsiktig användning.
7. Immunhistokemisk färgning och mikroskopi
Obs: utföra alla inkubationsstegen i en fuktig kammare. Och alla tvätt steg är för 10 min varje.
- Torka avsnitten för 30 min i rumstemperatur. Efter upptining, tvätta delar två gånger i PBS och en gång i PBSTx (PBS med 0,03% Triton-X-100).
- Inkubera med den primär antikroppen (anti-Aβ42 antikropp; 1: 500 utspädning i PBSTx) på 4 ° C över natten. påföljande dag, tvätta en gång i PBS och två gånger i PBSTx.
- Inkubera avsnitten med sekundära antikroppen (fluorescens-kopplade upptäckt, 1: 500 utspädning) tillsammans med DAPI (1 μg/mL) i PBSTx för 2 h i rumstemperatur.
- Tvätta tre gånger i PBSTx. Efter den sista tvätten, montera bilderna med ett täckglas som använder 100 μL 70% glycerol.
- Förvärva fluorescerande bilder med confocal Mikroskop (till exempel med 20 X PL APO N.A. 0,7 mål med 488 excitation utbud och standard gröna filter; figur 2) 39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HPLC användes att rena den syntetiserade peptiden och masspektrometri har använts för att karakterisera de rena amyloid β-peptiderna. I HPLC-kolonnen var uppvärmt till 50 ° C att förbättra avskiljningen av Aβ peptiderna och alla fraktioner samlades. För att identifiera korrekt syntetiserade peptiden, utfördes massa spektroskopi analys för alla fraktioner. UPLC kromatogrammet visar renheten av föreningen. Den HPLC-fraktionen som gett en topp på UPLC (dvs, den rätta massan att debitera förhållandet mellan krävs amyloid β peptiden) vidareförädlades för experiment (figur 2).
Funktionaliteten i peptiderna i bildar aggregat kan bedömas med hjälp av olika spektroskopiska metoder39,48,49, och också av ruvning peptiderna i PBS vid rumstemperatur för mer än 1 h, som kommer att avkastning aggregat. I det här fallet bör fällningar och stora aggregat ses i lösning.
Efter cerebroventricular Mikroskop aggregera peptiderna i de hjärnan och bilda amyloid nedfall (figur 3). Dessa aggregat är oftast ses som intracellulära nedfall, men också kring blodkärlen. Sådan aggregeringar finns indikationer på en framgångsrik ansamling av amyloid peptider i vävnaden.
Figur 1: Schematisk bild av den peptidsyntesen, rening, injektion och analyser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: karakterisering av infödda amyloid-β42 peptid. Masspektrometri karakterisering av infödda amyloid-β42 peptid (A) och CPP-taggade amyloid-β42 peptiden (TR-Aβ42; B). (C), kolonnen av renat, infödda, och TR-Aβ42 peptid på den Ultra-high trycket flytande kromatografi (UPLC). X-Axes betecknar förhållandet massa-till-avgift (m/z) (A, B) och eluering tiden i minuter (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: immunhistokemisk färgning av amyloid nedfall i en vuxen zebrafiskar hjärnan avsnitt 1 dag efter injektion. Aβ42 är i grönt och kärnorna är i blått. Påvisande av gröna kluster anger effektiv Aβ42 aggregation. Skala barer = 100 µm. Denna siffra har ändrats från referens39.
| Peptid | Peptid sekvens | MW (g/mol) | |||
| AΒ42 | DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA | 4514.1 | |||
| TR-AΒ42 | GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA | 5919.8 | |||
Tabell 1: Aβ42 och TR-Aβ42 peptid sekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De amyloida peptiderna kan modifieras för att inkludera sekvens variationer eller olika taggar. Exempelvis en äggröra amyloid peptid kan genereras och peptiderna kan vara märkta med fluorescerande Taggar vid N-terminalen av peptid slutet eller märkta med transportören peptider39. Likaså, i detta protokoll, transportören peptiden är cell-penetrerande peptiden TR på grund av dess effektivitet att transportera gods djupt in i hjärnans vävnad39. Dessutom ger vår metod för injektion och analyser av olika peptider som kan orsaka toxiska aggregeringar50,51. Därför erbjuder vårt system en mångsidig metod för manuell injektion av giftiga proteiner i zebrafiskar hjärnan och analysera de cellulära effekterna av sådan toxicitet.
Amyloida peptider sammanlagda snabbt, därför bestånden måste hållas i vatten-DMF-acetonitril lösningen och ska blandas med PBS bara 0,5 h före injektion. Om det finns stora aggregat i lösningen, bör injektionslösningen förberedas bara 10 min före injektion. Injektion effektivitet är en viktig parameter för framställning av konsekventa resultat. Se våra tidigare JoVE papper46 för att utföra en bra och konsekvent injektion. Om ingen aggregering ses efter injektion, måste metoden injektion optimeras.
Vår metod är begränsad när det gäller storleken på molekylerna som skall injiceras. Vi har tidigare visat att den plasmider eller kort oligomerer kan tas upp effektivt av den ventrikulära celler45,46, dock för effektiv leverans till djupa hjärnan vävnaderna, stora molekyler (t.ex., det antikroppar, stora proteiner) kan inte användas. Dessutom fettlösliga molekyler kan inte lätt tränga in djupa vävnaderna eftersom molekylerna kommer vara binds av de första några lagrarna av ventrikulära celler.
Generering av musmodeller av neurodegeneration är tidskrävande och underhåll av dessa modeller är ganska dyrt. Våra injektion metod är en snabb modell för giftiga amyloid nedfall och neurodegeneration. Dessutom zebrafisk har en överlägsen regenerativ förmåga jämfört med däggdjur modeller och utredningar med fokus på hur ryggradsdjurens hjärna kunde montera en regenerering svar efter neurodegeneration kommer säkert dra nytta av snabba test system i Zebrafiskar.
Kvaliteten i syntetiskt peptiden och dess renhet är viktiga för framgången av experimentet. För att garantera denna kvalitet, måste syntetiserade peptider grundligt karakteriseras med hjälp av vätskekromatografi och massa spektroskopi. Dessutom föreslås cirkulär dichroism och aggregering studier som beskrev39 .
Injektion i hjärnans fisk är ett viktigt steg att säkerställa en konsekvent aggregering och patologiska resultatet. En longitudinell studie som analyserar aggregering och clearance dynamiken i de amyloida peptiderna kan utföras, om så önskas. Vi använder en amyloid peptid som kopplas till en transportör peptid för att säkerställa jämn fördelning och penetration i hjärnvävnaden. Okopplade amyloida peptider också ge liknande resultat men tidslinjen för distribution och aggregering är olika39. Försöksledaren kan välja den önskade versionen av amyloida peptider beroende på syftet.
Det finns stor potential för användning av vår metod i kombination med andra manipulation studier. CVMI av amyloida peptider kan kombineras med läkemedelsbehandling eller injektion av andra föreningar att testa de synergistiska effekterna av olika molekyler i ett sjukdomstillstånd. Slutligen, vår snabba och romanen modell användas för småskaliga drogkontroll metoder i en lätt laboratoriemiljö.
Vår manuella Mikroskop metod kan effektivt användas för att injicera amyloida peptider i vuxen zebrafiskar hjärnan att efterlikna amyloid nedfall. Amyloid nedfall i hjärnan framkalla cytotoxisk effekt och resultat i AD patologi, därmed visar en akut neurodegenerativa tillstånd. De framtida utsikterna för denna metod skulle vara att utnyttja det i ett akut degenerativa modell att studera neuropatologi i zebrafiskar hjärna och regenerativ svaret därav. Sådan förståelse kommer att ge en viktig plattform för att designa nya terapeutiska strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete fick stöd av DZNE och Helmholtz Association (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518), och DFG (KI1524/6) (C.K.); och av Leibniz Association (SAW-2011-IPF-2) och BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Vi vill också tacka Ulrike Hofmann för peptidsyntesen och Nandini Asokan, Prayag Murawala och Elly Tanaka för hjälp under filmning förfarandet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fmoc-protected amino acids | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS) | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1030 | Activator |
| Oxyma | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | RL-1180 | Racemization supressor |
| N,N-Diisopropylethylamine | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-003 | Base |
| Dimethylformamide | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) | SOL-004 | Solvent |
| N-Methylmorpholine | Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany | A12158 | Base |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) | Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) | 157260 ALDRICH | Activator |
| Piperidine | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 822299 | Fmoc deprotection reagent |
| Dichlormethane (DCM) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 106050 | Solvent |
| Formic acid (FA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 100264 | Buffer component for HPLC |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 808260 | Clevage Mixture reagent |
| Triisopropylsilane(TIS) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) | 233781 ALDRICH | Clevage Mixture reagent |
| Acetonitrile (for UPLC/LCMS) | Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH | 34967-1L | Solvent |
| Acetonitrile (for HPLC) | VWR International Ltd, England | 83639.320 | Solvent |
| Diethylether | VWR International Ltd, England | 23811.326 | Solvent for peptide precipitation |
| Dithiotritol (DTT) | VWR International Ltd, England | 0281-25G | Clevage Mixture reagent |
| TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin | Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) | S30023 | Solid phase for SPPS |
| Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters | Intavis AG (Cologne, Germany) | 34.274 | Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 11806-50-N | Filteration of precipitated peptides |
| Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter | Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe | KC78.1 | Pre-filteration for HPLC |
| Peptide Synthesizer | Intavis, Cologne, Germany | ResPep SL | Automated solid-phase peptide synthesizer |
| Water Alliance HPLC | Waters, Milford Massachusetts, USA | Waters 2998, Waters e2695 | Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC) |
| PolymerX, bead size 10μm, 250x10 mm | Phenomenex Ltd. Germany | 00G-4328-N0 | Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column |
| Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA | LCPAK0001 | Water purification system |
| Filtration Unit | Sartorius Stedtim (Aubagne, France) | 16307 | Filtration unit for peptide precipitation |
| UPLC Aquity with UV Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | M09UPA 664M | Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS |
| ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50x2.1 mm | Waters, Milford Massachusetts, USA | 186002350 | Analytical C18 column |
| ACQUITY TQ Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | QBB908 | Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) |
| CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 | Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany | 16706, 101542 | Lyophilizer with vaccum pump |
| Paradigm plate reader | Beckman Coulter | ||
| MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 821.472 | |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | |
| Needle | Becton-Dickinson | 305178 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | |
| Dumont Tweezers | World Precision Instruments | 501985 | |
| Gillies Dissecting Forceps | World Precision Instruments | 501265 | |
| Glass injection capillaries | World Precision Instruments | TWF10 | |
| PicoNozzle | World Precision Instruments | 5430-12 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Ring illuminator; Ring Light Guide | Parkland Scientific | ILL-RLG | |
| Cryostat | Leica | CM1950 |
References
- LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
- Serpell, L. C. Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
- Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer's disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
- Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
- Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer's disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
- McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
- Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer's disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
- Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
- Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
- Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer's disease? Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
- Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer's disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
- Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
- Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
- Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
- Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
- Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).
- Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
- Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
- Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
- Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
- Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
- Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
- Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
- Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Katz, S., et al. A Nuclear Role for miR-9 and Argonaute Proteins in Balancing Quiescent and Activated Neural Stem Cell States. Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
- Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073 (2015).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
- Sewald, N., Jakubke, H. Peptides: Chemistry and Biology. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. (2009).
- Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chemistry. 22 (25), 8685-8693 (2016).
- Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
- Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
- Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
- Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).
