Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Amiloid β42 toksisite ve ateş yetişkin Zebra balığı beyinde modelleme

Published: October 25, 2017 doi: 10.3791/56014
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3, 2, 1,3
1German Centre for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Dresden within Helmholtz Association, 2B CUBE, Center for Molecular Bioengineering, Technische Universität Dresden, 3Center for Regenerative Therapies Dresden (CRTD), TU Dresden

Summary

Bu iletişim kuralı sentezi, karakterizasyonu ve monomeric amiloid-β42 peptidler amiloid toksisite histolojik analizler ve tespiti takip bir Alzheimer hastalığı modeli kurmak için yetişkin Zebra balığı üretme için enjeksiyon açıklar toplamalardan.

Abstract

Alzheimer hastalığı (Ah) bir toksik amiloid-β42 hangi birikimi (Aβ42) peptidler açar sinaptik bozulma, iltihap, nöronal ölüm nörodejeneratif hastalık zayıflatıcı, açıkları öğrenme 's. İnsanlar reklam durumunda kayıp nöronlar kısmen sinir kök/progenitor hücreler (NSPCs) ve düşük neurogenesis Engelli proliferatif kapasitesi nedeniyle yeniden olamaz. Bu nedenle, verimli rejeneratif terapiler de yayılması geliştirmek gerekir ve Nörojenik NSPCs. Zebra balığı (Danio rerio) kapasitesini rejeneratif bir organizmadır ve temel moleküler programlar hangi ile biz tasarım olabilir öğrenebilirsiniz Reklam mücadele için tedavi yaklaşımları. Bu nedenle, Zebra balığı bir reklam gibi modelinde nesil gerekliydi. Bizim metodoloji kullanarak, biz Aβ42 peptid sentetik türevleri doku delici kabiliyetine sahip yetişkin Zebra balığı beynine tanıtmak ve hastalık patoloji ve rejeneratif yanıt analiz. Mevcut yöntemler veya hayvan modelleri üzerinde o Zebra balığı nasıl omurgalı bir beyin doğal olarak yeniden ve böylece insan nörodejeneratif hastalıklar daha iyi endojen NSPCs hedefleyerek tedavisi için bize yardımcı bize öğretebilir avantajdır. Bu nedenle, Yetişkin Zebra balığı beyinde kurulan amiloid-toksisite modeli Nörobilim ve klinik tıp alanında araştırma için yeni yollar açılabilir. Ayrıca, bu yöntem basit yürütülmesi için maliyet-etkin ve verimli deneysel değerlendirme sağlar. Bu el yazması sentezi ve Aβ42 peptidler kod Zebra balığı beyin içine ekleme açıklar.

Introduction

Reklam nöronlar kaybı ile karakterize kronik ilerleyici bir hastalıktır ve serebral korteks1,2,3,4,5' te synapses. Reklam klasik neuropathological işaretlerinden amiloid peptidler birikimi vardır ve neurofibrillary oluşumu (NFTs)6ipliği. Senil plaklar, olarak da bilinen amiloid plaklar, β-Pileli yapıları içinde beyin parankimi5formu amiloid-β (Aβ) peptidler oluşur. Aβ42 birikimi reklam hastalarda, hastalığın ilerlemesinde erken ve kritik bir rol vardır. Sinaptik fonksiyon bozukluğu, Engelli plastisite ve nöronal kayıp7,8,9,10önde gelen olaylar bir çağlayan reklam tetikler.

Teleost Zebra balığı yetişkin beyin düzenleme kök hücre plastisite11,12,13,14,15, , eğitim için mükemmel bir model hizmet veren 16,17,18,19,20 ve21,yılında22,23 de dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi (MSS), çeşitli hastalıklarda ,24. Kullanılabilir deneysel yöntemleri19,20,25,26,27,28,29, geniş bir dizi sayesinde 30 , 31, bu çalışmalar bilgilendirici ve uygulanabilir. Zebra balığı CNS13,15,32,33,34,35,36,37doldurmak, kısmen aktif nöron kaybı19,39,40,41,42,43sonra, moleküler programları kullanarak, 38, 44. Bu nedenle, nörodejeneratif hastalık modeli içinde Zebra balığı kurulması omurgalı beynindeki rejeneratif yeteneği ve kök hücre biyolojisi ile ilgili yeni soruları adresine yardımcı olabilir.

Son zamanlarda, sentetik Aβ42 peptidler (Tablo 1)39enjekte edilerek yetişkin Zebra balığı beyin amiloid toksisite modelinde geliştirdik. Bu enjeksiyon neden ateş fenotipleri (örneğin, hücre ölümü, mikroglial harekete geçirmek, sinaptik bozulma ve bellek açıkları), insan beyninin patolojinin anımsatan Bu Zebra balığı-ebilmek var olmak kullanılmış için alabilme gösteren ateş Zebra balığı beyinde peptidler immunohistokimyasal stainings ve rejenerasyon CNS olabilir yetişkin Zebra balığı olarak moleküler mekanizmaları ile tespit edilebilir Aβ4239tespit edilmiştir. Bu protokol için biz sentetik amiloid peptidler makarna bir cerebroventricular enjeksiyon (CVMI) yöntemi27,39,45,46 kullanarak Zebra balığı beyin içine enjeksiyon göstermek Amiloid birikimi (şekil 1) taklit etmek için. CVMI enjeksiyon olarak β-sayfa yapıları üzerine toplamak ve toksisite sarfetmek peptidler, teslim yeni bir yol sağlar. Peptidler45tüm rostro Kaudal eksen boyunca ventrikül alan hedefleme beyin boyunca eşit olarak dağıtılır. Ayrıca, bu yöntem amiloid kapanımlar takip yetişkin Zebra balığı beyinde NSPCs morfolojik ve moleküler yanıt analiz için sağlar. Bu tür çalışmalar bize memelilerde başarılı beyin tamir için bir fikir verecek. Bizim yöntem başarılı rejenerasyon yanıt gerekli moleküler mekanizması kayıp neurons ve fonksiyonel iyileşme ikmal ikna etmek için reklam benzeri belirtiler sonra anlamak için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu iletişim kuralı EU kurallar tarafından önerilen bir standart bir uygulamadır (2010/63) ve Avrupa Toplum Biyoloji ve Tıp (EuFishBioMed) yılında Karlsruhe Enstitüsü, Teknoloji (KIT) Balık modelleri için. Sonra burada açıklanan tüm yöntemleri (Landesdirektion Dresden; belge numarası TVV-52/2015) etik Komisyonu tarafından onaylanmış olan.

1. hazırlık Aβ42 peptid

  1. Synthesize peptidler (bkz. Tablo 1) standart 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) Kimya 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-ile kullanma tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) kaplin reaktif tarihinde bir otomatik katı fazlı peptid synthesizer 52 olarak. Sentez ölçeğini 100 µmol yapıldı.
  2. 500 mg Fmoc korumalı reçine ile otomatik peptid synthesizer (yükleme kapasitesi 0,2 mmol/g) katı faz yükleyin. Çözünmüş Fmoc korumalı amino asit konsantrasyonu 0.5 M, yük hacimli gerekli ve ilgili synthesizer için hesaplanan olarak.
    Not: Her Fmoc korumalı amino asit kavraması her yapı taşı reçine 47 5 kere fazlalığı ile iki kez etkinleştirmek için hesaplamalar yapılır.
  3. Dimethlyformamide (DMF) peptid sentezi için gerekli reaktifler geçiyoruz. Örneğin, Sigara tepki amino grupları kap için belgili tanımlık harekete geçirmek, HBTU, bir konsantrasyon 0,48 m, % 45 v/v N-Methylmorpholine (NMM) (temel) ve % 5 v/v asetik anhidrit (kapatma karışımı) adlı hazırlayın.
  4. Trifluoroacetic asit (TFA) oluşan bir taze hazırlanmış bölünme karışımı bir karıştırıcı kullanarak sağlam destek sürekli karıştırılarak reçine tüm peptidler ayırmak: Triisopropylsilane(TIS): su: Dithiothreitol (DTT) 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2,5 (m/v), 4 h için kullanın 10 mL 100 µmol sentez ölçek için.
  5. 100 mL buz gibi Dietil eter için bölünme karışımı ekleyerek cleaved ürün çökelti. 0,45 µm gözenek büyüklüğü ile politetrafloroetilin (PTFE) filtre ve yıkama ile 20 mL buz gibi Dietil eter içeren bir filtrasyon ünitesi üzerinden geçmek.
  6. Filtre uygulanmış peptid filtre kağıdı toplamak ve erime 100 mg 5 ml zarlarını peptid deiyonize su distile: Asetonitril 1:1.
  7. Ters fazlı yüksek basınçlı sıvı Kromatografi (HPLC) üzerinde Boncuk boyutu 10 µm gözenekli polistiren divinylbenzene sütun ile donatılmış bir yarı partiye hazırlık HPLC ile arındırmak.
    1. Sütun ön ısı ve 50 ° C cihazı Isıtma bir sütun kullanarak korumak. Degrade % %5 100 solvent B 25 dk 4 mL/dak., uygulayarak bir otomatik kesir toplayıcı kullanarak büyük kesirleri toplamak
      Not: Solvent A % 0,1 olduğunu TFA su ve solvent B % 0,1 olduğunu TFA Asetonitril 52.
    2. 220, Kromatografik izlemek nm, uygun doruklarına toplamak ve LC-Bayan kullanarak analiz
  8. Onayla saflık tarafından analitik ters faz ultra yüksek basınç sıvı Kromatografi (UPLC) vasıl 220 nm UV bulmak ile örnek bir analitik C18 sütun (Boncuk boyutu 1.7 µm) üzerinden geçen süre izleme. Peptid ürün tarafından kütle spektrometresi onaylayın.
    Not: Bir electrospray iyonlaşma kütle spektrometresi (ESI-MS) ve Tandem Quadrupole Dedektör UPLC birleştiğinde.
  9. Bir yuvarlak alt şişesi içinde istenen peptid doğru kesirler için kabarık bir toz 0,052 mbar, bir vakum uygulayarak lyophilize. Vakum pompası süresiz olarak-78 ° C. Store-80 ° C'de tutulan bir dondurucu birimine çift.
  10. Kullanmak lyophilized peptid Asetonitril bir karışımı 1 mM stok çözeltisi hazırlamak için: DMF: analitik sınıf su 1:1:1 deneyler için. Peptidler Bu çözümde toplamak değil gibi bu eriyik-ebilmek var olmak stok en az 6 ay için.

2. Enjeksiyon karışım hazırlanması

  1. lyophilized peptidler seyreltmek için fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) hazırlayın.
  2. Peptid PBS 20 µM son bir konsantrasyon için geçiyoruz. Bu çözüm taze hazırlayın. İyice karıştırın ve buza enjeksiyon kadar saklayın. Çözüm toplamada önlemek için 30 dk fazla olamaz.

3. Anestezi

  1. hazırla anestezikler, düzenli balık suda dolaşan üzerinden % 0,1 etil-m-aminobenzoate methanesulphonate (MESAB), hisse senedi çözüm sistem. Anestezi çözüm %0.0025 (v/v) son bir konsantrasyon için hazır olun.
  2. Bir taşıma kaba 5 L sistem su ile onların tank balık için istediğiniz sayıyı kaldır.
  3. Yarı-dolgu plastik bir Petri kabına (90 mm) 40 mL anestezi ile. Bu yemek için iğne kullanın.
  4. Opercular hareketi sona erdi kadar anestezi balıkta kuluçkaya.

4. Cerebroventricular mikroenjeksiyon

  1. enjeksiyon aparatı hazırlanması
    1. hazırla cam enjeksiyon kılcal bir iğne çektirmenin aşağıdaki parametreleriyle kullanma: Isıtma döngüsü, 537; çekerek döngüsü, 250; hız, 1,5 s; zaman, 80 Bayan
    2. basınç ayarı için 25 psi basınç kaynağı getirmek.
    3. Microinjector parametreleri şu şekilde ayarlayın: tutun 20 psi basınç; basınç çıkarma 10 PSI; dönem değeri 2.5; gating değeri 100 Bayan
    4. Cam kılcal enjeksiyon çözüm yükleyin. Cam kılcal mikroenjeksiyon yuvasına takın. Enjeksiyon açısını 45 ° için ayarlamak.
      Not: Başvurular 27 , 46 de açıklandığı gibi daha ayrıntılı iletişim kuralları bulunabilir.
  2. Yer bir balık yeni bir petri içine dolu anestezi solüsyonu (aynı derecede içinde adım 3.3).
  3. Balık forseps ve orient enjeksiyon için tutun.
  4. Bir yarık 30 G iğne ucu kafatasında üzerinde optik tectum iki yanal tabak buluştuğu kullanarak oluşturun. İpucu beyin dokusu içine eklemek değil, bu kanama ve hasara neden olur. Bkz: 27 , 45 , 46 ek ayrıntılar için başvurur.
  5. Cam kılcal slit takın.
    1. Sadece iğne kullanmanızı ve kafatası ile daha--dan 1 mm nüfuz değil. Balık tutmaya ve cam kesi site üzerinden kapiller ucunu takın.
    2. Cam telencephalon 45 ° açıyla doğru kapiller ucu gelecek şekilde yönlendirin. Çözüm 1 µL enjekte. Sıvı Enjeksiyon sonra hemen çekilmesini.

5. Kurtarma

  1. balık geri taşıma kapsayıcıya o iyileşene kadar yer. Optimum su kalitesini artırmak amacıyla düzenli olarak dolaşımdaki balık su kapsayıcı bağlanın.
    Not: Kurtarma normalde 1 dk sürer. Daha uzun sürerse, Balık anestezikler için daha kısa bir defa (Bu deneyci tarafından optimize edilmiş olması gerekir) tutulmalıdır.

6. Doku hazırlık ve Sectioning

  1. balık ödün önce istenen bir süre için bekleyin.
    Not: Bu deneysel soruda bağlıdır. Amiloid birikimi 1 gün sonra enjeksiyon gibi erken görülebilir.
  2. Bağlı olarak etik kurallara uygun yöntemi kullanarak balık kurban (örneğin, 0.1 M MESAB balıkla tedavi).
  3. Sivri forcep dorsal tarafta kullanarak optik tectum Kurukafa ikiye ayıracağım ve kafa sadece arkasında bir neşter kullanarak göğüs fin teşrih.
  4. Tamir % 2 paraformaldehyde (PFA) kullanarak kafalarını gecede, İngiltere'de yılın 4 ° C. kullanım 3 mL plastik tüp içinde başına bir vidalı kapaklı.
    Uyarı: uygun kişisel koruyucu ekipman PFA işleme giyerler.
  5. İçin üç kez 0.1 M kafaları cryoprotection yıkayıp, kalsiyumun, fosfat tampon (pH 7,4), sonra onları % 20 sucrose/20% ethylenediaminetetraacetic (EDTA) çözüm aktarmak ve gecede 4'te kuluçkaya ° C.
    6. Doku reçine, kesit içine gömmek için
  6. plastik Histoloji kalıpları kuru buz (yaklaşık 3-5 bir blok dondurmak için min) % 7.5 gelatin/20% Sükroz çözümde kafaları dondurmak. -80 ° C'de örnekleri depolamak veya sonraki adıma (cryosectioning) devam.
  7. Bir cryostat açıklanan 28 , 42 kullanarak 12 µm kalınlığında cryosections içine başları bölüm. Cryosections cam slayta doğrudan aktarın ve uzun vadeli kullanım için-20 ° C'de depolayın.

7. İmmunohistokimyasal boyama ve mikroskopi

Not: oksijen odasında tüm kuluçka adımları gerçekleştirin. Ve tüm çamaşır 10 dk her adımlardır.

  1. Kuru oda sıcaklığında 30 dk için bölümler. Çözdürme sonra iki kez PBS ve bir kez PBSTx bölümleri yıkayın (PBS % 0.03 ile Triton-X-100).
  2. Incubate, 4 ° C gece. birincil antikoru (anti-Aβ42 antikor; PBSTx 1:500 seyreltme) ile gün yıkamak bir kez PBS ve iki kez PBSTx.
  3. İkincil antikor (floresan birleştiğinde algılama, 1:500 seyreltme) ile birlikte DAPI bölümlerle kuluçkaya (1 μg/mL) içinde oda sıcaklığında 2 h için PBSTx.
  4. Yıkama üç kez PBSTx. Son yıkandıktan sonra bir coverslip 100 μL % 70 gliserol kullanarak slaytları mount.
  5. Edinme floresan görüntüleri confocal mikroskop (örneğin 20 X PL APO N.A. 0,7 amacı ile 488 uyarma aralığı ve bir standart yeşil filtre; ile kullanma Şekil 2) 39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HPLC sentezlenmiş peptid arındırmak için kullanılan ve kütle spektrometresi arıtılmış amiloid β peptidler karakterize etmek için kullanılmıştır. HPLC sütun Aβ peptidler ayrılması geliştirmek için 50 ° C sıcak olduğu ve bütün fraksiyonları toplanmıştır. Doğru sentezlenmiş peptid tanımlamak için kütle spektroskopisi analiz tüm bölümler için gerçekleştirildi. UPLC Kromatografik bileşik saflığı gösterir. UPLC (Yani, gerekli amiloid Beta peptid oranında şarj etmek için doğru kitle) üzerinde bir tepe vermiştir HPLC kesir deneyler (Şekil 2) için daha fazla işlendi.

Toplamları oluşturan içinde peptidler işlevselliğini kullanarak çeşitli spektroskopik yöntemler39,48,49tespit edilebilir ve PBS içinde peptidler, oda sıcaklığında daha 1 h için kuluçka tarafından hangi-ecek da toplamları verim. Bu durumda, precipitates ve büyük toplamları çözümde görülmelidir.

Cerebroventricular mikroenjeksiyon sonra peptidler beyin ve form amiloid ifadeleri içinde (şekil 3) toplamak. Bu toplamları çoğunlukla hücre içi ifadeleri olarak, aynı zamanda kan damarlarının çevresinde görülür. Böyle toplamalardan doku amiloid peptidler başarılı bir birikimi göstergeleridir.

Figure 1
Şekil 1: peptid sentez, arıtma, enjeksiyon ve analizleri şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Yerel amiloid-β42 peptid karakterizasyonu. Kütle spektrometresi karakterizasyonu yerli amiloid-β42 peptid(a)ve CPP öğesini amiloid-β42 peptid (TR-Aβ42; B). (C), saf, Kromatograf yerli ve TR-Aβ42 peptid üzerinde Ultra-high basınç sıvı Kromatografi (UPLC). X-Axes kütle ücret oranı (m/z) (A, B) ve (C) dakikada elüsyon saat gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: 1 gün sonra enjeksiyon bir yetişkin Zebra balığı beyin bölümünde amiloid yükünün immunohistokimyasal boyama. Aβ42 yeşil, ve Mavi çekirdeği vardır. Yeşil kümeler tespiti verimli Aβ42 toplama gösterir. Ölçek çubukları 100 µm =. Bu rakam başvuru39değiştirildi.

Peptid Peptit dizisi MW (g/mol)
Aβ42 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA 4514.1
TR-Aβ42 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA 5919.8

Tablo 1: Aβ42 ve TR-Aβ42 peptid diziler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Amiloid peptidler sıra varyasyonları veya çeşitli Etiketler içerecek şekilde değiştirilmiş. Örneğin, şifreli amiloid peptid oluşturulabilir ve peptidler N-terminus peptid sonu itibariyle floresan etiketlerle etiketlenmiş ya da taşıyıcı peptidler39ile Etiketlenmiş. Benzer şekilde, bu protokol için taşıyıcı peptid hücre Penetran peptid TR etkinliğini nakliye kargo derin nedeniyle beyin doku39içine alınır. Ayrıca, bizim yöntem enjeksiyon ve toksik toplamalardan50,51neden olabilir çeşitli peptidler analizlerini sağlar. Bu nedenle, sistemimiz Zebra balığı beyin ve bu tür toksisite hücresel etkilerini analiz içine zehirli proteinlerin el ile enjeksiyon için çok yönlü bir yöntemi sağlar.

Amiloid peptidler hızlı ve bu nedenle, hisse senetleri su-DMF-Asetonitril çözümde tutulmalıdır ve PBS sadece 0,5 önce enjeksiyon s ile karışık toplamak. Çözümde büyük toplamları Eğer enjeksiyon çözüm sadece 10 dakika enjeksiyon önce hazırlanmalıdır. Enjeksiyon verimliliği tutarlı sonuçlar, daha verimli için önemli bir parametredir. İyi ve tutarlı enjeksiyon gerçekleştirmek için bizim önceki Jüpiter kağıt46 başvurun. Hiçbir toplama sonra enjeksiyon görüldüğünde, enjeksiyon yöntemi optimize edilmiş olması gerekir.

Bizim yöntem enjekte edilebilir moleküllerin büyüklüğü açısından sınırlıdır. Biz daha önce plazmidleri veya kısa reaksiyonlar verimli ventrikül hücreleri45tarafından,46, ancak, içine derin beyin dokuları, verimli bir şekilde teslim için büyük moleküllerin (örneğin, antikor, büyük alınabilir gösterdi proteinler) kullanılamaz. Böyle molekülleri ventrikül hücreleri ilk birkaç katmanları birleştirerek münzevi çünkü Ayrıca, lipofilik molekülleri kolayca derin dokulara nüfuz değil.

Ateş fare modelleri nesil zaman alır ve bu modellerin bakım oldukça pahalıdır. Bizim enjeksiyon yöntemi toksik amiloid birikimi ve ateş için hızlı bir modeldir. Ayrıca, Zebra balığı memeli modellerle karşılaştırıldığında üstün bir rejeneratif yeteneğine sahiptir ve ateş kesinlikle hızlı tahlil sistemlerinde yararlanacaktır sonra soruşturma nasıl omurgalı beyin üzerinde odaklanan bir yenilenme yanıt bağlayın Zebra balığı.

Sentezlenmiş peptid ve saflığı kalitesini deney başarısı için önemlidir. Bu kalite için sentezlenmiş peptidler iyice sıvı Kromatografi ve kütle spektroskopisi kullanılarak karakterize edilebilir gerekir. Ayrıca, dairesel dichroism ve toplama çalışmaları açıklanan39 olarak önerilmektedir.

Balık beyin içine enjeksiyon tutarlı toplama ve patolojik sonuç sağlamak için kritik bir adımdır. Arzu edilirse amiloid peptidler toplama ve Temizleme dinamikleri analiz eder boyuna bir çalışma yapılabilir. Bir taşıyıcı peptid birleştiğinde bir amiloid peptid eşit dağıtım ve beyin dokusu içine nüfuz sağlamak için kullanın. Edilişi amiloid peptidler de benzer sonuçlar verir ama farklı39dağıtım ve toplama zaman çizelgesi'dir. Deneyci amiloid peptidler amaç bağlı olarak istenilen sürümünü seçebilirsiniz.

Diğer düzenleme çalışmaları ile birlikte bizim yöntemin kullanılması için büyük bir potansiyel var. Amiloid peptidler CVMI ilaç tedavileri veya enjeksiyon çeşitli moleküller sinerjik etkileri, bir hastalık durumu test etmek için diğer bileşikler ile kombine edilebilir. Sonuçta, bizim hızlı ve yeni modeli kolay laboratuvar ortamında küçük ölçekli ilaç-tarama yaklaşımlar için de kullanılabilir.

Bizim el ile mikroenjeksiyon yöntemi, amiloid peptidler amiloid birikimi taklit etmek için yetişkin Zebra balığı beyne enjekte için verimli bir şekilde kullanılabilir. Beyinde amiloid işlemimiz sitotoksik etkisi ve dolayısıyla bir akut nörodejeneratif durumu görüntüleme reklam patoloji sonuçları temin. Bu yöntem için gelecekteki görünüm nevropatoloji Zebra balığı beyinde ve rejeneratif yanıt bunların çalışmaya akut bir dejeneratif modelinde kullanmak olacaktır. Böyle anlayış yeni tedavi edici stratejiler tasarlamak için önemli bir platform sağlayacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa yoktur

Acknowledgments

Bu eser DZNE ve Helmholtz Derneği (VH-NG-1021), CRTD, tarafından desteklenmiştir TU Dresden (FZ-111, 043_261518) ve DFG (KI1524/6) (C.K.); ve tarafından Leibniz Derneği (SAW-2011-IPF-2) ve BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Biz de Ulrike Hofmann peptid sentez ve Nandini Asokan, Prayag Murawala ve Elly Tanaka için yordamı çekimleri sırasında yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fmoc-protected amino acids IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1030 Activator
Oxyma IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1180 Racemization supressor
N,N-Diisopropylethylamine IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-003 Base
Dimethylformamide IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-004 Solvent
N-Methylmorpholine Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany A12158 Base
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) 157260 ALDRICH Activator
Piperidine MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 822299 Fmoc deprotection reagent
Dichlormethane (DCM) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 106050 Solvent
Formic acid (FA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 100264 Buffer component for HPLC
Trifluoroacetic acid (TFA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 808260 Clevage Mixture reagent
Triisopropylsilane(TIS) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 233781 ALDRICH Clevage Mixture reagent
Acetonitrile (for UPLC/LCMS) Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH 34967-1L Solvent
Acetonitrile (for HPLC) VWR International Ltd, England 83639.320 Solvent
Diethylether VWR International Ltd, England 23811.326 Solvent for peptide precipitation
Dithiotritol (DTT) VWR International Ltd, England 0281-25G Clevage Mixture reagent
TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) S30023 Solid phase for SPPS
Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters Intavis AG (Cologne, Germany) 34.274 Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 11806-50-N Filteration of precipitated peptides
Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe KC78.1 Pre-filteration for HPLC
Peptide Synthesizer Intavis, Cologne, Germany ResPep SL Automated solid-phase peptide synthesizer
Water Alliance HPLC Waters, Milford Massachusetts, USA Waters 2998, Waters e2695 Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)
PolymerX, bead size 10μm, 250x10 mm Phenomenex Ltd. Germany 00G-4328-N0 Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column
Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA LCPAK0001 Water purification system
Filtration Unit Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 16307 Filtration unit for peptide precipitation
UPLC Aquity with UV Detector Waters, Milford Massachusetts, USA M09UPA 664M Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50x2.1 mm Waters, Milford Massachusetts, USA 186002350 Analytical C18 column
ACQUITY TQ Detector Waters, Milford Massachusetts, USA QBB908 Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany 16706, 101542 Lyophilizer with vaccum pump
Paradigm plate reader Beckman Coulter
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) Sigma-Aldrich A5040
Petri dishes Sarstedt 821.472
Phosphate-buffered saline Life Technologies, GIBCO 10010-056
Needle Becton-Dickinson 305178
Dissecting microscope Olympus, Leica, Zeiss Varies with the manufacturer
Dumont Tweezers World Precision Instruments 501985
Gillies Dissecting Forceps World Precision Instruments 501265
Glass injection capillaries World Precision Instruments TWF10
PicoNozzle World Precision Instruments 5430-12
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments SYS-PV820
Ring illuminator; Ring Light Guide Parkland Scientific ILL-RLG
Cryostat Leica CM1950

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
  3. Serpell, L. C. Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
  4. Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer's disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
  5. Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
  6. Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
  7. Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer's disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
  8. McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
  9. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
  10. Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer's disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
  11. Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
  12. Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
  13. Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
  14. Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
  15. Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
  16. Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
  17. Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
  18. Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
  19. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  20. Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
  21. Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer's disease? Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
  22. Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer's disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
  23. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
  24. Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
  25. Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
  26. Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
  27. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).
  28. Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
  29. Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
  30. McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
  31. Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
  32. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
  33. Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
  34. Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
  35. Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
  36. Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
  37. Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
  38. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  39. Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
  40. Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
  41. Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
  42. Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
  43. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  44. Katz, S., et al. A Nuclear Role for miR-9 and Argonaute Proteins in Balancing Quiescent and Activated Neural Stem Cell States. Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
  45. Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073 (2015).
  46. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
  47. Sewald, N., Jakubke, H. Peptides: Chemistry and Biology. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. (2009).
  48. Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chemistry. 22 (25), 8685-8693 (2016).
  49. Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
  50. Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
  51. Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
  52. Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).

Tags

Neuroscience sorunu 128 amiloid β42 Zebra balığı ateş cerebroventricular mikroenjeksiyon Alzheimer hastalığı katı faz peptid sentez
Amiloid β42 toksisite ve ateş yetişkin Zebra balığı beyinde modelleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhattarai, P., Thomas, A. K.,… More

Bhattarai, P., Thomas, A. K., Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Mashkaryan, V., Zhang, Y., Kizil, C. Modeling Amyloid-β42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (128), e56014, doi:10.3791/56014 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter