Summary
本稿では、マウスで人工心肺を実行する方法について説明します。この小説のモデルは臓器の損傷に関与する分子メカニズムの調査を促進します。
Abstract
心臓介入中に長時間心肺がますます不可欠になると手順の最適化のため、長時間体外循環に起因する臓器障害を最小限に抑えるため臨床需要の増加が発生します。このホワイト ペーパーの目的は、マウスで人工心肺の完全に機能と臨床的に関連するモデルを実証することでした。デバイス設計、灌流回路の最適化、および顕微鏡技術について報告する.このモデルは、複数の血の図面の必要性のための生存と互換性がない急性モデルです。マウス (例えばマーカー、ノックアウトのなど) に利用できるツールの範囲のための器官の損傷との関係において人工心肺の影響の分子機構に調査容易になりますこのモデル併存疾患。
Introduction
心肺のバイパス (CPB) のクリニックへの導入、以来それは心臓手術1で重要な役割を果たしてきました。現代の心臓外科で長時間の体外循環時間豊富な大動脈再建と結合された手順を実行することが欠かせません。技術の進歩は、途方もないされていますが、体外循環の使用が関連付けられている術中と術後全身と地方機関損傷2,3。
大動物モデルは生理的過程4,5CPB の役割を調査するために開発されています。ただし、これらのモデルは、合併症、CPB のいくつかの洞察を提供している、彼らは非常に高価と分子ツール (抗体など) は非常に限られます。小動物でコスト効率的な代替物を開発しました。その開発以来複数の研究はラットおよびウサギ5,6,7,8,9で体外循環モデルを最適化するために行われています。これらのモデルは、疾患の病態生理学的プロセスの測定の良い基盤を提供します。しかし、彼らは関連抗体・試薬の不足のため携帯電話や体液の免疫学を調査するためにまだ十分ではありません。これは、研究のこの分野での役割を損ないます。
最近 CPB のマウス ・ モデルを開発しました。さまざまなマウス固有試薬、遺伝子組み換えマウスによるマウス モデルは一般的には生理学的、分子、および免疫学的研究10,11の選択のモデル.したがって、我々 のモデルは臨床的に関連する疾患12,13で利用できる多くのマウス系統があるので、さまざまな合併症に関連して体外循環の研究を促進します。したがって、本稿で、具体的には、マウスで体外循環を実行する方法。酸素と血行動態的パラメーターは、深い呼吸・循環の逮捕後密接に監視されます。
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Protocol
すべての動物実験と動物愛護委員会 (低いザクセン州オフィス プロトコル食の安全と消費者保護のための承認されたドイツ動物保護法 (TierSchG) に準拠して行ったTSA 14/1556)。このモデルに適したマウスの最小限の重量が 25 g.
1 術前準備
注: すべての手続は、きれいな、非無菌条件下でオートクレーブ楽器。
。- 場所 50 60 8 cm 長いプロピレン中空管の並行ファイバー両側 T-アダプターを接続してください。接着剤と中空繊維と T-アダプターの外部のブランチの間のスペースを埋める。
- 許可少なくとも 24 h 硬化する接着剤。標準ミクロトームを使用して T-アダプターから広がっている中空繊維をカットし、シリコン チューブを接続サイトにプルします 。
- (26 G branule) から 27 G の金属針を 2 Fr ポリウレタン カニューレに挿入します。外科ブレードを使用し、マイクロ剪刀、約 0.15 cm 各確保するためカニューレの遠位 3 分の 1 以内の 3 ~ 4 ピンホール最適な静脈を顕微鏡 (8-12 倍の倍率) で元に戻る流量。
- 削除完了時のワイヤ。鈍的切離と構造の撤回に綿棒を使用します。組織の脱水を防ぐために余分な水分を吸収するガーゼ綿棒 (5 × 5 cm 2) を使用します 。
- プライミング ボリュームを準備します。完了すると、30 mL ソリューション 2.5% v v/バッファリング NaHCO 3 の 8.4% 溶液をプライミングあたりヘパリン IU を追加します。4 ° C まで使用でこのソリューションを保存します 。
- を埋める CPB 回路 (すなわち、ポンプ、空気のわな猟師、チューブ、両方カニューレ) 静脈カニューレを介して 850 μ L プライミング溶液で。一度いっぱい、動物穿刺の準備が整うまで、体外循環の循環を維持します 。
2。動物の麻酔
、麻酔を管理する誘導商工会議所 2.5% 未満に動物を配置する- v/イソフルラン/酸素混合物。ペダル逃避反射、尾ピンチ反射、目の瞬目反射を評価することによって、適切な麻酔を確認します。目の乾燥を避けるために獣医の目軟膏を適用します 。
- は、温度調節機能を持つ地球温暖化パッドに動物を配置します。プローブを直腸に挿入し、データ集録システムに接続されている体温を測定します 。
- による麻酔が達成された後は、動物 orotracheally 20 G プラスチック製 braunule を使用して、口頭でそれを挿入してビジュアル制御の下で気管にプッシュを挿管します。マウスの人工呼吸器に接続されているイソフルラン気化器を使用して換気を開始します。動物の重量に応じて 250 350 μ L の一回換気量を達成、換気を調整する。 。 完全無痛を保証するために
- 5 mg/kg の動物体重カルプロフェンを皮下注入します。イソフルラン麻酔濃度を酸素では 1.3 2.5% の間維持することをお勧めします。イソフルラン濃度は、手続の段階に応じて手動で調整すること 。
3。手術
- における麻酔・気管挿管が達成された後シャープ罰金ハサミ首に正中皮膚切開を実行、ぶっきらぼうな方法で筋肉を分離、右の内頚静脈と左頚動脈を公開します。準備中、最小限の失血を確保するためバイポーラ鉗子に接続されている獣医凝固装置を用いた血管を凝固します 。
- 頚静脈血管の準備の後 8-0 絹糸を使用してその分岐する左総頚動脈の遠位のセグメントを縛る頭側 。
- シリコン コネクタ (ID 0.5 mm、1 mm 外径)、場所 8-0 絹糸スリップを使用して動脈流入管に 27 G カニューレの先端節動脈と内頚動脈にカニューレの先端を挿入の近位のセグメントに接続します 。
- カニューレ先端部の適切な配置後、カニューレ先端が事前に、それは 3-4 mm 近位大動脈弓を産みます。8-0 絹の結び目を確保することでカニューレ先端を修正します 。
- による顕微鏡下鉗子、はさみ、鈍とシャープな郭清を実行、胸鎖乳突筋の鎖骨の近くに、横に組織の鈍的準備によって右の内頚静脈を公開、遠位端で 8 0 8-0 絹結び目を配置近位端でループします 。
- 頚静脈の遠位端の血管を結紮後右頚静脈と右心房方向への進行状況に静脈カニューレの先端を置き、絹の結び目を使用してセキュリティで保護します。最適な静脈還流には右心室に入る静脈のヒントを事前に必要がある場合があります 。
- 正しいカニューレの位置を達成すると後で 2.5 頚静脈に直接静脈注射を介して動物の体重の 1 グラムあたりヘパリン IU を追加することによって全身パリン投与群を実行します 。
- リアルタイム侵襲的圧監視、左大腿動脈を cannulate。鼠径部を公開し、25 倍の倍率の下で大腿神経大腿静脈から総大腿動脈でそっと分ける。
- Ligate 大腿動脈の遠位部。一時的にスリップ ノットの近位部分を閉塞し、マイクロ鉗子を用いた前壁に小切開を作る 。
- はその後、大腿動脈に 1 Fr ポリウレタン カニューレを挿入、シルク 10-0 縫合糸で固定します。このカニューレは血液ガス分析血液サンプルを抽出するために使用します 。
- 動脈と静脈カニューレの成功後、ポンプを回して人工心肺を開始。挿管から体外循環の開始までの時間は約 45 分ポンプの速度を増やすことによって全身の圧力測定とは完全に流れ (4-6 mL/分) 2 分以内の増加血流によって、0.5 mL/分の流量を使用して起動します 。
- 完全監視下胸骨から始まって、尾側方向に 5 mm の鋭いはさみを使用して上部胸骨を実行します。出血を避けるためにすぐに胸骨端を凝固します。右頚動脈を頭蓋の方向に引いて大動脈弓を公開します 。
- 最適制御のため無料胸腺とクランプを容易にする周囲の組織から大動脈弓の円周。上行大動脈の周りに 8-0 シルク ループを配置します。心術のクロスのクランプを配置するプルより良い公開する頭蓋方向にシルクのループ上行大動脈 。
4。人工心肺や血液ガス分析
- 血液ガス分析 (BGA)、大腿動脈カテーテル経由で 60-90 μ L 動脈血を収集するガラス毛細管を使用します。
- は、シリコーン チューブに小さなクランプを使用して、カテーテルからチューブを切り離します。キャピラリー チューブの制御充填できるようにクランプのゆっくりと圧力を解放します 。
- では、カテーテルにシリコン チューブを接続し直します。キャピラリー チューブを挿入次の時点で測定用血液ガス分析器:
(BGA1) の換気と体外循環の開始後 10 分
体外循環と呼吸の阻止 (BGA2) 15 分 25 分後
40 分の体外循環、呼吸の阻止 (BGA3) の 30 分後
CPB の 55 分、呼吸器、45 分、心不全 (BGA4) の 20 分後
- 安定した消保院流、コスモスイニシアテ ・換気を停止することによって呼吸停止します 。
- 換気が終了した後地球温暖化パッドを 28 ° C に設定して、冷たい生理食塩水に浸したガーゼを使用して呼吸停止の最初の 20 分以内の 28 ° C の体温に動物を局所的に冷却を開始します 。
- 28 ° C の体温が達成されれば、呼吸停止の 30 分の合計後、心術を開始する体外循環回路に 7.45 %kcl 溶液 0.3 mL を管理します 。
- の大動脈のクランプをクロスより露出するため頭蓋方向に引いて、以前に配置したシルク ループ (ステップ 3.10)、大動脈の上行する部分にマイクロ serrefine クランプを配置します 。
- は、合計 60 分の呼吸停止と心停止の 30 分を実行します。心の再灌流を開始する上行大動脈からマイクロ serrefine クランプを削除します。同時に再換気温かく、動物を 37 ° C
- 再灌流が完了し、動物に常温療法、達した後ポンプをオフにする体外循環を終了して 20 分における生理的な測定 (例えば 体温、心電図、観血的血圧) の監視を継続
- 実験の終わりには、exsanguinate 完全麻酔 (5% イソフルラン) 動物と血と 14 のさらなる分析のための器官を収集します 。
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Representative Results
このプロトコルを記述する灌流回路、外科的処置、およびマウスの CPB 中の生理的パラメーターの監視します。十分に熟練した微小血管によって実行されるとき、一貫性と再現性をもって結果が。
適切な組織灌流を維持するために平均動脈圧は常に体外循環血流を調整し、余分なボリュームを追加することによって 40 と 60 の mmHg の間保持されます。動物、そのボリュームのステータスと体温の重量に応じて 2.3 6.5 mL/分回路へのプライミング溶液 0.1 mL の添加による実験中にボリュームの損失の補正を達成間体外血流は維持されます。CPB 中。全身 pH 安定化は NaHCO28.4 ミリ モル/L を追加することによって実現されます。すべての流体は、空気塞栓のリスクを軽減する空気トラッピング貯留層を介して管理されます。
4 つの異なる時点 (図 1) で BGA を使用した生理学的パラメーターと代表の成功した CPB プロシージャからの測定値は表 1に示した。
ヘマトクリット値測定は、プライミング ボリューム回路 (表 1) の添加による希釈を示します。、しかし、輸血の必要性としてなかった実験 (表 1) のコースの中にヘモグロビンが十分なレベルで維持されました。全身性動脈 pO2、酸素飽和度、pCO2有効期限値はマイクロ人工 (表 1) の優れた機能を検証します。pCO2有効期限は FiO2 0.8 で酸素/空気混合気を用いた最適でした。
BGA は、CPB 中にも動物の代謝の状態に洞察力を提供しました。動脈血 pH の上昇換気 CPB の開始後 (表 1)。呼吸停止が開始されると、この効果が多くの場合軽減されます。実験の過程で pH の漸進的な減少が見られた (表 1)。動脈血 pH および乳酸の連続バッファリング アシドーシスを補正する必要があります。
図 1: 実験的タイムライン。挿管、換気、呼吸の阻止、体外循環、心停止、再灌流、冷却/日時温暖、および BGA サンプリング ポイントのタイミング。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| BGA1 | BGA2 | BGA3 | BGA4 | |
| ヘモグロビン (g/dl) | 8.9 | 6.8 | 6.8 | 5.6 |
| ヘマトクリット値 | 27.5 | 21.2 | 21.3 | 17.7 |
| pO2 (mmHg) | 508 | 506 | 504 | 271 |
| co 2分圧 (mmHg) | 24.5 | 20.3 | 20 | 36.4 |
| sO2 (%) | 100 | 100 | 100 | 100 |
| pH | 7.56 | 7.65 | 7.36 | 7.32 |
| 乳酸 (mmol/L) | 2.6 | 3.1 | 3 | 6.9 |
表 1: マウスで成功した体外循環から代表 BGA 結果。BGA 実験のコースを 4 つの異なる時点で引き継いだ。
図 2: マウスにおける体外循環回路の模式図.静脈カニューレ (青) に配置されますを介して下大静脈右頚静脈および動脈カニューレ、大動脈を介して左頚動脈 (赤)。酸素を含んだ血液は、空気わな猟師貯水池で左頚動脈に注入されます。心電図用電極は皮下配置、直腸、体温を測定し、大腿動脈経由で圧力を監視.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
完全に機能している臨床的に関連するモデル CPB のマウスを開発しました。心血管疾患を持つマウスの以上 30 系統は、私たちモデルは CPB に関連する新しい将来のプロトコルの開発の開始点を使用できます。また、マウス固有試薬およびノックアウト マウスの茄多、ためこのモデルは CPB の現在のラットのモデルを置き換えることはできません、体外循環関連臓器の損傷に関与する分子メカニズムの解剖を容易に。までに、CPB がマウスのカニュレーション法で顕微鏡下の課題としてマイクロ人工の十分に小さいプライミング容積の開発など技術的な課題に適用されていません。約 90 のコース、経験豊富な微小血管の勤勉な仕事が安定したモデルを達成するために必要でした。異なるローラー ポンプ、チューブ、および多様な貯水池を有する CPB マシンの以上 15 プロトタイプおよびテストされたが、常に改善します。以上 10 のバージョンの異なる人工肺は構築され、現在の結果を達成するためにテストします。私たちの新しいモデルは体外循環の既存のラットのモデル設定の完全な再設計を必要です。まず、我々 は最小の可能なマイクロ人工の可能なプライミング ボリュームを構築 < 0.3 mL。つとめては中空繊維とプライミング ボリュームの大幅な削減を可能にする、それらの間にない血が流れる逆システムを使用して再設計されました。
私たちのモデルの開発時にいくつかの技術的な問題が発生しました。私たちの最初のプロトタイプの回路は、6 mL の大きいプライミング ボリュームを必要な。これは 4 g/dL 以下ヘモグロビン値とヘマトクリット値約 15 の極端な血液希釈で起因しました。BGA の良い酸素を示すにもかかわらず、プロシージャの間に急速な心停止につながる低酸素血症の兆候を観察しました。適切な組織酸素化を達成するため、ヘマトクリット値 25 以上する必要があります。チューブ サイズの調整、ローラー ポンプのデザインを変更、小型エアコンのわな猟師を生産最適化によって静脈および動脈カニューレ、プライミング ボリュームは大幅に減少した < 0.9 mL。
十分な灌流にもかかわらず十分な静脈逆流を提供する 4-6 mL/分の流れは不可欠です。右心房、または右心室でさらに静脈カニューレの配置には、この問題が軽減されます。静脈カニューレまたは流体と組織の浮腫の灌関連損失のいずれかの吸引につながる血流を増加させます。新陳代謝が速いが、マウスの CO2の保持を避けるために維持、肺による酸素供給 FiO2 80 %600 mL/min の流量では組織酸素化のため最適であるとわかった。
1 つが発生することができますもう一つの問題は、30-40 分毎繰り返しボリューム置換を施行した間質血管内ボリュームの漸進的な損失です。ヒドロキシエチル澱粉 (HES) を含む電解質溶液の高血管内ボリューム損失を防ぐが、のみを使用する場合、粘度の高いは CPB 中に全身圧力の巨大な増加を引き起こします。これは、肺、動脈カニューレに近位のチューブで漏れに します。したがって、HES 含有溶液の 1:1 混合物と別の等張性バランスのとれた流体があった高と適度な粘度のバランスを達成するために最適なことが判明。
ローラー ポンプの運転のエレクトロニクスは、小径チューブ内の十分な流れをこのように回転速度を増加する変更されました。ローラー ポンプによって生成される強力な吸引の下静脈システムに微細な空気の泡を持っている典型的なです。プライミング ボリューム 0.15 mL 以下と小型空気わな猟師の建設は、この問題を解決します。余分なボリュームの 0.1 mL を追加し、静脈カニューレの正しい配置のチェックに加えて体外循環流を減らす回路における空気栓塞症を排除しました。
新規人工心肺モデルの技術的な実現可能性をテストするため、複数の血液サンプリングが必要です。0.2 mL 以上の血液を削除するは、通常、健康なマウスの致死です。酸素と循環動態の安定性を確保するために実験で血液サンプリング量はこの値をはるかに超えていたし、ほぼ 0.9 mL 実験の終わりに達した。それにもかかわらず、安定した酸素と血行動態的パラメーターは、血液値の定数の減少にもかかわらず観察されました。したがって、我々 の段階のフィージビリティ調査のモデルは主に急性の非生存のプロトコルとして設計されました。少ない採血を必要が必然的に、低侵襲の生存モデルに取り組んでいます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者の謝辞があります。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | priming volume, 1:1 with Tetraspan |
| Tetraspan 6% HES Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | priming volume, 1:1 with Sterofundin |
| Heparin Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2.5 IU per ml of priming solution |
| NaHCO3 8,4% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% in priming solution |
| KCL 7.45 % Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 2418577 | 0.1 mL for cardioplegia |
| Carprofen | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 08859153 | 5 mg/kg/BW |
| 1 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | carotid artery |
| 2 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | jugular vein |
| Vasofix Safety catheter 20G | B.Braun Medical | 4268113S-01 | orotracheal intubation |
| 8-0 Silk suture braided | Ashaway Line & Twine Mfg. Co., USA | 75290 | ligature |
| Isoflurane | Piramal Critical Care Deutschland GmbH | PZN:9714675 | narcosis |
| CLINITUBES blood capillaries | Radiomed GmbH | 51750132 | blood sampling 60 - 95 microliter |
| Spring Scissors - 6mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | instruments |
| Spring Scissors - 2mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | instruments |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | instruments |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | instruments |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | instruments |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | instruments |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | instruments |
| MiniVent Ventilator for Mice (Model 845) | Harvard Apparatus | 73-0044 | mechanical ventilation |
| Isoflurane Vaporizer Drager 19.1 | Drägerwerk AG & Co. KGaA | anesthesia 1.3 - 2.5% | |
| PowerLab data acquisition device 4/35 | ADInstruments Ltd, New Zealand | PL3504 | invasive pressure, ECG, temperature |
| ABL 800 Flex | Radiometer GmbH | blood gas analysis | |
| NMRI mice | Charles River Laboratories | Crl:NMRI(Han) | male, 30 - 35 g, 12 weeks old, housed at least 1 week before the experiment |
References
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